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あやかしまむね
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1 Click-iT EdU Imaging Kits 表 1. 製品内容および保管情報材料 C10337 C10338 C10339 C10340 濃度保管 * EdU (Component A) 5 mg 5 mg 5 mg 5 mg NA Alexa Fluor azide (Component B) 1 vial (Alexa Fluor 488) 1 vial (Alexa Fluor 555) 1 vial (Alexa Fluor 594) 1 vial (Alexa Fluor 647) NA Dimethylsulfoxide (DMSO, Component C) 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml NA Click-iT EdU reaction buffer (Component D) 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml CuSO 4 (Component E) 1 vial 1 vial 1 vial 1 vial 10X solution Containing Trisbuffered saline 100 mm aqueous solution 2-6 乾燥させる遮光凍結させない Click-iT EdU buffer additive (Component F) 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg NA Hoechst (Component G) 35 μl 35 μl 35 μl 35 μl 10 mg/ml in water * 受領したときにキット全体を保管する際は上記の保管条件が適切です各構成品の最適な保管条件についてはそれぞれのバイアルのラベルを参照して下さい適切な保管条件で保管すればこのキットは 1 年間安定です NA = 適用せずアッセイの数 : 以下のプロトコルに基づき 50 枚のカバースリップを染色するのに十分な材料が提供されています最大励起波長 / 蛍光波長 : Alexa Fluor 488 azide:495 nm/519 nm;alexa Fluor 555 azide:555 nm/565 nm;alexa Fluor 594 azide:590 nm/615 nm;alexa Fluor 647 azide:650 nm/670 nm;hoechst 33342:350 nm/461 nm (DNA 結合時 ) 序論細胞が増殖する能力を測定することは細胞の健康の評価遺伝毒性の判定および抗がん剤の評価のための基本的な方法ですこれを行う最も正確な方法は直接的に DNA の合成を測定することです当初これは放射性ヌクレオシド 3 H- チミジンの取込みで測定されていましたその後この方法に代わりヌクレオシド類似体ブロモデオキシウリジン (BrdU) の抗体ベースの検出が用いられてきましたインビトロジェン Click it EdU Assay は BrdU assay の新しい提案ですキットに付属する EdU (5- エチニル -2'- デオキシウリジン ) はチミジンのヌクレオシド類似体であり活発な DNA 合成の間に DNA に取り込まれます 1 検出はクリック反応 ( アジドとアルキンの間の銅触媒共有結合の反応 ) を用います 2-5 このアプリケーションでは EdU にアルキンが含まれ Alexa Fluor 色素にアジドが含まれています Revised: 13-October-2009 MP 10338

2 Click-iT EdU 標識は至ってシンプルですサイズの小さいアジド化蛍光色素はマイルドな条件下での取込み EdU の効率的な検出を可能にします標準的なアルデヒドベースの固定処理および界面活性剤による浸透処理は Click-iT detection reagent が DNA にアクセスするのに十分ですこれは抗 -BrdU 抗体で検出できるように BrdU を曝露するために ( 通常 HCl 熱または DNase による消化を用いた )DNA の変性が必要な BrdU assay と対照的です ( 図 1) BrdU プロトコールにおける変性ステップは核酸の対比染色に影響するような二本鎖 DNA の完全性を失わせるだけでなく細胞の形態および抗原認識部位を破壊することがありました対照的に EdU assay キットは使用が容易なだけでなく細胞周期分析用の色素などの DNA の染色にも完全に適応しますまたこの EdU assay キットは抗体を使った細胞表面および細胞内マーカーの検出と組み合わせてマルチプレックス化することも可能です ( 詳細は表 2 参照 ) 最後に ( 非特異的結合を示すことのある抗体に依存する )BrdU assay とは違って Click-iT EdU assay はバイオオルソゴナルな ( 生物学的にユニークである ) 部分を利用するため低バックグラウンドおよび高検出感度をもたらしますキットには接着細胞をサンプルとして細胞周期解析と取込み EdU の標識検出に必要なコンポーネントがすべて含まれています ( 図 2) 細胞周期解析についてはキットには青色蛍光の Hoechst 色素がついていますキットには 1 回のテストで 500 μl 反応液を使って mm のカバーグラスを 50 枚標識するのに十分な試薬が含まれています Click-iT EdU についての最新の情報についてはをご覧ください抗 -BrdU 抗体 Click-iT Alexa Fluor azide アクセス可能変性なしでアクセスできない X 取込み EdU 取込み BrdU O Br O N NH O N NH O 図 1. Alexa Fluor azide による取込み EdU の検出 vs. 抗 -BrdU 抗体による組込み BrdU 検出 Alexa Fluor azide のサイズが小さいので EdU 検出試薬をヌクレオチドにアクセスさせるために DNA を変性させる必要がなくなります Click-iT EdU Imaging Kits 2

