Microsoft Word - Predictor hERG Fluorescence Polarization Assay_J1_28Oct_2009.doc

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Predictor herg Fluorescence Polarization Assay カタログ番号 PV5365 プロトコルの構成品番号 :PV5365.pps 出荷 : ドライアイス改訂日 :2009 年 10 月 28 日保存 : 各種あり目次 1. キットの内容... 1 2. ご用意いただくもの... 2 3. はじめに... 2 4. 試薬の取り扱い解凍保管... 3 4.

1 Predictor herg Fluorescence Polarization Assay カタログ番号 PV5365 プロトコルの構成品番号 :PV5365.pps 出荷 : ドライアイス改訂日 :2009 年 10 月 28 日保存 : 各種あり目次 1. キットの内容ご用意いただくものはじめに試薬の取り扱い解凍保管 Predictor herg トレーサーレッド Predictor herg FP アッセイ用緩衝液 E Predictor herg 膜アッセイの手順対照装置の初期設定試薬の調製プレートローディングの要約標準化合物および試験化合物の希釈プレートローディングクイックリファレンスガイド蛍光偏光の測定フィルターとミラーの要件一般的プレートリーダーに推奨される設定方法ゲイン設定および Z ポジション G ファクターの較正アッセイ用プレートの読み取り補足資料試薬の添加順序およびインキュベーション時間溶媒耐容性濃度反応曲線参考文献 Limited Use Label Licenses キットの内容 Predictor herg Fluorescence Polarization Assay Kit( カタログ番号 PV5365) は以下に一覧する内容で構成されています本キットには 20 μl のアッセイを 400 回行うのに十分な量の試薬が含まれています強力な herg リガンドである E-4031 がポジティブコントロールとして提供されています構成品組成量保管温度各カタログ番号 Predictor hergトレーサーレッド 100% DMSO 中に 250 nm(250 倍 ) 40 μl -20 C PV5363 Predictor herg 膜 2 倍濃度 hergチャネル E-4031によるロ 5 ml -80 C K1785 ット特異的力価は分析証明書を参照 Predictor herg FP Assay 用緩衝液当社独自の緩衝液 (ph7.5) 20 ml 室温 PV5364 E-4031 H2Oで3 mmに調製済み 80 μl -20 C PV5366

2 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 2/17 ページ 2. ご用意いただくもの以下はキットに含まれておりません赤色スペクトルにおける蛍光偏光の測定能があるプレートリーダー ( 装置の要件については 6 項を参照 ) ピペッターまたはマルチチャネルピペッターに適合する 1~1,000 μl 容量のピペット装置 384 ウェルの Black アッセイプレート未処理のローボリュームポリスチレンプレート ( 例 Corning #3677) またはポリプロピレンプレート ( 例 Matrical #MP101-1-PP) が推奨されます重要 : 非結合表面コーティングで処理されたプレート ( 例 Corning #3676) は使用しないでください Predictor herg トレーサーレッドがプレートのコーティングと結合するためアッセイウィンドウが小さくなりアッセイのばらつきが大きくなります 384 ウェルのポリプロピレンプレート ( 例 Corning #3657) このプレートは試験化合物の連続希釈液を作成するために用いられます化合物の保存および連続希釈に用いる高純度 DMSO Fluka 4167 を推奨します 3. はじめに herg(human ether-a-go-go-related gene: ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子 ) カリウムチャネルが意図せず遮断されると心毒性作用が生じることがあるため安全な低分子治療法を開発するうえでの課題となっています当社の Predictor herg Fluorescence Polarization Assay は試験化合物が herg チャネルを遮断するかどうかを効率的に判定することができますこのアッセイを創薬研究の初期段階で使用すれば多くの候補の中から化合物を同定し選別することができます本アッセイキットにはお客様の目的化合物が herg チャネルに結合するか試験するために必要な試薬がすべて含まれています本アッセイでは herg チャネルタンパク質を含有する膜断片 (Predictor herg 膜 ) と高親和性赤色蛍光 herg チャネルリガンドであるトレーサー (Predictor herg トレーサーレッド ) が蛍光偏光法 (FP) をベースとする均一なフォーマットで用いられます FP の原理は平面偏光により小型の蛍光分子 ( トレーサー ) を励起すると蛍光寿命が続く間その分子が溶液中で高速回転するため放出された光の大部分が偏光解消されるという現象に基づいていますそのトレーサーが大分子に結合している場合そのトレーサーの回転は遅くなり光は高度に偏光したままとなります Predictor herg トレーサーレッドに herg チャネルタンパク質が結合している場合このトレーサーにより高い蛍光偏光が生じます herg チャネルタンパク質に結合する化合物 ( コンペティター ) はトレーサーと置き換わるため蛍光偏光は低下します ( 図 1 を参照 ) ステップ 1:Predictor 膜トレーサー化合物の混合ステップ 2: 検出 Predictor 膜 Predictor トレーサーレッド化合物 ( 非阻害物質 ) 高い蛍光偏光 Predictor 膜 Predictor トレーサーレッド化合物 ( 阻害物質 ) 低い蛍光偏光図 1. herg チャネルタンパク質のトレーサーがコンペティターと置き換わるとトレーサーの蛍光偏光が低下します

