熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repositor Title マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による PPARα PPARγ 活性化機序およびその意義 Author(s) 竹田, 佳代 Citation Issue date Type

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1 熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repositor Title マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による PPARα PPARγ 活性化機序およびその意義 Author(s) 竹田, 佳代 Citation Issue date Type URL Thesis or Dissertation Right

2 学位論文 Doctor s Thesis マクロファージにおける酸化低比重リポ蛋白質による PPARα PPARγ 活性化機序およびその意義 (Impact and mechanism of Ox-LDL-induced PPARα and PPARγ activation in macrophages) 竹田佳代 Kayo Taketa 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻代謝内科学 指導教員 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻代謝内科学 荒木栄一教授 2008 年 3 月

3 学位論文 Doctoti s Thesis マクロファージにおける酸化低比重リボ蛋白質による PPARα PPARγ 活性化機序およびその意義 Impact and mechanism of Ox-LDL-induced PPARct and PPARLy activation in macrophages 著者名 竹田 佳代 kayo Taketa 指導教員名 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻代謝内科学荒木栄一教授 審査委員名 病態生化学担当教授 氏名 山縣和也 分子遺伝学担当教授 氏名 臨池雄一 循環器病態学担当教授 氏名 小川久雄 心臓血管外科学担当教授 氏名 川筋道雄 2008 年 3 月

4 目次一 1. 要旨..._._ ,._1 2. 発表論文リスト..._... 一......_._....._:......_.._..._.4 3. 謝辞..._... 一亀一._ 亀 q.. 噂 9 の...Q... 亀 _ 一 一 _..Gbb 亀..._.,D 一 _..b 亀 _. _._ 一一.5 4, 略語一覧 _......_._... 一..._......_... 一.._ 研究の背景と目的..._...,..._..._, _9 5 一 (1) 粥状動脈硬化の進展過程.._. 一一 _...._,_..._..._ 一.._.._..._..._...g 5 一 (2) 粥状動脈硬化病変形成における酸化 LDL の役割.._ 一 (3)Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)...,13 (1)PPAR サブタイプ......_ (ll)ppars の構造... 一一.._ 一... 一 _... 一一.._. 一.._..._...._14 ( 皿 )PPARs の機 i 能 _.._......_.._... 一._...._.._ 一 (4)PPARα と動脈硬化症._..._......t..._._._..._ 一 (5)PPARγ と動脈硬化症... 一......_..._..._ 一一... 一 _..._.._ 一 (6) 酸化 LDL による PPAR.α PPARγ 活性化作用..._... 一一 一......_ 一 (7) 本研究の目的 一一 _..._..._... 一......_..._19 6. 材料と実験方法 _._ 一一 _..._..._.._..._....._..._.21 6 一 (1) リポタンパクの精製..._..._... 一一.._...,..._ 一 (2) 酸化 LDL の調整..._ _......_21 6 一 (3) 糸田 A 包....._... 齢 一 t 一 (4) 実験動物 _... 一.._ 一一...,..._... _ 23 6 一 (5) 組織免疫染色....._._..... _..._.._..._..._._23 6 一 (6)PPARα PPARγ 活性 (fu11-length PPAR assay) の検討 _...,..._

5 6 一 (7)PPARα PPARγ リガンド結合活性 (PPAR ligand-binding assay) の検討..._ 一 (8)Enzyme-linked immunosorbent assay(e:liza) による PPARs 転写活性測定 一 (9)NF-id3 活性測定....._......_.._._._. 一..._..._25 6 一 (10)short interfering RNA(siRNA) の導入 _..._.._ _.26 6 一 (11)RT-PCR 法による COX-2 ABCA1 MCP-l mr:na 発現の検討.._t 一 _._26 (A)RNA の抽出..._......,. 26 (B)real-time RT-PCR 法による COX-2 ABCA1 MCP-l mrna 発現量の定量... 一..._27 6 一 (12) ウェスタンプロット法による蛋白質リン酸化および蛋白質発現の検討...28 (A) 蛋白精製 (B) ウェスタンプロット法 _._ 一 (13) アデノウイルスベクターを用いた優性ネガティブ変異体の強制発現 一 (14)Enzyme lmmunoassay(eia) による 15d-PGJ2 PGE2 PGD2 測定 一 (15) ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸組成の検討..._._ 一 (16) 統計学的解析..._..._._......_ 一一..._..,... 一.. 一 実験結果... 一一... 一..._...,... 一...,_..._._..._._ 一一. 一一一 一 (1) マクロファージにおける酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化の検討....._32 7 一 (2) マクロファージにおける酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化に対する COX-2 の検討..._..._._.35 7 一 (3) 酸化 LDL の COX-2 発現増加に対する ERK1/2 の関与の検討....._..._37 7 一 (4) マクロファージにおける酸化 LDL による細胞内脂質 15d-PGJ2 検討..._.39 7 一 (5)ApoE ノックアウトマウスの動脈硬化病変における COX-2 15d-PGJ2 発現と PPARoc PPARγ 活性化の検討..._._..43

