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1 PrestoBlue 試薬を用いた細胞生存アッセイ性能の向上 Infinite M200 PRO + GCM および Infinite M1000 PRO マルチモードマイクロプレートリーダーを用いた細胞生存率の検出 はじめに 細胞増殖 生存アッセイは学術的研究所やライフサイエンス研究所で広く使用されており 製薬業界で一般的になりつつある in vitro システムを使用する研究所では 細胞ベースアプリケーションの細胞生存マーカー評価を必ず実施している 様々な市販のアッセイシステムにおいて頻繁に使用され 定評のある蛍光染料にレサズリンがある これは 培養細胞に直接添加することができる酸化還元指示薬である 生存細胞はこの染料を 酸化型 ( レサズリン ) の紺青色から 還元型の蛍光赤色 ( レゾルフィン ; λ Ex = 570 nm; λ Em = 590 nm) に変化させる 非生存細胞がレサズリンを還元させる代謝能を急速に失い 蛍光シグナルが検出されなくなることから このシステムは細胞生存率に対して特異的なものである Life Technologies 社は 一般的に入手できるレサズリンベースアッセイである PrestoBlue 細胞生存試薬の改良型を提供する この新たな染料は 一般的なレサズリンベースアッセイ ( 例 : alamarblue ) と同じ分析特性 ( 蛍光励起および蛍光波長 ) を有するが 特性化のための培養時間が大幅に短縮された ( 最低 15 分 vs1 時間 ) ため 試験効率と性能が向上している (1) 本では Infinite( インフィニット ) M200 PRO および Infinite M1000 PRO マルチモードマイクロプレートリーダーを用いた Life Technologies 社の PrestoBlue 細胞生存試薬の評価について記載している 1

2 材料および方法 Quad4 Monochromators -ベースのおよび ガスコントロールモジュール (GCM) 搭載の Infinite M200 PRO マルチモードリーダー (Tecan 社 オーストリア ) Premium Quad4 Monochromators-ベースの Infinite M1000 PRO マルチモードリーダー (Tecan 社 オーストリア ) PrestoBlue 細胞生存試薬 (Life Technologies 社 米国 ) 96 ウェルおよび 384 ウェルフラット黒色マイクロプレート (Greiner Bio-one 社 ドイツ ) ヒト扁平上皮癌細胞 (A431 ATCC # CLR-1555) ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 高グルコース (PAA Laboratories 社 米国 ) 加熱不活性化ウシ胎仔血清 (FCS) (PAA Laboratories 社 米国 ) 高感度緑色蛍光タンパク質 (EGFP) L-グルタミン酸 (PAA Laboratories 社 米国 ) ピルビン酸ナトリウム (PAA Laboratories 社 米国 ) ペニシリン / ストレプトマイシン (PAA Laboratories 社 米国 ) HEPES (PAA Laboratories 社 米国 ) トリプシン /EDTA (PAA Laboratories 社 米国 ) スタウロスポリン (Sigma Aldrich 社 オーストリア ) L-グルタミン酸 ピルビン酸ナトリウム ペニシリン / ストレプトマイシン HEPES および 5% 熱不活性化 FCS を添加した高グルコース DMEM を使用して 37 C CO 2 濃度 5% の湿気のある大気中 (Binder CB インキュベーター ) で ヒト扁平上皮癌細胞 (A431) を集密状態に達するまで培養した 培養時間試験トリプシン /EDTA を使用して細胞を採取し 5% FCS を含む新鮮培地で再懸濁した後 1 ウェルあたり細胞数 3,000 個から 35 個 ( 図 1 参照 ) までの一式の希釈液として黒色 384-ウェル組織培養プレート (100 µl/ ウェル ) 内に播種した 37 C CO 2 濃度 5 % の湿気のある大気中で一晩培養した後 PrestoBlue 試薬 10 µl を試料のウェルに直接添加した 本アッセイは Infinite M200 PRO の温度制御オプションならびに O 2 および CO 2 を同時に制御できる独創的なガス制御モジュール (GCM) を用いて リーダー内において 37 C CO 2 濃度 5% で培養した (2) 図 ウェルプレートのレイアウト 細胞希釈液の一式 灰色で示されたウェルは 100 µl ddh 2 O で満たした ( 示されていないウェル A16-P23 を含む ) 最短培養時間および最適培養時間を同定するため 様々な培養時間で試験した 各培養時間 ( 分 ) の後 上方蛍光モードの蛍光シグナルの測定によって細胞生存率を測定した 全実験 ( 培養および検出 ) はマイクロプレートリーダーの中で実施し 手動操作を必要としなかった Infinite M200 PRO の最適な測定設定を表 1 に示している 最高感度を得るため z- 位置決めとバックグラウンド補正機能 ( 最大シグナル / ブランク比率 ) を用いた この革新的機能によって 培地におけるフェノールレッドから生じるバックグラウンド蛍光を克服しやすくなる (3) 測定パラメータ プレート 振とう ( 測定前 ) モード 励起波長 励起半値幅 蛍光波長 蛍光半値幅 機器設定値 [GRE384fb.pdfx] 20 秒 ;1 mm 振幅 ; 回転 上方蛍光 560 nm 9 nm 600 nm 20 nm ゲイン Optimal( 最適値 ) フラッシュ回数 25 z- 位置計算 f. ウェル B2 ( シグナル ) および J2 ( ブランク ) 測定時間 20 µs 遅滞時間 0 µs 待機時間 ブランク (DMEM のみ ) 0 ms 表 1 Infinite M200 PRO を用いた PrestoBlue アッセイの測定パラメータおよび機器設定値 2

