Microsoft Word - mp01025_J_18July doc

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そよおおふさ
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1 alamarblue Cell Viability Reagent Catalog nos. DAL1025, DAL1100 Table 1. Contents and storage information. Material Amount Concentration Storage* Stability alamarblue Reagent 25mL (Cat. No. DAL1025) 100mL (Cat. No. DAL1100) 10X, ready-to-use solution 2-8 C Protect from light When stored as directed this kit is stable until the expiration date printed on the product. アッセイの数 : 下記のプロトコルに基づきカタログ番号 DAL1025については25 枚 (2,500アッセイ) のマイクロプレートカタログ番号 DAL1100については100 枚 (10,000アッセイ) に十分な試薬が提供されています励起波長 / 蛍光波長 : / nm モノクロメーター機器を使用する場合 560/590 nmを使用する最大励起 / 蛍光波長は 570/585 nmです吸収極大 :570 nm( さらに参照として600 nmをモニタリング ) イントロダクション細胞の健康状態は多数の方法によってモニターすることができます細胞膜の完全性 DNA 合成 DNA 量酵素活性 ATP の存在および細胞の酸化還元状態は細胞の生存能力および細胞死に関する既知の指標です alamarblue 生細胞試薬は生きている細胞の還元力を利用してヒトや動物細菌植物ならびに菌類といった様々な細胞系の増殖を定量的に測定し細胞の健康指標として様々な化学物質の相対的細胞毒性評価の確立を可能にします細胞が生存している場合そのサイトゾル内は還元環境が維持されていますレサズリン (alamarblue Reagent の有効成分 ) は青色でほとんど蛍光がなくほとんど毒性もない細胞透過性化合物です細胞内に入ったレサズリンは赤色で強い蛍光を発するレゾルフィンに還元されます ( 図 1) 生細胞内ではレサズリンはレゾルフィンに変換され続けその細胞周囲の全体的な蛍光と色が強まります alamarblue 生細胞試薬は 10X の ready-to-use 溶液を培地中の哺乳類または細菌の細胞に添加するだけで細胞の生存率を評価できます ( 図 2) 培地を除いたり最少培地に交換する必要がない場合 alamarblue Reagent は no wash でシングルチューブまたはマイクロタイタープレートフォーマットで使用できますサンプル量の 10% の alamarblue reagent を加えた後 ( すなわち 100 µl サンプルに対して 10 µl の alamarblue reagent を添加 ) 37 で 1-4 時間インキュベートするだけです細胞の健康を損なうことなく感度を上げるにはインキュベーション時間を長くします ( 図 3 およびよくある質問参照 ) その後蛍光をプレートリーダーまたは蛍光分光光度計で蛍光を測定しますもう一つの測定方法としては alamarblue Reagent の吸光度を分光光度計で測定することもできます測定後化合物濃度に対して蛍光強度 ( あるいは吸光度 ) をプロットして結果を分析します Revised: 16-July-2008 MP 01025

2 吸光(-)alamarBlue reagent は 96- ウェルプレートの 1 ウェルあたりわずか 50 個の細胞でも検出できます alamarblue reagent の感度を評価するためにブラッククリアボトム 96 ウェルプレートで HUVEC 細胞の段階希釈を行いました次に細胞へ alamarblue reagent を添加し 40 分後および 18 時間後に蛍光を計測しました 40 分後 alamarblue reagent の蛍光強度は ,000 細胞の範囲で細胞数に比例していました 18 時間後 alamarblue reagent の蛍光強度は 50-5,000 細胞の範囲で細胞数に比例しより高感度な検出につながっていました ( 図 3) 蛍光発光( ) 図 1A. alamarblue はレサズリンからレゾルフィンへの変換によって細胞の生存率および増殖の指標として機能するレサズリン ( 非蛍光性化合物 ) は代謝活性の高い細胞の還元反応を利用して赤色蛍光性のレゾルフィンに変換される産生される蛍光量は生細胞の数に比例している波長 (nm) 図 1B. レゾルフィンの吸光度および蛍光波長スペクトル 37 で 1~4 時間 alamablue reagent 1) 細胞に試薬を加える 2) インキュベートする 3) 蛍光 ( あるいは吸光度 ) を測定 4) データを処理する図 2. alamarblue 細胞生存率アッセイプロトコル細胞および被験化合物を含んでいる 96 ウェルプレートを標準的な方法で調製する alamarblue reagent を直接各ウェルに加え 37 でインキュベートし細胞の代謝活性によりレサズリンをレゾルフィンに変換させその蛍光 ( あるいは吸光度 ) を測定します化合物濃度に対して蛍光 ( あるいは吸光度 ) シグナルをプロットして結果を評価するここでは 96 ウェルプレートでのアッセイについて記載するがこのプロトコルは他のフォーマットにも簡単に適応できる (384 ウェルプレートおよび様々な容量のチューブなど ) チューブを使用する場合サンプルを光学的分析の前にキュベットに移す alamarblue Cell Viability Reagent 2