6 7 一 (6) マクロファージにおける PPARα PPARγ 阻害による 酸化 LDL による ABCA-1 mrna 発現の検討 _......,..._,.45 7 一 (7) マクロファージにおける酸化 LDL による MCP-1 mrna 発現における PPAR 活性化の検討.. _ 考察.._..._.._ 一._... 一 結語..._... 一..._......_._.._..._.6._...._.._.._ 参考文献 _ 一..._.... 一... 一一 _..._._ 一 一

7 1. 要旨 動脈硬化症の惹起分子の一つである酸化低比重リボ蛋白質 (oxidised low density lipo protein; 酸化 LD:L) が 抗動脈硬化作用を有する peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) 一 α(pparα) や PPARy を活性化することが報告されている しかしその詳細な機序 臨床的意義については不明な点が残されている 本研究ではマクロファージにおける酸化 LDL の PPARα PPARγ 活 1 生化の機序とその意義について検討した 酸化 LDL はマクロファージにおいて濃度依存性に PPARα PPARγ 活 1 生化を誘導したが LDL ではその効果は認められなかった また 酸化 LDL は cyclooxygenase-2(cox-2) の mrna 蛋白の発現をともに増加させ COX-2 の発現を阻害すると 酸化 :LDL による PPARα PPA:Rγ 活 1 生化は有意に抑制された さらに 酸化 LDL は extracellular-signal regulated kinase 1/2(ERK l/2) p38 mitogen-activated protein kinase(p38mapk) のリン酸化を誘導し ERK 1/2 の阻害剤では酸化 LDLによるCOX-2の発現とそれに引き続くPPA:Rα PPARγ 活 1 生化は抑制されたが p38mapkの阻害剤では抑制されなかった 酸化 LDLは細胞内の長鎖脂肪酸 ( アラキドン酸 リノレイン酸 オレイン酸 ドコサヘキサエン酸 ) を減少させるが ERK 1/2の活性化に起因するCOX-2の発現増加と それに 引き続く 15-deoxy 一 i2 i4-prostaglandin J2(15d-PGJ2) の発 i 現増加を誘導した この PPARγ の直接的な ligand として知られている 15d-PGJ2 は PPARγ だけではなく PPARα も活性化 した さらに ApoE ノックアウトマウスの動脈硬化病変において COX-2 15d-PGJ2 発現の上 昇や PPARα PPARγ の活性上昇が認められた 次にこの酸化 LDL による COX-2 発現を介した PPARα PPARγ の活性化の動脈硬化発症 進展に対する意義を検討した 興味深いことに PPARα PPARγ を特異的に阻害すると ATP-binding cassette transporter A 1(ABCA1) の rnr:na 発現が有意に抑制され 血中単球の 1

8 走化因子である monocyte chemotactic protein 1(MCP-1) の mrna 発現は増強した これらのことから 酸化 LDL にて刺激を受けたマクロファージでは ERK1/2-COX-2 シグ ナルを介して PPARα PPARγ が活性化され その結果 MCP-1 発現などの動脈硬化惹起分 子の抑制と ABCA1 などの動脈硬化抑制分子の産生により 動脈硬化惹起性の過剰応答を 抑制している可能性が示唆された 2