3 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 3/17 ページ Predictor アッセイは以下のような特長を備えています均一性 ( 混合して蛍光偏光を読み取るのみ ) 効率性 ( わずか 2 時間でデータが得られる ) 安定性 ( 調製後最長 24 時間読み取り可能 ) 一般的な有機溶媒に耐性 ( 最高 5% の DMSO メタノールエタノール ) 多数の装置プラットフォームについてバリデーション済み 4. 試薬の取り扱い解凍保管重要 : 解凍にウォーターバスを用いないでください! ウォーターバスで広く使用される抗真菌剤および抗藻剤の一部は herg 阻害剤として作用すると考えられアッセイの性能を低下させる可能性やアッセイが完全に失敗する可能性があります 4.1 Predictor herg トレーサーレッド Predictor herg トレーサーレッドは -20 で保存してください室温で解凍し使用前にボルテックスで軽く撹拌しますトレーサーは 6 回まで凍結と融解を繰り返しても安定です 4.2 Predictor herg FP アッセイ用緩衝液 Predictor herg FP アッセイ用緩衝液はお手元に届いた時点で解凍して保存します 4.3 E-4031 E-4031 は -20 で保存してくださいアッセイ前に室温で解凍します E-4031 は 6 回まで凍結と融解を繰り返しても安定です 4.4 Predictor herg 膜 Predictor herg 膜は -80 で保存してください Predictor herg 膜を室温で解凍します ( ウォーターバスは使用しないでください上記の重要の項を参照 ) 小口径ピペットまたはピペットチップ ( 例 P1000 または 5 ml ピペット ) を用いて約 20 回ピペッティングすることにより混合しますこのときバイアル中のすべての内容物を確実に混合しますピペッティングはフィラメント様沈殿 / 沈殿物が消えるまで続けます分散させた Predictor herg 膜は使用まで室温で保存します注 :Predictor herg 膜は 3 回まで凍結と融解を繰り返しても 90% 以上の活性を保ちます必要に応じてピペッティングした均一な膜調製物を少量に分注 ( 例 1.5 ml のプラスチック製バイアルに 1 ml ずつ保存 ) すると活性の低下を防ぐことができます重要 : この膜調製物は解凍する度にピペッティングを行ってくださいこれにより大きな膜粒子による光散乱を避け各ウェルに添加される herg 受容体の量が均一になりますこれを怠るとアッセイのばらつきの尺度である Z 値に悪い影響を及ぼします他の膜調製法についても試験を実施しています詳細な情報をご希望の場合はテクニカルサポートまでご連絡ください 3