3 表 2. Click-iT detection reagent の互換性分子互換性 * Qdot nanocrystals Click-iT 検出反応後に Qdot ナノクリスタルをお使い下さい緑色蛍光蛋白質 (GFP) のような蛍光蛋白質 Alexa Fluor 色素 fluorescein (FITC) のような有機色素 TC-FlAsH or TC-ReAsH reagents Phalloidin 蛋白質の発現検出に TC-FlAsH や TC-ReAsH reagent などの有機色素ベースの試薬あるいは Click-iT 検出反応の前に抗 -GFP ウサギ抗体またはニワトリ抗体をお使い下さい Click-iT 検出反応と完全な互換性があります Click-iT 検出反応の前に FlAsH または ReAsH reagent でテトラシステイン (TC) タグを検出しますファロイジン染色は Click-iT 検出反応に対応していない細胞骨格の可視化には他のタンパク質に対しては抗 -α- チューブリン抗体などの抗体をお使い下さい Horseradish peroxidase (HRP) Click-iT 検出反応後に HRP を使用して下さい R-phycoerythrin (R-PE) および Alexa Fluor 680-R-PE のような R-PE タンデム Click-iT 検出反応の後に R-PE および R-PE タンデムを使用して下さいアロフィコシアニン (APC) および APC- タンデム Click-iT 検出反応と完全な互換性があります * 互換性は蛍光分子それ自体または検出方法に Click-iT 検出反応に使用される銅触媒存在下で不安定である成分が関与するかどうかを示します細胞を播種オプション : サンプル処理 EdU および他の生細胞染色試薬と細胞をインキュベート細胞の固定と膜透過処理 EdU 検出オプション : 抗体および他の固定細胞染色 ( 細胞周期または核染色 ) を用いて細胞を処理するイメージング解析図 2. Click-iT EdU Imaging Assay 用のワークフローダイアグラム Click-iT EdU Imaging Kits 3

4 開始する前に必要であるが添付されていない材料リン酸緩衝生理食塩水 (PBS, ph ) 固定剤 (ex. 3.7% ホルムアルデヒド in PBS) 膜透過試薬 (ex. 0.5% Triton X-100 in PBS) 3% Bovine serum albumin (BSA) in PBS (3% BSA in PBS), ph 7.4 脱イオン水 mmカバースリップオプション :6-wellマイクロプレート注意 Hoechst 33342(Component G) は変異原性を有する事が明らかです適切な予防措置をとって色素を使用してくださいこのキットで溶媒として提供されているDMSO(Component C) は組織への有機分子の侵入を容易にすることが知られています DMSOが含まれる試薬はそのような材料が引き起こす危険に対して適切な器具や手順で取り扱ってください各地域の規則を遵守して試薬を廃棄してください Stock Solution を調製する 1.1 バイアルは開封前に室温に温めます mlのdmso(component C) または水溶液 ( 緩衝液や生理食塩水 ) をEdU(Component A) に添加しよく混合してEdUの10 mm 溶液を調製します使用後残ったStock Solutionは-20 C 以下で保存しますこの保存条件で Stock Solutionは最大 1 年間安定です 1.3 DMSO(Component C) 70 μlをalexa Fluor azide (Component B) に添加してよく混ぜ Alexa Fluor azide のworking solutionを調製します使用後残ったworking solutionは-20 C 以下で保存しますこの保存条件でworking solutionは最大 1 年間安定です 1.4 EdU reaction buffer (Component D) のボトル中の溶液すべて (4 ml) を36 mlの脱イオン水に加え1x Click-iT EdU reaction bufferのworking solutionを調製します Component D のボトルを少量の1X Click-iT EdU reaction bufferで洗浄し 10X 濃縮物が全て移されているようにします少量の1X Click-iT EdU reaction bufferを作るには適当な量のComponent Dを脱イオン水で1:10に希釈します使用後残った1X 溶液は2-6 Cで保存しますこの保存条件で 1X 溶液は6カ月間安定です 1.5 Click-iT buffer additive (Component F) の10X stock solutionを作るにはバイアルに2 mlの脱イオン水を入れて完全に溶解するまで混ぜます使用後残った10X Stock Solutionは -20 Cで保存しますこの保存条件で 10X Stock Solutionは最大 1 年間安定です溶液が茶色になった場合は劣化してますので廃棄して下さい Click-iT EdU Imaging Kits 4