9 Summary It has been reported that o)ddized low-density lipoprotein(ox-ldl)can activate both peroxisome proliferator-aetivated receptor (PPAR) 一 ct (PPARct) and PPARy. However, the detailed mechanisms of Ox-LDL-induced PPARa and PPARy activation are not fully understood. ln the present study, we investigated the effect of Ox-LDL on PPARct and PPARy activation in macrophages. Ox-LDL, but not LDL, induced PPARct and PPARy activation in a dose-dependent manner. Ox-LDL transiently induced cyclooxygenase-2 (COX-2) mrna and protein expression, and COX-2 specific inhibition by NS-398 or meloxicam or sirna of COX-2 suppressed Ox-LDL-induced PPARor and PPARy activation. Ox-LDL induced phosphorylation of ER[K l/2 and p38 MAPK, and ERK I/2 specific inhibition abrogated Ox-LDL-induced COX 一 2 expression and PPARa and PPARy activation, whereas p38 MAPK specific inhib ition had no effect. Ox-LDL decreased the amounts of intracellular long-chain fatty acids, such as arachidonic, linoleic, oleic and docosahexaenoic acids. On the other hand. Ox-LDL increased intracellular 15-deoxy-Ai2 i4-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) level through ERK I/2-dependent overexpression of COX-2. Moreover, 15d-PGJ2 induced both PPARct and PPARy activation. Furthermore, COX-2 and 15d-PGJ2 expression, and PPARs activity were increased in atherosclerotic lesion of apoe-deficient mice. Finally;we investigated the involvement of PPARαand PPA:Rγon Ox-LD レ induced mrna expression of ATP-binding cassette transporter Al (ABCAI) and monocyte chemoattractant protein-1(mcp-1). lnterestingly, specific inhibition of PPARor and PPARy suppressed Ox-LD レ induced ABCAl mrna expression, and enhanced Ox LDL-induced MCP-l mrna expression. In conclusion, Ox-LDL-induced increase in 15d-PGJ2 level through ERKI/2-dependent COX-2 expression is one of the mechani sms ofpparct and PPARy activation in macrophages. These effects of Ox-LDL may control excess atherosclerotic progression. 3

10 2. 発表論文リスト 1 Kayo Taketa, Takeshi Matsumuq Miyuki Yano, Norio lshii, Takafumi Senokuchi, Hiroyuki Motoshima, Yusuke Murata, Shokei Kim-Mitsuyama, Teruo Kawada, Hiroyuki ltabe, Motohiro Takeya, Takeshi Nishikawa, Kaku Tsuruzoe, and Eiichi Araki. Ox-LDL activates PPARct and PPARy through MAPK-dependent COX-2 expression in macrophages. Biol Chem. 283(15): , Miyuki Yano, Takeshi Matsumura, Takafumi Senokuchi, Norio lshii, Yusuke Murata, Kayo Taketa, Hiroyuki Motoshima, Tetsuya Taguchi, Kazuhiro Sonoda, Daisuke Kukidome, Yoh Takuwa, Teruo Kawada, Michael Brownlee, Takeshi Nishikawa, and Eiichi Araki. Statins activate peroxisome proliferator-activated receptor-y through extracellular signal-regulated kinase 1/2 and p38 mitogen-activated protein kinaserdependent cyclooxygenase-2 expression in Mmacrophages. Circ Res. 100: , Yusuke Murata, Kaku Tsuruzoe, Junj i Kawashima, Noboru Furukawa, Tatsuya Kondo, Hiroyuki Motoshima, Motoyuki lgata, Kayo Taketa, Kazunari Sasaki, Hideki, Kishikawa, C. Ronald Kahn, Tetsushi Toyonaga, and Eiichi Araki. IRS-1 transgenic mice show ingreased epididymal fat mass and insulin resistance. Bioehem Biophys Res Commun. 364: , Noboru Furukawa, Nobuhiro Miyamura, Kenro nishida, Hiroyuki Motoshima, Kayo Taketa, Eiichi Araki. Possible relevance of alpha lipoic acid contained in a health supplement in case of insulin autoimmune syndrome. Diabetes Res Clinic P},act. 75: , Tatsuya Kondo, Saori Tomita,Hironori Adachi, Hiroyuki Motosima, Kayo Taketa, Akiko Matsuyoshi, Hiroshi Tokunaga, Nobuhiro Miyamura, and Eiichi Araki. A case of hyperinsulinemia of undetermined origin, successfully treated with long-acting octreotide. Endocr J. 52: ,