3 蛍光強光強度A B 度細胞 / ウェル細胞 / ウェル蛍図 3. HUVEC 細胞に対するalamarBlue reagentの直線性および感度 A) alamarblue Reagent 試薬と細胞を40 分インキュベーションした場合 ~500~5 万細胞の範囲において直線性の関係を持つ B) 同じ96 ウェルプレートの細胞をインキュベーションの18 時間後に測定し alamarblue reagentの感度を示す ~450 RFU での水平線は実験中のバックグラウンドの蛍光を示すこれは no cell コントロールの標準偏差の3 倍と計算された. 差し込みグラフは細胞をreagentと18 時間インキュベートした後 50~5000 細胞 / ウェルの範囲で直線性を持つことをであることを示しているエラーバーは ±SEMとして示している alamarblue Reagentの利点 alamarblue アッセイは従来の分光光度的または放射性細胞毒性アッセイよりも次の点で優れています : 短時間 :ready-to-use 添加し測定するだけの形式はサンプル処理ステップを減らします複数のフォーマット : 真核生物または原核生物細胞シングルチューブまたはマイクロタイタープレートアッセイ蛍光または吸光度測定機器を使ってもデータを記録することができますエンドポイントまたはカイネティック測定 : 細胞生存または化合物毒性の分析のためにエンドポイントまたはカイネティックアッセイを行えます便利 :96または384ウェルフォーマットでのハイスループットスクリーニングにも適したready-to-use 溶液として販売してますマルチプレックス化 : 生存指標として核酸を検出するためのCyQUANT NF Cell Proliferation Assay Kit( カタログ #C35006) 等その他のアッセイ方法とのマルチプレックス化に対応しています ( 図 4) 注記 : 使用される細胞タイプに基づいて CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Kit とマルチプレックス化できるかどうかを検討する必要がある場合もあります安価 : インビトロジェンのalamarBlue Reagentは 5Xではなく 10Xとして処方されており競合他社製品の倍のアッセイができます安全 : 非毒性試薬は細胞の代謝および生存 1 のリアルタイムモニタリングを可能にし有害な溶剤を使用せずシンチレーションカクテルおよび放射性廃棄物を処分する必要がありません alamarblue Cell Viability Reagent 3

4 蛍光強蛍光強度光強度A B 度蛍Tamoxifen (Log M) Tamoxifen (Log M) C Tamoxifen (Log M) 図 4. alamarblue Reagent の CyQUANT NF とのマルチプレックス化 A) alamarblue reagent B) CyQUANT NF または C) alamarblue reagent および CyQUANT NF それぞれの試薬を添加する前に HepG2 細胞を Tamoxifen と 24 時間インキュベートした alamarblue Reagent はその他の細胞毒性指標とマルチプレックス化できそれでもなお正確な結果が得られることが IC 50 値から実証されている開始する前にご用意いただくもの適切な培地で培養された哺乳類または細菌細胞適切な96または384ウェルプレートオプション :3% SDS 含有リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 細胞の準備哺乳類細胞 - 接着細胞 : アッセイを始める前に細胞培養フラスコまたはディッシュに哺乳類細胞をプレートし 37 5% CO 2 で約 4-24 時間接着増殖させます哺乳類細胞浮遊細胞 : 細胞培養フラスコまたはディッシュに哺乳類細胞をプレートし細胞を直ちにアッセイに使用するかアッセイを始める前に 37 5% CO 2 で最大 24 時間増殖させます細菌細胞 : 詳細は参考文献 2および3 参照注記 alamarblue Reagent は複数回の凍結 / 融解に対して安定であり凍結させても活性への影響はありませんよくある質問 (6 ページ ) もご参照ください alamarblue Cell Viability Reagent 4

