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なおわにべ
5 years ago
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 26 (2012) 156. 神経障害性疼痛における神経栄養因子に関する研究井上玄 Key words: 椎間板性疼痛, 神経成長因子, 後根神経節, 脊髄 * 千葉大学医学部附属病院整形外科緒言椎間板の障害は, 支配神経の障害および軸索の伸長を促し, 後根神経節における炎症性ペプチドの発現を増加させることが報告されており, しばしば治療に難渋する神経障害性疼痛である 1). 神経成長因子 (Nerve growth factor:ngf) を始めとする神経栄養因子は, 疼痛の伝達に関与することが知られており, 抗 NGF 治療は, 米国における変形性関節症を対象とした臨床治験において一定の成果が報告されている. 本研究では,1 椎間板障害が, 椎間板変性内での炎症, 後根神経節細胞における炎症性ペプチドである Calcitonin gene-related peptide (CGRP) の発現に与える影響, ならびに2 椎間板障害に伴う後根神経節細胞での CGRP の発現が, 抗 NGF 抗体の局所投与によりどのような変化を生じるかを検討した方法雄性 SD ラットを使用, 腰椎椎間板を穿刺することにより, 椎間板障害を作製し, 以下の 3 部位にて検討を行った. 1. 椎間板椎間板を摘出し,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 法で,NGF, および炎症性サイトカインの発現を椎間板を穿刺しない対照群と比較した. 2. 後根神経節椎間板を穿刺した際, 逆行性神経トレーサーである Fluoro-Gold (FG) を椎間板辺縁に留置した. 後根神経節細胞において FG でラベルされた, すなわち椎間板支配神経細胞における炎症性ペプチドである CGRP の発現を, 免疫組織化学染色にて比較検討した. 同部位に,3μg の抗 NGF 抗体 (Santa Cruz, Delaware, CA) を注入した実験群と, 同量の生理食塩水を注入した対照群でのペプチド発現を比較した. 3. 脊髄後角椎間板穿刺を行うことで, 脊髄グリア細胞の活性化がいかに起こるかを免疫組織化学染色で比較した. 腰膨大部の凍結切片を作製し, マイクログリアの抗体である Iba-1 と, アストロサイトの抗体である Glial fibrillary acidic protein (GFAP) で脊髄後角の一定面積あたりの陽性細胞数を計測した. 結果 1. 椎間板局所において,NGF ( 図 1),Tumor necrosis factor-α,interleukin-6 の発現は, 穿刺後有意に亢進したが, その後低下した. 対照群との有意差は穿刺後 1 日目より 1 週間まで認めた (p<0.05). * 現所属 : 北里大学医学部整形外科学 1

2 図 1. 椎間板障害による NGF 亢進. 椎間板内の NGF を ELISA で定量した. 穿刺後 1 週までは発現の有意な増加を認めた (*p<0.05). 2. 後根神経節での CGRP の発現は, 穿刺群で穿刺後 1 週から 8 週まで, 持続的に亢進していた ( 穿刺群 :40-60%, 対照群 :38-40%) ( 図 2). 穿刺時に抗 NGF 抗体を投与した群では,CGRP の産生は抑制された (42-46%). 2

3 図 2 後根神経節における CGRP の発現穿刺群で穿刺後 1 週から 8 週まで持続的に亢進していた p<0.05 ３脊髄後角ではマイクログリア (図 3a 穿刺群 b 対照群) アストロサイトともに単位面積あたりで有意な発現の増加を認めた (図 3c). 図 3a マイクログリアの発現穿刺群免疫組織化学染色 3

4 図 3b マイクログリアの発現対照群免疫組織化学染色図 3c 単位面積あたりのグリア細胞数単位面積あたりのグリア細胞数は有意に増加していた p<0.05 4

5 考察椎間板は以前より, 炎症性サイトカインを含有しており, 疼痛を発現する椎間板ではサイトカインの発現が亢進していること 2), 動物モデルでは複数回の穿刺で, 局所の炎症性サイトカインの発現が長期に続くことが報告されている 3). 我々は過去に, 椎間板随核が線維輪外へ脱出すると神経障害とともに軸索の伸長が起こることを報告しており 1), 椎間板性疼痛が単純な炎症性疼痛ではないと考えている. 今回の研究により, 椎間板局所の炎症が沈静化した後も, 後根神経節ならびに脊髄後角の感作は持続しており, 疼痛の慢性化のメカニズムの一つと考えられた. また,NGF のみならず, その受容体である TrkA あるいは p75 の抗体, あるいは脳由来神経栄養因子に対する抗体を投与することで, 後根神経節の炎症性ペプチドの産生を抑制できることが報告されており 4,5), 今後, 神経栄養因子は疼痛治療のターゲットとなりうると考えられる. 現在, 直接椎間板を障害する穿刺モデルのみではなく, より臨床的にヒト椎間板の病態に近いと考えられる, 持続的に軸圧を加え変性を惹起するモデルで検討を進めている. 共同研究者本研究の共同研究者は千葉大学大学院医学研究整形外科学の大鳥精司, カリフォルニア大学サンディエゴ校麻酔科の山内かづ代, 同病理学の山内友規の 3 名である. 本稿を終えるにあたり, 多大なご支援を賜りました上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます. 文献 1) Inoue, G., Ohtori, S., Aoki, Y., Ozawa, T., Doya, H., Saito, T., Ito, T., Akazawa, T., Moriya, H. & Takahashi, K.:Exposure of the nucleus pulposus to the outside of the anulus fibrosus induces nerve injury and regeneration of the afferent fibers innervating the lumbar intervertebral discs in rats. Spine, 31: , ) Burke, J. G., Watson, R. W. G., Conhyea, D., McCormack, D., Dowling, F. E., Walsh, M. G. & Fitzpatrick, J. M.:Human nucleus pulposis can respond to a pro-inflammatory stimulus. Spine, 28: , ) Ulrich, J. A., Liebenberg, E. C., Thuillier, D. U. & Lotz, J. C.:ISSLS prize winner: repeated disc injury causes persistent inflammation. Spine, 32: , ) Orita, S., Eguchi, Y., Kamoda, H., Arai, G., Ishikawa, T., Miyagi, M., Inoue, G., Suzuki, M., Toyone, T., Aoki, Y., Takahashi, K. & Ohtori, S.:Brain-derived neurotrophic factor inhibition at the punctured intervertebral disc downregulates the production of calcitonin gene-related peptide in dorsal root ganglia in rats. Spine, 36: , ) Orita, S., Ohtori, S., Nagata, M., Horii, M., Yamashita, M., Yamauchi, K., Inoue, G., Suzuki, M., Eguchi, Y., Kamoda, H., Arai, G., Ishikawa, T., Miyagi, M., Ochiai, N., Kishida, S., Takaso, M., Aoki, Y. & Takahashi, K.:Inhibiting nerve growth factor or its receptors downregulates calcitonin gene-related peptide expression in rat lumbar dorsal root ganglia innervating injured intervertebral discs. J. Orthop. Res., 28: ,

研究成果報告書

様式 C-19 科学研究費助成事業 ( 科学研究費補助金 ) 研究成果報告書機関番号 :32643 研究種目 : 基盤研究 (C) 研究期間 :2009~2011 課題番号 :21591906 研究課題名 ( 和文 ) 難治性疼痛に対する生体モルヒネ遺伝子導入に関する研究平成 24 年 4 月 9 日現在研究課題名 ( 英文 )Gene transfection with endogenous