11 3. 謝辞 本研究は熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座で 荒木栄 一教授による御指導の下に行いました 研究について多面にわたり御指導を頂き 深く感 謝致します 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座助教水流丁丁博士 には 論文作成及び日頃の研究の中で貴重な御指導 御助言を頂きました 本研究の施行にあたり 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学 講座医員松村剛博士 本島寛之博士に実験の細部に至るまでの御指導 御助言を頂きまし た さらに熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座技官一ノ瀬 賢司氏にも 御助言を頂きました 最後に 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻内科治療学講座研究室の皆 様には日頃から御助言 御協力を頂きました 皆様に心より感謝致します 5

12 4. 略語一覧 M arachidonic acid M-1, activator protein-1 ApoE, apolipoprotein E ABCAI, ATP-binding cassette transporter Al cdna, complementary deoxyribonucleic acid CIEBPB, CCAATIenhancer-binding protein-b COX, cycloxygenase DBD, DNA binding domain DMSO, dimethyl sulfoxide DN, dominant negative DR, direct receptor 15d-PGJ2, 15-deoxy-Ai2 i4-prostaglandin J2 EDTA, ethylenediaminatetraacetic acid ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay ERK I/2, extracellular-signal regulated kinase 1/2 FCS. fetal calf serum GM-CSF, granulocyte/macrophage colony-stimulating factor 田 )]L,h 量 gh-density lipoprotein HDL-C, HDL cholesterol HEPES, N-2-hydroxyethylpiperazine-N 一 2-ethanesulfonic acid HODE, hydroxyoctadecadienoic acid ICAM-1. intracellular adhesion molecule-1 6

13 lll., interleukin inos, inducible nitric oxide synthase LBD, ligand binding domain LDL, low density lipoprotein LPL, lipoprotein lipase LPS, lipopolysaccharide LXRct, liver X activated receptor alpha MAPK, mitogen-activated protein kinase M 一 CSF, macrophage colony-stimulating factor MCP-1, monocyte chemotactic protein 1 Mm-Ox-LDL, macrophage-mediated oxidized low density lipoprotein m-ox-ldl, mildly oxidized low density lipoprotein NF-1 く B nuclear factor 1 く B Ox-LDL, oxidized low-density lipoprotein PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1 PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis PB S, phosphate-buffered saline PDGF, platelet derived growth factor PGD2, prostaglandin D2 PGE2, prostaglandin E2 PMA, phorbol myristate acetate PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor PPRE, peroxisome proliferators response element RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction 7

14 RXR, retinoid X receptor SDS, sodium dodecyl sulfate SR. scavenger receptor SREBP, sterol regulatory element-binding protein TBARS. thiobarbituric acid-reactive substabces TC, total cholesterol TG, triglyceride TNF. tumor necrosis factor ) TZDs. thiazolidinediones UCP I, uncoupling proteins 1 VCAM-1. vascular cell adhesion molecule-1 VSMCs. vascular smooth muscle cells WT, wild type 8

15 5. 研究の背景と目的 本章では本研究の背景と目的について述べる 先ず 5 一 (1) では粥状動脈硬化の形成及び進展過程を 5 一 (2) では粥状動脈硬化病変進行過程における酸化 LDLの役割について歴史的背景もふまえ述べる 5 一 (3) ではPPARに関する知見を述べ 特に5 一 (4) ではPPARα と動脈硬化症との関連を 5 一 (5) ではPPARγと動脈硬化症との関連を 述べる また5 一 (6) では酸化 LDLによるPPARα PPARγの活性化についての既存の報告について述べる 以上 5 一 (1)~(6) をふまえて5 一 (7) では本研究の目的について述べる 5 一 (1) 粥状動脈硬化の進展過程 初期の粥状動脈硬化は 動脈内皮表面にごく小さな斑点状の脂肪沈着として認められる 脂肪線条 (fatty streak) と呼ばれる病変である 脂肪線条は主としてコレステロ v 一 一ルエステ ルを多量に蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集籏であることが明らかにされている (Rosenfeld et al 1990, Spagnoli et al,1991) 病変の進行に従い 脂肪線条は線維性硬斑 (fibrous plaque) に移行する 線維性硬斑は肉眼的には血管内腔に突出する硬性の隆起病変として認められるが 組織細胞学的には平滑筋細胞 マクロファージ Tリンパ球の浸潤及びそれらの細胞壊死像ならびに脂肪蓄積を結合組織が被覆した状態である さらに病変が進むと結合組織がより増加し : 石灰化や血栓の付着を伴う複合病変へと進展する この様な粥状動脈硬化病変の発症 進展の機序については R.ossの提唱した傷害反応仮説 (Response to lnjury Hypothesis) がある (Ross.1999) この仮説は まず何らかの刺激 ( 紫 外線 酸化ストレス 一酸化窒素 高血糖 高血圧 喫煙等 ) により内皮細胞に障害が生じ それに対する反応として液性因子を介した応答が細胞間で繰り返され 結果として病変が進行するとしたものである 当初 血管内皮細胞に接着した血小板に重点がおかれて 9