4 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 4/17 ページ 5. アッセイの手順 5.1 対照以下の表に各アッセイ用プレートに用いる対照を示しています緩衝液ブランクアッセイブランク遊離トレーサーコントロール遊離トレーサーと G- ファクターを定量する場合にのみ使用発光の生データからバックグラウンド蛍光強度を差し引いて偏光値を算出するために使用装置の G- ファクターを設定することにより偏光値の正規化に使用詳細な情報は 6.3 項を参照ネガティブコントロールトレーサー置き換え率 0% ( 最大偏光値 ) を示すアッセイ曲線の最大値の設定に重要ポジティブコントロール (E-4031) 既知の herg チャネルリガンドによるトレーサー置き換え率 100%( アッセイの最小偏光値 ) を示すアッセイ曲線の最小値の設定に重要データ解析にはアッセイ用プレートごとにポジティブコントロール (E-4031) とネガティブコントロールを設けてアッセイウィンドウの最大値と最小値を明確に設定しておくことを強く推奨しますポジティブコントロールとネガティブコントロールを用いればアッセイ曲線の最大値と最小値を正確に設定できます FP アッセイ曲線を定義するには試験化合物の範囲を IC 50 の上下それぞれ 3 log とする必要があります ( 詳細な情報な場合は補足資料を参照 ) 電気生理学的データとの比較のための特記事項 : パッチクランプ法の対照テール電流振幅は Predictor herg FP アッセイにおけるネガティブコントロール値と類似していますこのため試験化合物の滴定時の化合物濃度が極めて低い場合を除き完全なアッセイウィンドウを正確に決定することができなくなり良好な形状の曲線が得られず IC 50 推定値は不正確になりますネガティブコントロール値と E-4031 のポジティブコントロール値でアッセイウィンドウの最大値と最小値を固定することにより IC 50 推定値の精度が向上しますより完全な考察は項のデータポイント数とデータ解析を参照してください 5.2 装置の初期設定最初に使用するときは本装置で以下の対照を分析して正確な装置設定を行ってから用量反応曲線を作成してください表の容量は 1 ウェルあたりの容量です装置設定では G ファクターを決定し mp シフトを観察し Z 値を算出します (n=8) 緩衝液ブランクアッセイブランク遊離トレーサーコントロールネガティブコントロールポジティブコントロール E μl 緩衝液 20 μl 10 μl 15 μl 5 μl 膜 10 μl 10 μl 10 μl トレーサー 5 μl 5 μl 5 μl 5.3 試薬の調製 1. 試薬を溶かし 4.4 項に記載のとおり約 20 回ピペッティングすることにより Predictor herg 膜と混合します 4 項に示すように解凍にウォーターバスを使用することは推奨されません 2. プレートローディングの前に以下の試薬を調製します容量は 384 ウェルプレートの 4 分の 1 の量を示しています同じ希釈倍率を用いてウェル数に合わせて容量を調節してください試薬を緩衝液に添加します 4 nmトレーサー (4 倍濃縮 ) E-4031 緩衝液 (4 倍濃縮 =120 μm) 2 倍濃縮膜緩衝液 615 μl 緩衝液 480 μl 緩衝液なしトレーサー 10 μl E μl 総容量 =1.25 ml 総容量 625 μl (1:62.5) 総容量 500 μl (1:25)

Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 5/17 ページ 5.4 プレートローディングの要約適切なウェルに以下に示す容量をロードします添加の順序は以下のとおりです a. 緩衝液または化合物 b. 膜 c.

5 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 5/17 ページ 5.4 プレートローディングの要約適切なウェルに以下に示す容量をロードします添加の順序は以下のとおりです a. 緩衝液または化合物 b. 膜 c. トレーサー試験化合物緩衝液ブランクアッセイブランク遊離トレーサーコントロールネガティブコントロールポジティブコントロール標準化合物 ( 例 E-4031) 滴定試験化合物 5 μl E μl 5 μl 緩衝液 20 μl 10 μl 15 μl 5 μl 膜 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl トレーサー 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5.5 標準化合物および試験化合物の希釈初回の実験では標準化合物または試験化合物の 10 段階以上の濃度を評価することを強く推奨します 3 倍希釈により 16 点とするのが理想的です E-4031 は herg チャネルに結合することが知られる化合物で同様の実験では標準化合物として一般に用いられていますこれを以下のプロトコールで一般的標準化合物として用いています注 : 化合物の滴定はデュプリケイト (n=2) 以上で実施することを推奨します注 : 希釈には 384 ウェルポリプロピレンプレート ( 例 Corning #3657) の使用を推奨します 5.6 プレートローディング以下の一覧図は Z ファクターの測定 E-4031( 標準化合物 ) 滴定に用いる 384 ウェルアッセイ用プレートのレイアウト例を示しています本項のプレートローディングステップではこのレイアウトを参照してください注 : アッセイ用プレートについては表面処理を行っていないローボリュームポリスチレンプレート ( 例 Corning #3677) またはポリプロピレンプレート ( 例 Matrical #MP101-1-PP) を推奨します遊離トレーサーポジティブコントロールアッセイブランク緩衝液ブランクネガティブコントロール E-4031 滴定 E-4031 滴定 5