5 実験プロトコル EdU による標識細胞以下のプロトコルは 10µM を最適な EdU 濃度として A549 HeLa NIH/3T3 細胞で開発されましたがどのような接着細胞系にも適応できます培地細胞密度細胞の種類および他の要因が標識に影響することがあります最初の実験では使用する細胞タイプおよび実験条件にとって最適な濃度を見つけるために様々な EdU 濃度でテストすることを推奨しますキットには標準的な用量反応に十分な材料が付いていますが追加の EdU( カタログ番号 A10044 E10187) も提供しています現在細胞増殖に BrdU ベースのアッセイを用いているのであれば BrdU と同濃度の EdU 濃度がテストの出発点となります 2.1 目的の密度でカバーグラス上に細胞を播種し処理する前に一晩培養します mm EdU(Component A) stock solution を完全培地に加え 2X EdU working solutionを調製します推奨のEdUの開始濃度は10 μmです 2.3 あらかじめ 2X EdU working solution を温め次に細胞が入った培地へ等量の 2X EdU working solution を加え 1X EdU solution をとします ( 例最終濃度 10 μm の場合は培地の半分を 20 μm EdU を含む新しい培地で置換します ) 細胞増殖の速度に影響することがあるので培地すべてを交換することはお勧めできません 2.4 細胞タイプに最適な条件で目的の時間細胞をインキュベートします細胞がEdUに曝露されている間に起こっているDNA 合成を検出するのでタイミングや時間は細胞増殖速度に依存します EdUの短時間暴露による細胞のパルス標識は細胞周期の動態の観察を可能にします 2.5 すぐに細胞の固定および膜透過処理 ( ステップ ) に進んだ後 EdU 検出 ( ステップ ) を行います細胞の固定および膜透過処理注記 : このプロトコルは3.7% ホルムアルデヒド in PBSを使用した固定ステップとそれに続く0.5% Triton X-100 膜透過ステップで最適化されていますがメタノールやサポニンなどの固定 / 膜透過試薬にも対応していますカバーグラスを各ウェルに1つのカバースリップが入るように処理に便利な6ウェルプレートに移します 3.1 インキュベーションの後培地を除去しカバーグラスの入った各ウェルに3.7% ホルムアルデヒド in PBS 1 mlを加えます室温で15 分間インキュベートします 3.2 固定剤を除去し各ウェルの細胞を 3% BSA in PBS 1 ml で二回洗浄します 3.3 洗浄液を除去します各ウェルに0.5%Triton X-100 PBS 1 mlを添加し室温で20 分間インキュベートします Click-iT EdU Imaging Kits 5

6 EdU 検出メモ : このプロトコルはカバースリップ 1 枚につき 500 µl の Click-iT reaction cocktail を使いますが後の反応容量も同じ割合で維持されるのであれば 500 µl より少量でも可能です X buffer additive ( ステップ1.5で調製 ) を脱イオン水で1:10に希釈して1X Click-iT EdU stock solutionを調製します ( 表 3 参照 ) この溶液は使用する毎に新しく調製し調製した日に使います 4.2 表 3に従ってClick-iT reaction cocktailを調製します表に記載されている順で成分を加えるのが非常に重要ですこの順序でなければ反応は最適に進行しません注記 :Click-iT reaction cocktailは調製してから15 分以内に使用すること表 3. Click-iT reaction cocktail 反応成分 * 1X Click-iT reaction buffer ( ステップ 1.4 で調整 ) カバーグラスの数 μl 860 μl 1.8 ml 2.S2 ml 4.3 ml 10.7 ml 21.4 ml CuSO 4 (Component H) 20 μl 40 μl 80 μl 100 μl 200 μl 500 μl 1 ml Alexa Fluor azide ( ステップ1.3で調整 ) 1.2 μl 2.5 μl 5 μl 6 μl 12.5 μl 31 μl 62 μl Reaction buffer additive ( ステップ4.1で調整 ) 50 μl 100 μl 200 μl 250 μl 500 μl 1.25 ml 2.5 ml 総量 500 μl 1 ml 2 ml 2.5 ml 5 ml 12.5 ml 25 ml * 注 : 表に記載されている順番で材料を加えます 4.3 膜透過緩衝液 ( ステップ3.3) を取り除き各ウェルの細胞を3% BSA in PBS 1 mlで二回洗浄します洗浄液を除去します 4.4 カバーグラスの入った各ウェルにClick-iT reaction cocktail 0.5 mlを加えます reaction cocktailがカバーグラスの上に均等に広がるようにプレートを短時間揺すります 4.5 遮光し室温で30 分間プレートをインキュベートします 4.6 reaction cocktailを取り除き各ウェルを3% BSA in PBS 1 mlで一回洗浄します洗浄液を除去します核染色を行う場合は核酸の染色に進みます追加染色を行わない場合はイメージングおよび分析に進んで下さい 4.7 オプション : この時点で一次抗体および二次抗体の各メーカーの推奨に従ってサンプルの抗体標識を行いますインキュベーション中はサンプルの遮光が重要です DNA 染色 mlのpbsで各ウェルを洗浄します洗浄液を除去します 5.2 Hoechst (Component G) 溶液をPBSで1:2000に希釈し 1X Hoechst 溶液を調製します ( 最終濃度 5 μg/ml) 注記 :Hoechst の最適濃度は2~10 μg/mlです 5.3 各ウェルに1X Hoechst 溶液 1 mlを加えます遮光し室温で30 分間インキュベートします Hoechst 溶液を除去します mlのpbsで各ウェルを2 回洗浄します洗浄液を除去します Click-iT EdU Imaging Kits 6