16 いたが 現在単球及びリンパ球の関与を中心に考えられている 現時点では 以下のよう な過程を経て粥状動脈硬化症は発症 進展していくと考えられている ( 図 1) (1) 何らかの刺激による内皮細胞の血管恒常性維持機構の破綻と接着分子の発現 (2) 単球 T リンパ球の内皮細胞への接着及び内皮細胞下への侵入 (3) リボ蛋白の内皮細胞下への浸潤及び酸化修飾などによる動脈硬化惹起性リボ蛋白への 変化 (4) 単球から分化 成熟したマクロファージの動脈硬化惹起性リボ蛋白による泡沫化 (5) 泡沫細胞からの様々なサイトカイン放出 (6) 中膜平滑筋細胞の内膜への遊走 内膜での増殖 及び泡沫化 (7) 血管構成細胞による細胞間基質の産生と蓄積 LD 殴容体 native LDL 血管内腔 単磁鯉 / 儲分子 o 函マ _ 姦 酸化修飾 スカ塞蓉謀ヤー酸化 LDL 内膜國畢 1 鋸錘 iiiiiil 1 血管内皮細胞 中膜脂肪滴図 1: 動脈血管壁における泡沫細胞の形成機構血中単球は 血管内皮細胞表面の接着分子を介し内細胞の間隙を抜けて内皮下へ侵入し分化 成熟してマクロファージになる このときLDL 受容体の消失とマクロファージスカベンジャー受容体の発現が認められる また血中 LDLも血管内皮細胞下へ移行すると内皮細胞などから産生されるフリーラジカルの作用により酸化的な修飾を受け 酸化 L 肌へと変化する マクロファージは スカベンジャー受容体を介して酸化 LDLを取り込みコレステロールエステルを多量に蓄積した泡沫細胞へ変化し 動脈硬化初期病変が形成される 5 一 (2) 粥状動脈硬化病変形成における酸化 LDL の役割 動脈硬化初期病変である脂肪線条 (fatty streak) の組織学的特徴は 細胞内に大量のコレ ステロールエステルを蓄積したマクロファージ由来泡沫細胞の集籏を認めることである 10

17 多くの疫学的研究により 血中 low-density lipoprotein(ldl) コレステロール高値と狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患の発症頻度が強い相関を示すことは明らかとなってきたが LDL 高値がいかなる機序で粥状動脈硬化の発症 進展に関与するかは 長い間不明であった 家族性高コレステロール血症はLD:L 受容体の遺伝的欠損であるが それにも関わらず動脈壁にはコレステロールエステルを大量に蓄積したマクロファージ由来の泡沫細胞が認められることから マクロファージはLDL 受容体を介さない経路でコレステロールを取り込み 泡沫細胞となると考えられた 実際 静脈血から得られたLDLを単球 / マクロファージに接触させるだけでは泡沫化は生じない そこで GoldsteinらはLDLが生体内で何らかの修飾を受けることにより化学修飾 LD: しとなり マクロファージに認識され取り込まれるという仮説をたて マクロファージを泡沫化させるリボ蛋白質 ( 動脈硬化惹起性リボ蛋白質 ) の検索を行った 以前よりマクロファージは陰性荷電を持つ粒子に対する高親和性結合部位の存在が考えられていた LDLを無水酢酸と反応させてリジン残基のε 一アミノ基にアセチル基を選択的に導入したアセチルLDLは陰 1 生荷電が増加することが判明し またエンドサイトーシス型の受容体を介して迅速かつ活発に取り込まれ マクロファージの泡沫化を来すことが発見された (Goldstein et al.1979) 現在そのアセチルLDLに対するマ クロファージの膜受容体はマクロファージスカベンジャ 一 受容体と呼ばれ 細胞内コレス テロールレベルによる発現調節を受けず活発にアセチル LDL を取り込むという特徴を有す る この受容体は 1990 年に Kodarna らにより構造が決定されている (Kodama et al.1990) この他にも現在までに構造の異なるスカベンジャー受容体が次々に明らかにされている さて アセチルLDLはスカベンジャー受容体を介してマクロファージに取り込まれることにより実験的な泡沫細胞を形成させることはできるが 無水酢酸などの反応性の高いアセチル基の供与体が生体内に存在することは考えにくいため 生体内で起こり得るLDL の化学修飾が検索された そこでSteinbergらはLDLを血管内皮細胞と共培養し そこで得られた化学修飾 LDLは マクロファージに取り込まれて泡沫化を起こす性質を持つこと 11