5 一般的なガイドライン alamarblue reagent でアッセイできる細胞タイプは哺乳類細菌 2 ( バイオフィルム含む 3 ) 植物 4 魚類細胞 5 などですまた alamarblue reagent は初代細胞 5 の他 HepG2 などの肝細胞でもテストされています必ず適切なコントロールを実施してください実験誤差を最小にするために実験サンプルと無細胞コントロールサンプルを最低 4-8 回反復した測定値をとることを推奨します各細胞の種類について alamarblue アッセイのプレーティング密度とインキュベーション時間を決定しアッセイが直線性をもつ領域内であるような条件を使用する必要があるかもしれませんインキュベーション時間を長くする ( 一晩 ) 場合試薬添加中およびインキュベーション中の無菌状態を必ず維持し微生物による汚染を避けて下さい汚染微生物も alamarblue Reagent を還元するので汚染された培養物は誤った結果につながりますウシ胎児血清 (FBS) および牛血清アルブミン (BSA) は蛍光を消光させる可能性がありますこれを確認するためコントロールにも同じ血清濃度を用いることを推奨しますフェノールレッドのような他の培地成分はアッセイに影響をあたえません実験プロトコル alamarblue Cell Viability プロトコルオプション :alamarblue cytotoxicityアッセイを行う前に細胞を被験化合物で24-72 時間処理します 1.1 表 2 に示すように培養液に対して 1/10 量の alamarblue Reagent を加えます表 2. アッセイ量フォーマット細胞 + 培地の量添加する 10XalamarBlue の量 Cuvette 1 ml 100 µl 96-well plate 100 µl 10 µl 384-well plate 40 µl 4 µl 1.2 遮光し細胞培養インキュベーターで 37 1~4 時間インキュベートします注記 : より長いインキュベーション時間にすると検出感度が向上します細胞数の少ないサンプルについては最大 24 時間までインキュベーション時間を延ばすことも可能です 1.3 蛍光または吸光度を使って次のように測定します : 蛍光 : nm の励起波長を用い ( 最大励起波長 =570 nm) nm の蛍光を測定する ( 最大蛍光波長 =585 nm) 吸光度 :600 nm をリファレンス波長 (600 nm の値で標準化 ) として使い alamarblue の吸光度を 570 nm でモニターする注記 : 蛍光測定のほうが高い感度が得られます蛍光測定機器が使えない場合 alamarblue Reagentの吸光度で測定しますアッセイプレートまたはチューブはホイルに包み 4 で保管すれば蛍光または吸光度に対する影響がなく1~3 日まで測定することができます alamarblue Cell Viability Reagent 5

6 1.4 オプション : 反応を停止するために 50 µl の 3% SDS を alamarblue reagent 中の細胞 100 µl に直接加えますデータ処理蛍光 2.1 被験化合物の濃度に対して蛍光強度をプロットします 2.2 オプション : 実験ウェルの蛍光値から細胞培養培地のみ ( バックグラウンド ) の平均蛍光値を減じます吸光度 2.3 実験ウェルの 570 nm 吸光度の値から細胞培養培地のみ ( バックグラウンド ) の平均 600 nm 吸光度を減じます 2.4 バックグラウンドを差し引いた 570 nm 吸光度を被験化合物の濃度に対してプロットします他のアッセイ方法との比較 alamarblue reagent は他の細胞生存率および増殖アッセイと比較試験されており同様の薬理データをもたらすことが示されてます ( 図 4 5) FAQ: 一般的な質問 Q:alamarBlue はどのように機能しますか? A: 健康な生細胞のサイトゾル内は還元状態を維持してます細胞のこの還元能力は alamarblue reagent を検出可能な蛍光 ( あるいは吸光性 ) 物質に変換します Q:alamarBlue reagent には毒性がありますか? A: いいえ alamarblue reagent はサンプルとユーザーの両方に対して安全な毒性のない試薬です Q:alamarBlue reagent は溶解する必要がありますか? A: いいえ alamarblue reagent は 10X の ready-to-use 溶液です Q: 浮遊細胞でも alamarblue reagent は使えますか? A: はい alamarblue reagent は接着および浮遊哺乳類細胞に使用可能です Q: 細菌など哺乳類以外の細胞で alamarblue reagent は使えますか? A: はい alamarblue reagent は細菌 2 および植物細胞 4 でも試用できることがわかってます Q:alamarBlue reagentは市販されているものの中では最も高価ではないですがそれは他の試薬ほど機能しないということですか? A: 実際にはalamarBlue reagentは他のより高価な細胞毒性試薬に匹敵することが多いです比較データは図 5を参照してください Q:alamarBlue は吸光または蛍光測定なので発光製品ほど感度はよくないのですか? A:alamarBlue reagentは 96 ウェルプレートの一つのウェルで50 未満の哺乳類細胞を検出するのに十分な感度があります詳細は表 3と図 3を参照してください alamarblue Cell Viability Reagent 6