6 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 6/17 ページ重要 : herg アッセイで用いられる多くの化合物およびトレーサーは疎水性がきわめて高くピペットのチップを介して 1 つのウェルから隣のウェルへと容易に化合物がキャリーオーバーしてしまいます膜またはトレーサーを添加する際にチップを交換せずにピペットを用いて添加する場合は化合物濃度が最も低い溶液から作業を開始し濃度が高い溶液へと移行していくことが重要です注 : 最良のアッセイ性能を引き出すために試験化合物膜トレーサーの順に添加していくことを推奨します膜とトレーサーのマスターミックスを用いることもできますがその場合は膜 - トレーサー複合体が形成されるため試験化合物との完全な競合に必要な時間が長くなることが多くアッセイウィンドウが小さくなります膜とトレーサーを別々に添加することにより一貫性の高い結果が得られます注 : 溶媒である DMSO メタノールエタノールは反応量の 5% 以下であれば耐容性は良好です試験化合物のストック液やマスター希釈液を作成する際にこれ以外の溶媒やより高濃度の溶媒を用いる場合ネガティブコントロールとポジティブコントロールの調製には適切な量のアッセイ用緩衝液を添加してください 1. 緩衝液ブランク :Predictor herg FP アッセイ用緩衝液をアッセイ用プレートの A1~F1 ウェルに 1 ウェルあたり 20 μl ずつ分注します 2. アッセイブランク :Predictor herg FP アッセイ用緩衝液をアッセイ用プレートの G1~K1 ウェルに 1 ウェルあたり 10 μl ずつ分注します Predictor herg 膜をアッセイ用プレートの G1~K1 ウェルに 1 ウェルあたり 10 μl ずつ分注します 3. 遊離トレーサーコントロール :Predictor herg FP アッセイ用緩衝液をアッセイ用プレートの L1 ~P1 ウェルに 1 ウェルあたり 15 μl ずつ分注します 4. ネガティブコントロール :Predictor herg FP アッセイ用緩衝液をアッセイ用プレートの A2~H2 ウェルに 1 ウェルあたり 5 μl ずつ分注します Predictor herg 膜をアッセイ用プレートの A2~ H2 ウェルに 1 ウェルあたり 10 μl ずつ分注します 5. ポジティブコントロール : ステップ 2 で調製した E-4031 の 4 倍濃縮ストック液をアッセイ用プレートの I2~P2 ウェルに 1 ウェルあたり 5 μl ずつ分注します Predictor herg 膜をアッセイ用プレートの I2~P2 ウェルに 1 ウェルあたり 10 μl ずつ分注します 6. 初期の装置設定については 5.2 項のステップ 11( トレーサーの添加 ) に進みアッセイと装置の条件を最適化してから化合物の滴定を含む各実験を実施することを強く推奨します装置設定では G ファクターを決定し mp シフトを観察し Z を算出します (n=8) 倍濃度の標準化合物 ( 例 E-4031) および試験化合物の連続希釈系列を作成します (5.5 項標準化合物と試験化合物の希釈を参照 ) この希釈作業には 384 ウェルのポリプロピレンプレート ( 例 Corning #3657) の使用を推奨します例 : 例えば E-4031 の連続希釈系列は 384 ウェル希釈用プレートを用いて測定時の最大濃度の 100 倍濃度からアッセイ用緩衝液で希釈して調製しますこの希釈系列をさらに別の 4 倍希釈用プレートを用いて Predictor herg FP アッセイ用緩衝液で 4 倍濃度になるよう希釈した後 384 ウェルのアッセイ用プレートに移します疎水性の DMSO 溶解性試験化合物にも同様の方法が推奨され 100 倍濃度から 100% DMSO を用いて希釈を始めます 100% DMSO で連続希釈を実施すると希釈系列調製中に溶液から化合物が析出することにより生じる問題が最小限に抑制され IC 50 値が安定します a. アッセイ用緩衝液 ( または試験化合物を DMSO に溶解させた場合は 100% DMSO)20 μl を 384 ウェルプレートの B1~P1 ウェルに添加します b. 3 mm E-4031( または目的の試験化合物のストック液を 100 倍濃度で )30 μl を同じ 384 ウェルプレートの A1 ウェルに添加します c. A1 から B1 に 10 μl を移し上下にピペッティングして数回混合します d. B1 から C1 に 10 μl を移し上下にピペッティングして数回混合します e. このプロセスを P1 まで繰り返します 8. 化合物の希釈系列は以下に従い 4 倍になるよう希釈します

7 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 7/17 ページ a. Predictor herg FP アッセイ用緩衝液を別の 4 倍希釈用プレートの縦列 1 の各ウェルに 48 μl ずつ添加します b. 100 倍希釈用プレートの縦列 1 から阻害物質のマスター希釈系列 2 μl を 4 倍希釈用プレートの縦列 1 に移し上下にピペッティングして十分混合します c. 試験対象の全化合物に同じ操作を繰り返します 9. E-4031 滴定 : 中間 4 倍液 5 μl を 4 倍希釈用プレートの縦列 1 からアッセイ用プレートの縦列 3~4 に移します Predictor herg 膜 10 μl をアッセイ用プレートの縦列 3~4 の全ウェルに添加します 10. 試験化合物 :4 倍中間希釈用プレートの化合物 5 μl をアッセイ用プレートの試験化合物ウェルに移します ( 縦列 5~24 ユーザーが任意に指定 ) 調製した化合物の数だけ同じ操作を繰り返します別の方法として希望の希釈法を用いて試験化合物をプレートに添加することもできます Predictor herg 膜 10 μl を試験化合物の入った全ウェルに添加します 11. トレーサー : ステップ 2 で調製した 4 倍濃縮 Predictor herg トレーサー 5 μl を縦列 1 の L1~P1 のウェルおよびプレート上で使用できる他のすべてのウェルに分注しますこの試薬は緩衝液ブランクまたはアッセイブランク (A1~K1 ウェル ) に指定されているウェルには分注しません 12. アッセイ用プレートに蓋をして試薬を遮光するとともに蒸発を防ぎますこれを蛍光偏光測定前に室温 (20~25 ) で 2 時間以上インキュベートしますアッセイ性能に対するインキュベーション時間の影響についてのガイドラインは補足資料をご覧ください試験化合物の結合が平衡状態に達したかどうかを確認する場合はある一定期間に複数回測定しても構いません 7