18 を発見した (Henriksen et al.1981) この化学修飾 LDLは遷移金属イオンにより酸化された化学修飾 :LDLと同一のものであることが確認され 酸化 LDLと命名された 生体の血液中には多量の抗酸化物質が存在し また酸化 LDLは肝臓において速やかに代謝されることから :LDLの酸化は血液中ではなく主に血管壁内において起こると考えられている この過程においては血管構成細胞である血管内皮細胞 マクロファージ あるいは平滑筋細胞などが関与する細胞依存性酸化反応と銅イオンや鉄イオンなどの遷移金属の作用による酸化修飾 ( 化学的酸化反応 ) の二つの反応が関与していると考えられている 動脈硬化巣に : おける酸化 LDLの存在は免疫組織学的に証明されており (O Brien et al, 1991) 現在では酸化 LDLが動脈硬化惹起性リボ蛋白質として動脈硬化病変の進展に中心的役割を果たしていると考えられている (Steinberg et al.1989) これまでに数多くの酸化 :LDLの生理作用が報告されている (1) マクロファージの泡沫化 (2) 単球の血管内皮への遊走能増強 ( 酸化 LDL 単独でも遊走因子として働き また血管内皮細胞に対し monocyte chemotactic protein 1(MCP-1) の産生を誘導することにより単球の血管内皮下へ の遊走を促す ) (3) マクロファ 一 ジを病変部位へ留める作用 (4) 内皮細胞におけ る接着分子 (intracellular adhesion molecule-1:icam-1 vascular cell adhesion molecule-1: VCAM-1) の発現充進 (5) 内皮細胞でのエンドセリン産生の増加による内皮細胞依存性 血管弛緩作用の抑制効果 (6) 内皮細胞からの plasminogen activator inhibitor-1(pai-1) 産生の増加による血栓形成の促進 (7) マクロファージの増殖作用 (8)platelet derived growth factor(pdgf) やその受容体を発現させることによる血管平滑筋細胞の遊走や増殖 誘導などがあげられる なお ここに示している以外にも様々な酸化 LDL の生理作用が報告されており 酸化 LDL は動脈硬化病変のあらゆる進展過程に深く関わっている 12

19 5 一 (3)Peroxisome proliferator-activated receptor(ppar) ペルオキシゾーム増殖剤活性化型受容体 (peroxisome proliferator-activated receptors:ppars) の発見は1990 年代初頭のPPARαの発見に端緒を有する その後 PPARβ/δ PPARγが次々に発見された 以来 10 数年間 この3 種類のサブタイプを有するPPARsの研究は大きく展開してきた その理由の第一は PPARsが生体の糖 脂質代謝のみならず 発癌 骨代謝 炎症 線維化などにおいて多様な生理機能を有し したがって糖尿病 高脂血症 肥満などの生活習慣病 癌 炎症性疾患 動脈硬化症など多くの疾患の成因への関与が明らかになってきたことである その理由の第二は PPARγアゴニストであるチアゾリジン誘導体が糖尿病治療薬として PPARαアゴニストのフィブラート薬が高脂血症治療薬として それぞれの疾患の治療の上で重要な位置を占めるようになり またさらに多くのPPARs 標的薬が開発中であり 創薬の大きなうねりが続いていること 第三に基礎研究の進歩があげられる PPARsとリガンドの相互作用の立体構造の解明 コアクチベーターやリプレッサーの機能や転写制御のメカニズムの解明など この分野の基礎研究も更に発展を続けて いる 13