7 イメージングと分析 Click-iT EdU 細胞はウェットマウントや市販のマウンティング培地などあらゆるスライド調製方法と互換性があります Alexa Fluor 色素および DNA と結合した Hoechst 色素のおおよその最大励起波長 / 最大蛍光波長については表 4 を参照表 4. 最大励起波長 / 蛍光波長蛍光色素励起 (nm) 発光 (nm) Alexa Fluor Alexa Fluor Alexa Fluor Alexa Fluor Hoechst (DNA 結合時 ) References 1. Proc Natl Acad Sci USA 105, 2415 (2008); 2. ChemBioChem 4, 1147 (2003); 3. J Am Chem Soc 125, 3192 (2003); 4. Angew Chem Int Ed Engl 41, 2596 (2002); 5. Angew Chem Int Ed Engl 40, 2004 (2001). 製品リスト現在の価格はウェブサイトあるいはカスタマーサポートへお問い合わせ下さい Cat No. Product Name Unit Size C10337 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit *for 50 coverslips* kit C10338 Click-iT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit *for 50 coverslips* kit C10339 Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit *for 50 coverslips* kit C10340 Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit *for 50 coverslips* kit Related Products C10289 Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay kit C10327 Click-iT RNA Alexa Fluor 488 HCS Assay *2-plate size* kit C10328 Click-iT RNA Alexa Fluor 594 HCS Assay *2-plate size* kit C10329 Click-iT RNA Alexa Fluor 488 Imaging Kit *for 25 coverslips* kit C10330 Click-iT RNA Alexa Fluor 594 Imaging Kit *for 25 coverslips* kit C10350 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay *2-plate size* kit C10351 Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay *10-plate size* kit C10352 Click-iT EdU Alexa Fluor 555 HCS Assay *2-plate size* kit C10353 Click-iT EdU Alexa Fluor 555 HCS Assay *10-plate size* kit C10354 Click-iT EdU Alexa Fluor 594 HCS Assay *2-plate size* kit C10355 Click-iT EdU Alexa Fluor 594 HCS Assay *10-plate size* kit C10356 Click-iT EdU Alexa Fluor 647 HCS Assay *2-plate size* kit C10357 Click-iT EdU Alexa Fluor 647 HCS Assay *10-plate size* kit A10044 EdU (5-ethynyl-2 -deoxyuridine) mg E10187 EdU (5-ethynyl-2 -deoxyuridine) mg H3570 Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate *10 mg/ml solution in water* ml Click-iT EdU Imaging Kits 7

8 Contact Information Molecular Probes, Inc Willow Creek Road Eugene, OR Phone: (541) Fax: (541) Further information on Molecular Probes products, including product bibliographies, is available from your local distributor or directly from Molecular Probes. Customers in Europe, Africa and the Middle East should contact our office in Paisley, United Kingdom. All others should contact our Technical Service Department in Eugene, Oregon. Customer Service: 6:00 am to 4:30 pm (Pacific Time) Phone: (541) Fax: (541) Toll-Free Ordering for USA: Order Phone: (800) Order Fax: (800) Technical Service: 8:00 am to 4:00 pm (Pacific Time) Phone: (541) Toll-Free (800) Fax: (541) Invitrogen European Headquarters Invitrogen, Ltd. 3 Fountain