8 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 8/17 ページ 5.7 クイックリファレンスガイドステップ 1 試薬を解凍するステップ 2 膜をピペッティングするステップ 3 トレーサー希釈液を調製するステップ 4 E-4031 ポジティブコントロール希釈液を調製するステップ 5 試験化合物および E-4031 の希釈液を調製するステップ 6 アッセイ用緩衝液試験化合物 E-4031 希釈液を移すステップ 7 herg 膜を移すステップ 8 トレーサーを移すステップ 9 アッセイ用プレートを 2 時間以上インキュベートするステップ 10 アッセイの結果を読み取る表 5: 段階的マニュアルによるクイックリファレンスガイド Predictor herg トレーサー E-4031 膜を室温で解凍します Predictor herg 膜を使用前に 20 回程度ピペッティングして混合します 4 倍濃縮トレーサーを調製します 384 ウェルプレートの 4 分の 1 の量を調製するにはアッセイ用緩衝液 615 μl に Predictor herg トレーサーを 10 μl 添加します (1:62.5 希釈 ) ポジティブコントロール用に 4 倍濃縮 (120 μm)e-4031 を調製します 384 ウェルプレートの 4 分の 1 の量を調製するにはアッセイ用緩衝液 480 μl に E-4031 を 20 μl 添加します (1:25 希釈 ) 注 : 装置設定およびアッセイ性能を確認してから E-4031 および試験化合物の滴定曲線を作成することを推奨します緩衝液ブランクアッセイ用緩衝液 20 μl アッセイブランクアッセイ用緩衝液 10 μl herg 膜 10 μl 遊離トレーサーコントロールアッセイ用緩衝液 15 μl 4 倍濃縮トレーサー 5 μl ネガティブコントロールアッセイ用緩衝液 5μL herg 膜 10 μl 4 倍濃縮トレーサー 5 μl ポジティブコントロール 4 倍 E μL(120 μm) herg 膜 10 μl 4 倍濃縮トレーサー 5 μl E-4031 滴定液 4 倍 E-4031 滴定液 5 μl herg 膜 10 μl 4 倍濃縮トレーサー 5 μl 試験化合物 4 倍液 5 μl herg 膜 10 μl 4 倍濃縮トレーサー 5 μl アッセイ用プレートに蓋をして試薬を遮光するとともに蒸発を防ぎますこれを蛍光偏光測定前に室温 (20~25 ) で 2 時間以上インキュベートします ( アッセイ性能に及ぼすインキュベーション時間の影響についてのガイドラインは補足資料をご覧ください ) 5.2 項に記載に従い蛍光偏光を読み取ります

9 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 9/17 ページ 6. 蛍光偏光の測定 6.1 フィルターとミラーの要件アッセイ用緩衝液中の Predictor herg トレーサーレッドの励起および蛍光スペクトルは図 6 に示しますトレーサーは 540 nm での励起ピークおよび 573 nm での蛍光ピークを特徴とします蛍光偏光の測定に一般に用いられている偏光フィルターセットであるテトラメチルローダミンまたは Cy3( レッド ) フルオロフォアは約 530 nm での励起ピークおよび約 590 nm での蛍光ピークで良好に機能しますフィルターは FP フィルターに指定されているフィルターでなければなりません非偏光フィルターは Predictor herg アッセイの読み取りには適しません Tecan Safire2 または Infinite M1000 などの一部のモノクロメーター ( 非フィルターベース ) リーダーをオプションとして組み込むことや FP アッセイを実施するためにアップグレードすることができますお客様のプレートリーダーの Predictor herg アッセイ読み取り性能についてのご質問はインビトロジェンのテクニカルサポートへ御連絡ください図 3. Predictor herg トレーサーレッドの励起および発光スペクトル 6.2 一般的プレートリーダーに推奨される設定方法 Predictor herg 蛍光偏光アッセイは一般に用いられている Tecan(Safire2 Infinite F500 Infinite M1000) PerkinElmer(EnVision ) BMG LABTECH (PHERAstar) BioTek Instruments(Synergy 2 Synergy 4) Molecular Devices(Analyst ) などの広範なプレートリーダーで実施されています各装置に特有の設定ガイドについては当社の装置ウェブポータルをご覧くださいこれらのプレートリーダーに推奨される装置設定法は以下の表をご覧くださいフィルターを用いる装置に必要なダイクロイックミラーは装置の製造業者が推奨および供給するストックミラーですカスタマープロトコールに示すデータはすべて Tecan Safire2 を用いて作成しました 9