20 (1)PPAR サブタイプ 発現部位機能代表的リガンド PPARα 肝臓 骨格筋 褐色脂肪細胞 血管 脂肪酸燃焼 ブイブラート薬 } クロファージ G ネルギー消費 キ鎖脂肪酸 vy l4643 PPARβ/δ 骨格筋 血管 マクロファージなど普 脂肪酸燃焼 長鎖脂肪酸 ユ的に発現 G ネルギー消費 PPARγ γ1: 白色脂肪細胞 脂肪細胞分化 チアゾリジン誘導体 チ 2: 白色脂肪細胞 血管 マクロファ 塩 b 蓄積 P5d-PGJ2 [ ジ 恆緕モ 塩 b 酸酸化物 表 1:PPAR の特徴 PPAR のサブタイプは現在 α β/δ γ の 3 型が報告されている それぞれの特徴を上に 示す ( 表 1) (ll)ppars の構造 PPAR の一次構造については すべてのサブタイプで他の核内レセプターに特徴的な N 末端側 DNA 結合ドメイン (DNA binding domain:dbd) と C 末端側リガンド結合ドメイン (ligand binding domain:l:bd) が存在する DBD はアミノ酸配列上 よく保存されている が それに比べて LBD のホモロジーは低い しかし 3 つのサブタイプいずれにもクロス するリガンドが存在することなどから LBD の基本的な立体構造はすべてのサブタイプで 極めて類似していると考えられる ( 図 2) 14

21 M-1 ri-i AF-2 ri-i PPAR ct H3N COOH AF-1 AF-2 PPAR P H,N 黙慧禁一 w 鳩 _w 醜湖鞘 _w_ww 獣 一 叢懸 一一一 kb ) mm 蝋 w COOH AF-1 AF-2 PPAR y H3N 難 DBD 讐 懸蝋 _ 嘉 一一一一一一溜 LB ) 一一一一職構糊 _ 粘鞭 撚懸懲撚目 COOH 図 2:PPAR の構造 DBD :DNA-bindmg domatm. LBD :Ligand-binding domain. AF-1 :Ligand-independent Activaion domain. AF-2 :Ligand-dependent Activaion domain また PPA:R の N 末端と C 末端にはそれぞれ転写活性領域 AF-1(L,igand-independent Activation domain) AF-2(Ligand-dependent Activation domain) と呼ばれる領域が存在する AF-1 はプロテインキナーゼによってリン酸化を受けることにより リガンド非依存性に転 写活性を調節する AF-2 は LBD と大きく重複しており リガンドの結合だけでなくコア クチベーター等の共役因子との相互作用により標的遺伝子の転写活性調節に大きく関与し ている ( 皿 )PPAR の機能 PPARは活性化すると レチノイドXレセプター (Retinoid X receptor:rxr) と安定なヘ テロダイマーを形成する PPAR:RXRのヘテロダイマーは標的遺伝子の転写開始部位の上 流に存在するペルオキシゾーム増殖剤応答領域 (peroxisome proliferators response element: 15

22 PPRE) に結合し 標的遺伝子の転写活性を制御する PPAR:RXR ヘテロダイマーが結合 する標的遺伝子の PPRE は direct receptor(dr) と呼ばれる 5 一 AGGTCA-3 の配列が 1 塩基を 挟んで ( 多くは A) 同方向に並んだ 5 一 AGGTCA-n-AGGTCA-3 のダイレクトリピート構造を とる 代表的な PPAR 標的遺伝子は 脂質代謝関連では :LPL CD36 acyl-coa 合成酵素など 脂肪細胞分化関連では ap2 アディポネクチンなど その他 LXRα uncoupling proteins l (UCP-1) などがあげられる これらの直接的な標的遺伝子以外に 間接的発現制御を受ける遺伝子群も多数報告されている その分子制御機構として PPARがある転写因子の発現を直接制御し その転写因子の標的遺伝子が発現する場合と PPARと他の転写因子が直接結合し その転写因子の転写活性化能を制御する場合が考えられる 前者の例としては PPARαやPPARγによって誘導される同じ核内レセプター型転写因子 LXRαの作用による コレステロール逆転送系の促進や脂肪酸代謝を担う一連の遺伝子群 (ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) SREBP など ) があり (Chawla et al.2001) 後者ではマクロファ ージ炎症時に PPAR が転写因子 AP I と結合することで抑制される AP I 標的遺伝子群 (IL-1 IL-6) がある (Delerive et al.1999) 5 一 (4)PPARα と動脈硬化症 PPARαの活性化剤としてはフィブラート系の薬剤がすでに世界中で広く使用されており そのトリグリセリド血症の治療効果から抗動脈硬化作用を持ちうることが古くから考えられていた しかし このフィブラート系薬剤を用いた数多くの臨床試験の結果では 逆に高トリグリセリド血症単独では心血四病の弱いリスクにしかならないということが明らかにされている 一方 低 high-density lipoprotein(hdl) 血症 糖尿病 高血圧などの他のリスクを合併している高 triglyceride(tg) 血症患者を対象としたVA-HIT 試験では フィブラート系薬剤 ( ゲムフィプロジル ) は選択的に心血管イベントの発症を減少させている 16