7 保管に関する質問 Q: もし alamarblue 原液 reagent を一晩室温で放置したらどうなりますか? A: 室温 (~22ºC) で保管した場合 reagent は 12 ヶ月までは安定です Q: うっかり alamarblue 原液 reagent を凍結してしまったがまだ使えますか? A: はい alamarblue Reagent は複数回の凍結 / 融解の繰り返しに対して安定です必ず使用前に reagent を 37 のウォーターバスで加温撹拌し均質な溶液になるようにして下さい Q:alamarBlue reagent を光から保護する必要がありますか? A: はい alamarblue reagent は光にさらされると時間とともに非常にゆっくりと蛍光物質に変換され高いバックグラウンド値につながります遮光して試薬を保管して下さい方法に関する質問 Q:alamarBlue reagent の場合細胞の最適なインキュベーション時間および温度は? A:37 で1-4 時間 alamarblue reagentと細胞をインキュベートさせます少ない細胞で検出感度を上げるにはインキュベーション時間を最大 24 時間に延ばします詳細は図 6 参照してください Q:alamarBlue reagent と細胞を一晩インキュベートさせてもいいですか? A: はいしかし細胞密度の高いサンプルからのシグナルが飽和する可能性もありこれは試薬の直線性がプラトーに達したことを意味しますこうなった場合インキュベーション時間を短縮して下さい Q: 蛍光を読みとるのに適した機器がない場合は? A: 細胞生存率および増殖により alamarblue reagent の吸光度も変化するので 600 nm をリファレンス波長として用いて 570 nm で reagent の吸光度を測定して下さい Q:alamarBlue は完全にエンドポイントアッセイですか? A: いいえ alamarblue は細胞集団のエンドポイントアッセイに使用できますがこの reagent はリアルタイムで細胞の生存と増殖を継続的に測定するのにも使うことができます alamarblue reagent は非毒性なので reagent と細胞をインキュベートさせ同じサンプルで長期的に蛍光 ( あるいは吸光度 ) を観察できますトラブルシューティングに関する質問 Q: 高いバックグラウンド蛍光値の問題点は? A: 露光のため reagentが分解しているかもしれません alamarblue Reagentは必ず暗所で保管し長期間 reagentを直射日光に曝さないようにして下さい Q: なぜ蛍光強度が低いのですか? A:alamarBlue reagent との細胞のインキュベーション時間を延ばし機器の gain 設定を変更し機器のフィルター / 波長設定をチェックして下さいトラブルシューティングのためポジティブコントロール ( 生細胞 ) を必ず用意して下さい Q: 蛍光値が高く機器の線形範囲を超えている場合はどうすればよいですか? A: インキュベーション時間を短縮するかまたは実験に用いる細胞の数を減らしてみて下さい alamarblue Cell Viability Reagent 7