Drive Inchinnan Business Park Paisley PA4 9RF, UK Phone: +44 (0) Fax: +44 (0) euroinfo@invitrogen.com Technical Services: eurotech@invitrogen.com For country-specific contact information, visit Molecular Probes products are high-quality reagents and materials intended for research purposes only. These products must be used by, or directly under the supervision of, a technically qualified individual experienced in handling potentially hazardous chemicals. Please read the Material Safety Data Sheet provided for each product; other regulatory considerations may apply. Limited Use Label License No. 223: Labeling and Detection Technology The manufacture, use, sale or import of this product may be subject to one or more patents or pending applications owned or licensed by Invitrogen Corporation. The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity) in a manner consistent with the accompanying product literature. The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any Commercial Purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) to not transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for Commercial Purposes. Commercial Purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. For products that are subject to multiple limited use label licenses, the most restrictive terms apply. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of patents that are owned or controlled by Invitrogen Corporation and/or Molecular Probes, Inc. which cover this product based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was used in the manufacture of such product. If the purchaser is not willing to accept the limitations of this limited use statement, Invitrogen is willing to accept return of the product with a full refund. For information on purchasing a license to this product for purposes other than research, contact Molecular Probes, Inc., Business Development, Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, Tel: (541) Fax: (541) Several Molecular Probes products and product applications are covered by U.S. and foreign patents and patents pending. All names con-taining the designation are registered with the U.S. Patent and Trademark Office. Copyright 2009, Molecular Probes, Inc. All rights reserved. This information is subject to change without notice. Click-iT EdU Imaging Kits 8

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Microsoft Word - mp20181_pdf_J_rev01-December doc Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit 表 1. 内容および保管情報 Material Amount Storage* Stability Alexa Fluor 488 reactive dye (Component A) 5 vials Sodium bicarbonate (Component B) ~84 mg Purification