3 各希釈液の平均値を計算し 平均ブランクを減算して補正した ガウスの誤差伝播の法則を用いてそれぞれのエラーバーを計算した 数値は 8 つのウェルから得られた補正後平均値を表す Infinite M1000 PRO の最適な測定設定値を表 2 に示している 最高感度を得るため z- 位置決めと統合バックグラウンド補正機能 ( 最大シグナル / ブランク比率 ) を用いた (4) 下記の方程式を用いて PrestoBlue 細胞生存アッセイの理論的検出限界 (LOD) を計算した : LOD(cells/well)= 3*SD( ブランク )*3,000 ( 試料平均値 -ブランク平均値) 試料平均値については 一式のうち第一の希釈液の結果 (3,000 細胞 / ウェル ) を用いた 細胞毒性試験第 2 の試験では トリプシン /EDTA を用いて細胞を採取し 5% FCS を含む新鮮培地で再懸濁した後 1 ウェルあたり細胞数 12,000 個の密度とした黒色 96-ウェル組織培養プレート (200 µl/ ウェル ) 内に播種した 上澄みを除去し 様々な濃度 ( nm) のスタウロスポリン (STS) を含む 200µl の DMEM を各ウェルにピペットで取って ( 図 2) 37 C CO 2 濃度 5% で培養した 注意 : 本手順のこの段階は 培地交換に Tecan 製 HydroSpeed プレートウォッシャーを用い 化合物の添加に HP D300 デジタルディスペンサーを用いれば 容易に自動化できる ブランク未処理対 (DMEM のみ ) 照物質 ( 生存率 100%) 測定パラメータ プレート 振とう ( 測定前 ) モード 励起波長 励起半値幅 蛍光波長 蛍光半値幅 機器設定値 [GRE96fb.pdfx] 20 秒 ; 1 mm 振幅 ; 回転 上方蛍光 560 nm 10 nm 590 nm 10 nm ゲイン Optimal( 最適値 ) フラッシュ数 10 z- 位置計算 f. ウェル B3 ( シグナルシグナル ) および B3 ( ブランク ) 測定時間 20 µs 遅滞時間 0 µs 待機時間 0 ms 表 2 Infinite M1000 PRO を用いた Presto Blue アッセイの測定パラメータおよび機器設定値 各希釈液の平均値を計算し 平均ブランクを減算して補正した 次にこの数値を未処理の対照試料の平均値と関連付け ガウスの誤差伝播の法則を用いてそれぞれのエラーバーを計算した 数値は 6 つのウェルから得られた補正後平均値を表す 結果および考察 図 2 プレートのレイアウト STS 用量反応 灰色で示されたウェルには 200 µl ddh 2 O を満たした 培養後 20 µl の PrestoBlue 試薬を直接試料ウェルに添加して 細胞を染色した 次にプレートを 37 C CO 2 濃度 5% の湿気のある大気中で 30 分間培養し 上方蛍光モードとした Infinite M1000 PRO で蛍光シグナルを測定して 細胞生存率を測定した 培養時間試験図 3 および表 3 に Infinite M200 PRO + GCM を用いた培養時間試験の結果を示す 3