8 蛍光強度発光強度Tamoxifen (LogM) References 1.Invest Ophthalmol Vis Sci 38, 1929 (1997); 2.Infect Immun 65, 3193 (1997); 3.J Antimicrob Chemother 57, 1100 (2006); 4.Phytochem Anal 12, 340 (2001); 5.Anal Biochem 344, 76 (2005). 図 5. alamarblue reagent と CellTiter Glo の比較細胞毒性アッセイを行う前に HUVEC 細胞を Tamoxifen で 24 時間処理したメーカーの使用説明書に従い alamarblue (AB) および CellTiter Glo (CTG) アッセイを行った alamarblue アッセイは CellTiter Glo の何分の 1 かのコストでほぼ同様の結果をもたらした表ウェルプレートにおける alamarblue Reagent の検出限界 Cell Line 検出限界 * 40 分 3 時間一晩 (18 時間 ) HASmC (primary) ~195 <48 <48 HUVEC (primary) ~781 <48 <48 HPAEC (primary) ~390 <48 <48 HEK 293 ~390 ~390 <48 HepG2 ~1563 ~195 <48 SH-SY5Y ~1563 <48 <48 * 単位は細胞数 / ウェル alamarblue Cell Viability Reagent 8

9 蛍光強蛍光強度度細胞 / ウェル細胞 / ウェル蛍光強度細胞 / ウェル図 6. alamarblue Reagent での蛍光シグナル生成に対するインキュベーション時間の影響異なる細胞密度で SH-SY5Y 細胞を 96-Well Plates にプレートした alamarblue Reagent はプレートに加えられ A)3 時間 B)19 時間 C)3 時間と 19 時間 37ºC でインキュベートされウェル N = ±SEM 4 について細胞の少数で働く場合に alamarblue 感度の差が示すために再プロットされた製品リスト ( 価格は弊社ウェブサイトもしくは弊社営業部までお問い合わせください ) Cat. Product Name Unit Size DAL1025 alamarblue cell viability reagent, 10X DAL1100 alamarblue cell viability reagent, 10X ml ml alamarblue Cell Viability Reagent 9

10 Contact Information Molecular Probes, Inc Willow Creek Road Eugene, OR Phone: (541) Fax: (541) Customer Service 6 00 am to 4:30 pm (Pacific Time) Phone: (541) Fax: (541) probesorder@invitrogen.com Toll-Free Ordering for USA Order Phone: (800) Order Fax: (800) Technical Service 8 00 am to 4:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) Toll-Free (800) Fax: (541) probestech@invitrogen com Invitrogen European Headquarters Invitrogen, Ltd. 3 Fountain Drive Inchinnan Business Park Paisley PA4 9RF, UK Phone: +44 (0) Fax: +44 (0) euroinfo@invitrogen.com Technical Services: eurotech@invitrogen.com For country-specific contact information, visit Further information on Molecular Probes products, including product bibliographies, is available from your local distributor or directly from Molecular Probes. Customers in Europe, Africa and the Middle East should contact our office in Paisley, United Kingdom. All others should contact our Technical Service Department in Eugene, Oregon. Molecular Probes products are high-quality reagents and materials intended for research pur pos es only. These products must be used by, or directl y under the super vision of, a tech nically qual i fied individual experienced in handling potentially hazardous chemicals. Please read the Material Safety Data Sheet pro vid ed for each prod uct; other regulatory considerations may apply. Limited Use Label License 223 Labeling and Detection Technology The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity). The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any Commercial Purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) to not transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for Commercial Purposes. Commercial Purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of the above patents based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was used in the manufacture of such product. If the purchaser is not willing to accept the limitations of this limited use statement, Invitrogen is willing to accept return of the product with a full refund. For information on purchasing a license to this product for purposes other than research, contact Molecular Probes, Inc., Business Development, Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, Tel: (541) Fax: (541) Several Molecular Probes products and product applications are covered by U.S. and foreign patents and patents pending. All names con-taining the designation are registered with the U.S. Patent and Trademark Office. Copyright 2008, Molecular Probes, Inc. All rights reserved. This information is subject to change without notice. Manufactured for Invitrogen by TREK Diagnostic Systems. Patent 5,501,959. alamarblue Cell Viability Reagent 10

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Microsoft Word - PrestoBlue_FAQ_J1_27Sep10.doc 1/ 13 ページ PrestoBlue Cell Viability Reagent カタログ番号 A13261 A13262 製品名サイズ濃度保存安定性 PrestoBlue Cell Viability Reagent 25 ml(a13261) 100 ml(a13262) 10 倍 ready-to-use 溶液 2~8 遮光本キットが指示通りに保存されれば製品に記載されている有効期限まで安定です