10 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 10/17 ページ装置種類 1ウェルあたりフラッシュ数またはリード数励起中心 / 帯域幅 (nm) 蛍光中心 / 帯域幅 (nm) Safire 2 モノクロメーター /20 585/20 Infinite F500 フィルターベース /25 590/20 Infinite M1000 モノクロメーター /5 585/20 EnVision フィルターベース /25 595/60 PHERAstar フィルターベース /20 590/20 Synergy 2/ Synergy 4 フィルターベース /25 590/35 Analyst フィルターベース /25 580/10 表 6. Tecan (Safire2 Infinite F500 Infinite M1000) PerkinElmer (EnVision ) BMG LABTECH (PHERAstar) BioTek Instruments (Synergy 2 Synergy 4) Molecular Devices (Analyst ) より販売されているプレートリーダーの推奨設定値 6.3 ゲイン設定および Z ポジション装置の適切なゲイン設定および Z ポジション ( アッセイ用プレートと装置光学系の間の最適な距離大部分の装置で調整可能 ) はトレーサーが添加されていればどのウェルを用いても決定できますこれを行う場合装置製造業者の推奨に従ってネガティブコントロール用ウェル (A2~H2) を用いることを推奨します 6.4 G ファクターの較正偏光値は装置の G ファクターを設定することにより標準化しますこれを行うには膜の非存在下でトレーサーが入っている遊離トレーサーコントロールのウェル (L1~P1 ウェル ) に 50 mp の値を割り当てます緩衝液ブランク (A1~F1 ウェル ) は G ファクター較正用のブランクまたは標準と定義されます装置の G ファクターはある装置に対し特定のトレーサーとフィルターの組み合わせで決定されると多くの場合その後の測定にも適用されますその装置を点検または移動した場合 G ファクターをもう一度決定してください一般に G ファクターは mp 値を Y 軸に沿って上下させますが IC 50 値の算定には大きな影響を及ぼしません mp 値がマイナスとなったら G ファクターを設定する必要があることを示しています注 :G ファクターを設定したら緩衝液ブランクのウェル (A1~F1 ウェル ) は使用しませんこれ以降プレートを用いた読み取りではアッセイブランク (G1~K1 ウェル ) をブランクとして用い緩衝液ブランクおよび遊離トレーサーウェルをサンプルとして定義し直してくださいトレーサーの入っていないウェルから得られた mp 値は無視してください 6.5 アッセイ用プレートの読み取りゲイン Z ポジション G ファクターを設定した後アッセイ用プレートを再読み取りして目的の mp 値を得ます偏光値を算出する前にアッセイブランク (G1~K1 ウェル ) を用いてバックグラウンドの蛍光強度を差し引く必要があります大部分の装置では付属ソフトウェアにより適切なアッセイ用ウェルをアッセイブランクと指定して算出します注 : 緩衝液ブランク ( アッセイ用緩衝液のみを入れたウェル ) をアッセイブランクの代わりにすることはできません注 : 本アッセイのウェルの溶液は膜を添加すると粘性が高くなるためトレーサーが置き換えられたポジティブコントロールウェルの mp 値は緩衝液に遊離トレーサーを添加したウェルの mp 値よりも大きくなります段階的な装置設定ガイドについてはをご覧になるか当社テクニカルサポートにお問い合わせください本製品の性能規格は縦列 2 の読み取り値から得られたデータに基づきトレーサーを添加および混合後 5 時間後に平均シフトが 120 mp となり Z が 0.5 超となることが求められます