4 15 分 30 分 40 分 60 分 75 分 RFU( 蛍光量 ) % (00 未処理 ) 細胞数図 3 細胞希釈液一式と Infinite M200 PRO で PrestoBlue アッセイを用いて測定された培養時間の変化 検出限界 (cells/well) 15 分 30 分 45 分 60 分 75 分 表 3 PrestoBlue アッセイにおいて Infinite M200 PRO で測定した 384- ウェルプレートの検出限界 (cell/well で示す ) 図 4 スタウロスポリン用量反応曲線 ; Infinite M1000 PRO で測定した A431 細胞に対する細胞毒性作用 結論 STS( スタウロスポリン ) 濃度 (nm) 15 分培養の後 データは良好な直線性を示しており LOD は 1 ウェルあたり細胞約 80 個である 培養時間が増加するとともに全体のシグナルシグナル強度は上昇するが LOD は 1 ウェルあたり細胞数でいうと顕著には改善しない したがって この新規の生存アッセイの最高感度を得るには 30 分の培養で十分である 細胞毒性試験 30 分という最適培養時間は 細胞毒性試験にとっても十分であることが実証された 図 4 の用量反応曲線は A431 細胞における STS の細胞毒性作用を示している エラーバーが非常に短いことからわかるように 測定の均一性は極めて良好であった これは蛍光ベースアッセイにおける Infinite M1000 PRO の感度の高さによって説明できる 本試験は PrestoBlue 試薬を用いた細胞生存率測定における Infinite M200 PRO および Infinite M1000 PRO マルチモードリーダーの適性を示している アッセイのための培養時間の大幅な短縮 ( 一般的なレサズリンベースアッセイとの比較 ) が明らかに実証され 効率の向上と良好なアッセイ性能が得られた (1) Infinite M200 PRO の培養機能 ( 温度管理および GCM) によって インキュベーターとリーダーの間でマイクロプレートを手動で動かす必要のない自動アッセイ手順が可能である さらに Infinite M1000 PRO は PrestoBlue アッセイの蛍光シグナルの検出に最適であることが示された 本機器の高性能の蛍光光学によって正確なシグナル検出が可能となり 優れたアッセイ均一性が得られる したがって PrestoBlue 細胞生存試薬を Infinite シリーズのマルチモードリーダーとともに使用することで アッセイ開発においてもスクリーニングへの応用においても in vitro 細胞生存分析の強力なソリューションが得られる 4

5 参考文献 Technical Note: Improved fluorescence top measurements; V.1.0, Technical Note: Maximize signal to blank intensity ratios; V.1.0, 略語一覧 DMEM DMSO DPBS FBS GCM HEPES ダルベッコ改変イーグル培地ジメチル スルホキシドダルベッコリン酸緩衝生理食塩水ウシ胎仔血清ガス制御モジュール 2-(4-(2-ヒドロキシエチル )- 1-ピペラジニル ) エタンスルホン酸 このは Tecan ( 本社スイス ) が発行 ( 原文英語 ) し テカンジャパンが日本語翻訳したものです 翻訳文の表現等に疑義が生じた場合は 原文をご参照ください Australia Austria Belgium China Denmark France Germany Italy Japan Netherlands Singapore Spain Sweden Switzerland UK USA Other countries Tecan Group Ltd. では本文書において正確かつ最新の情報をご提供するよう最善の努力を尽くしておりますが 誤謬や脱漏が生じる可能性があります したがって Tecan Group Ltd. では明示的または暗示的にかかわらず 本文書における情報の正確性または完全性につき 何らの表明または保証を行うものではありません また 本文書は予告なく変更する場合があります 記載された商標はすべて法律によって保護されています 本文書に記載された仕様書の技術的詳細および詳しい手順については テカンの担当者までご連絡ください 本文書で取り上げたアプリケーションおよび製品は一部の市場で入手困難な場合がありますので 営業担当者にお問い合わせください すべての記載された商標は法律で保護されています 本文書で記載された商標とデザインは Tecan Group Ltd.( スイス Männedorf) の商標 または登録商標です 完全なリストは trademarks で参照できます リストには含まれませんが ここに記載されている製品名および会社名はそれぞれの所有者の商標である場合があります Tecan および Infinite はスイス Tecan Group の登録商標です Greiner は独 Greiner Bio-One 社の登録商標です PrestoBlue は米国 Life Technologies 社の登録商標です alamarblue は米国 TREK Diagnostic Systems 社の登録商標です 2013, Tecan Trading AG スイス著作権所有 / J V1.0,

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