11 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 11/17 ページ 7. 補足資料 7.1 試薬の添加順序およびインキュベーション時間 5 項に概括された手順に沿って試薬を別に添加することにより得られたサンプル平衡化データは以下を参照してください herg チャネルへのトレーサーの結合は通常平衡に達するまでに室温 (20~25 ) で約 4 時間を要しますがより早い時点でもロバストなアッセイウィンドウと Z ファクターが得られますインキュベーション時間は 2 時間以上を推奨します下の表に一覧する Z ファクターおよびアッセイウィンドウ (ΔmP) はネガティブコントロールとポジティブコントロールの 16 ウェルから得られた偏光値を用いて決定しました Z ファクターは Zhang et al. (1999) の手法を用いて算出し本アッセイのロバスト性の指標となっています値は一般に 0.5 を上回ると優れているとみなさればらつきがない理論上理想的なアッセイでは 1 となりますインキュベーション時間が長い場合にみられる IC 50 値の小幅な変化はトレーサー特異的結合部位膜における複雑な平衡関係を示していると考えられますが当社ではそれ以上の検討を行っておりませんワークフローに最適なインキュベーション時間を決定することを推奨します特定の時点に一貫してデータを収集すれば実験間で化合物を比較することができます 7.2 溶媒耐容性インキュベーション E-4031 IC 50 (nm) アッセイウィンドウ Z ファクター時間 ( 時間 ) (Δ mp) 表 7. 異なるインキュベーション時間でのアッセイ性能 Predictor herg Fluorescence Polarization Assay は試験化合物の溶解によく用いられる有機溶媒と互換性があります本アッセイは最終濃度が 5%(v/v) 以下の DMSO メタノールエタノールに耐容性があります ( 図 2 参照 ) 5% 以上ではアッセイウィンドウと Z ファクターに影響を及ぼすことがあります有機溶媒の存在下で IC 50 ΔmP Z ファクターなどのパラメータは認識可能な変化を生じないと考えられますが正確な偏光値 ( アッセイの上限と下限 ) には影響を及ぼす可能性がありますここで検討した溶媒の場合反応量の 10% では偏光値の低下が認められました 11

12 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 12/17 ページメタノールエタノール図 4. 一般に用いられる有機溶媒がアッセイ性能に及ぼす影響 7.3 濃度反応曲線データポイント数およびデータ解析曲線を完全に定義するには半 log 間隔の計 16 点で構成されうち 3 点を曲線の最大値と最小値とした濃度 - 反応曲線を推奨します図 5 の E-4031 完全データ限定なしをご覧くださいまた曲線の最大値と最小値は E-4031 から得られた値に限定することを推奨します例えば弱い herg 阻害物質として機能するアミトリプチリンの場合 16 点の滴定では曲線の最小値が完全に定義されないことに注目してください図 5 に示すとおり曲線の最大値と最小値を E-4031 の値に限定することにより曲線が定義され正確な IC 50 値の測定が可能になります濃度の log 範囲が狭くデータポイントが少ない場合曲線の最大値と最小値を E-4031 の値に限定してもグラフは不完全となります ( 部分的データ図 5) 部分的データでも IC 50 値が影響を受けない場合もあれば顕著に変化する場合もあります ( 図 5 の E-4031 とアミトリプチリンの比較を参照 ) 少数のデータポイントでも 6 log の範囲で分散させ曲線の最大値と最小値を E-4031 の値に限定することにより良好な IC 50 値を決定することができます ( 図 5 の分散的データ ) 曲線フィッティングソフトウェアで曲線の最大値と最小値をポジティブコントロールである E-4031 の mp 値と等しくなるように限定します

13 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 13/17 ページ限定なし最大値と最小値を限定分散的データ部分的データ完全データ図 5. データポイント数を変えて異なる桁数 (log 数 ) の試験化合物濃度で得られた濃度 - 反応曲線のグラフ滴定範囲を 6 桁とし半 log 間隔で 16 点を設けるのが理想的で曲線の最大値と最小値は E-4031 から得られた高 mp 値と低 mp 値に限定することを推奨しますは E-4031 を示しはアミトリプチリンを示します 13

14 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 14/17 ページ E-4031 IC 50 (nm) 滴定限定なし最大値と最小値を限定完全部分的分散的アミトリプチリンの IC 50 (nm) 滴定限定なし最大値と最小値を限定完全部分的分散的表 8: 図 5 に示す実験から得られた各限定条件における IC 50 値の要約データの補正 FP 実験では高濃度の試験化合物由来の析出物により光散乱が発生することがあります光散乱は高度に偏光しています用量反応曲線においてトレーサーに置き換わる化合物の mp 値は始めは通常どおりに低下しますが化合物濃度が高濃度になると再び上昇します ( 図 6 参照 ) アステミゾール ( 図 7 参照 ) など特定の化合物では高濃度 (>1 μm) になると観察されるトレーサーの偏光値が非 herg 特異的に低下するため E-4031 の最高濃度における値よりも低くなりますその mp 値は遊離トレーサーコントロールの値に近づきます herg チャネルタンパク質を持たない膜でも mp 値が同様に低下するためこうした mp 値の低下は非 herg 特異的作用です析出物が光散乱と偏光値の非 herg 特異的上昇を引き起こす場合も化合物が偏光値の非 herg 特異的低下を引き起こす場合も以下の 2 種類の方法のいずれかにより補正することが可能です補正方法 A 1 番目の偏光値補正方法は用量 - 反応曲線の最大値と最小値をポジティブコントロールウェルの偏光値に当てはめて固定する方法です当社では曲線の最大値と最小値の両方を E-4031 から得られた mp 値に固定することを推奨していますので非 herg 作用を示す化合物の影響は既に補正されていることになります図 6: 500 nm 付近から始まる非 herg 特異的作用を示すアステミゾールの濃度反応曲線未補正曲線と方法 A による補正済み曲線をプロットしています

Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 15/17 ページ補正方法 B 2 番目の補正方法は 1 つの試験化合物に対して 2 つの用量 - 反応曲線を設定する方法です 1 つは飽和させた対照阻害物質 ( 例 30 μm E-4031) の存在下でもう 1 つは対照阻害物質の非存在下で曲線を得ますこれを行うには

15 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 15/17 ページ補正方法 B 2 番目の補正方法は 1 つの試験化合物に対して 2 つの用量 - 反応曲線を設定する方法です 1 つは飽和させた対照阻害物質 ( 例 30 μm E-4031) の存在下でもう 1 つは対照阻害物質の非存在下で曲線を得ますこれを行うには試験化合物に添加する前に取った 2 倍濃縮膜の一部に 60 μm E-4031 を添加しますこの E-4031 濃度では阻害物質が飽和量となりますがトレーサーの偏光には追加的な非 herg 特異的作用を及ぼしませんこれにより試験化合物による偏光の非特異的低下をすべて観察することができますこの補正は放射性リガンド結合アッセイで行われるような非特異的結合を差し引く方法に類似しています本法に関する詳細は Piper, DR, et al. の報告を参照するか当社のテクニカルサポート部にご連絡ください図 7: 非 herg 特異的作用を示すアステミゾールの濃度反応曲線 500 nm 付近から非特異的作用が認められます未補正曲線と方法 B による補正済み曲線をプロットしています図 8: 高濃度での析出による非 herg 特異的作用を示すピモジドの濃度反応曲線 500 nm 近辺から非特異的作用が認められます未補正曲線と方法 B による補正済み曲線をプロットしています 15

16 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 16/17 ページ 8. References Piper, D.R., Duff, S.R., Eliason, H.C., Frazee, W.J., Frey, E.A., Fuerstenau-Sharp, M., Jachec, C., Marks, B.D., Pollok, B.A., Shekhani, M.S., Thompson, D.V., Whitney, P., Vogel, K.W., and Hess, S.D. (2008) Development of the Predictor herg fluorescence polarization assay using a membrane protein enrichment approach. Assay Drug Dev Technol. 6(2): Zhang, J.H., Chung, T.D., and Oldenburg, K.R. (1999) A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4:

17 Invitrogen Predictor herg Fluorescence Polarization Assay 17/17 ページ 9. Limited Use Label Licenses Limited Use Label License No: 5 Invitrogen Technology The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity). The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any Commercial Purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) not to transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for Commercial Purposes. Commercial Purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. For products that are subject to multiple limited use label licenses, the most restrictive terms apply. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of patents owned or controlled by Invitrogen Corporation which cover this product based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was used in the manufacture of such product. If the purchaser is not willing to accept the limitations of this limited use statement, Invitrogen is willing to accept return of the product with a full refund. For information on purchasing a license to this product for purposes other than research, contact Licensing Department, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California Phone (760) Fax (760) outlicensing@invitrogen.com. 2009, Life Technologies Corporation. All rights reserved. Reproduction forbidden without permission. 17

基質溶液 ( 脂質成分を含む製品では本手順はデータの精度に大きく影響します本手順の記載は特に厳守ください ) 添付の基質溶液は希釈不要です融解し室温に戻した後使用直前に十分に懸濁してください (5 分間の超音波処理を推奨いたします ) 解凍後の基質溶液の残りは繰り返しの凍結融解を避けるため

基質溶液 ( 脂質成分を含む製品では本手順はデータの精度に大きく影響します本手順の記載は特に厳守ください ) 添付の基質溶液は希釈不要です融解し室温に戻した後使用直前に十分に懸濁してください (5 分間の超音波処理を推奨いたします ) 解凍後の基質溶液の残りは繰り返しの凍結融解を避けるため QS S Assist KINASE _ADP-Glo TM Kit 測定法の概要本アッセイ系は KINASE による基質へのリン酸転移反応を ATP の消費を指標に Luminescent ADP Detection Assay (ADP-Glo TM ) 法で検出するものです本キットにはリン酸化反応に必要なアッセイバッファー酵素希釈バッファー酵素基質および検出試薬に添加する MgCl