23 また 2 型糖尿病患者 9795 人を対象にした無作為前向き試験 (FIE:LD Study) の結果から フィブラート系薬剤 ( フェノフィブラート ) が非致死性心筋梗塞や冠血行再建術が有意に抑制し さらに全心血管疾患イベントを有意に抑制することが報告されている このようなフィブラート系薬剤を用いた臨床試験の結果から PPARαの活性化がトリグリセリド低下作用以外の何らかの抗動脈硬化作用を有している可能性が考えられる 実際 PPARCtには 脂質代謝の調節だけではなく 血管壁の炎症反応を抑制する作用を持つことを示す多くの実験的あるいは臨床的報告がある 特に動脈硬化構成細胞に対する直接的な効果として 血管内皮細胞ではNF-KBの活性抑制を介したICAM-1 VCAM-1などの接着分子及び MCP-1などの産生抑制効果など マクロファージでは やはりNF-iC13の活性抑制を介した tumor necro sis factor ct(tnf 一 α) 誘導型 NO 合成酵素 (inducible nitric oxide synthase:ino S) などの炎症惹起因子の産生抑制効果 また脱泡開化分子である ABCAI の発現誘導効果など また血管平滑筋細胞では増殖抑制効果などが報告されている ( 図 3) 図 3=PPARα PPARγ による血管構成細胞に対する抗動脈硬化作用 NF-ld3: nuclear factor-kb, inos: inducible NO synthase, ABCA I: ArlP-binding cassette activator-1, IL-6: interleukin-6, MCP-1: monocyte chemokine protein-i, VCAM-1: vascular chemoattractant molecule-1, 17

24 5 一 (5)PPARγ と動脈硬化症 これまでに PPARγ アゴニストであるチアゾリジン誘導体は LDL 受容体欠損マウスや ApoE ノックアウトマウスなどの動脈硬化モデル動物において動脈硬化抑制効果を有して いると報告されている (Li et al,2000, Chen et al.2001) PPARγ は血管やマクロファージに も発現しており PPARγ アゴニストが代謝改善作用に加え そのレセプターを介する直接 作用によっても抗動脈硬化作用を発揮していると思われる 近年 PPARγ により単球のマクロファージへの分化が誘導されることが示唆されており PPARγ が粥状硬化の初期段階である泡沫細胞の形成に関わっているのではないかと考えら れている PPARγ の単球 / マクロファージにおける発現は これまでにヒト末梢血由来の単 球 マウスリンパ節マクロファ 一 一 一ジ マウス腹腔マクロファージにおいて確認されている が 粥状硬化病変部の泡沫細胞にも発現していることが報告されている (Tontonoz et al 1998) 元来 単球における PPARγ の発現量は低いが GM-CSF M-CSF 活性型ビタミン D やボルボールエステルなどでマクロファージへの分化を誘導すると増加する ヒトの単 球に酸化 LD:L を添加すると PPA:Rγ の発現が誘導されることや マクロファージによる酸 化 LDL の取り込みのメカニズムにおいても PPA:Rγ が関与していることが報告されている (Tontonoz et al.1998) さらに 活性型マクロファージにおいて PPARγ の発現が認められ ること 更に PPARγ のリガンドであるチアゾリジン系誘導体 (thiazolidinediones:tzds) や 15-deoxy 一 prostaglandin J2(15d-PGJ2) 高濃度の非ステロイド性抗炎症薬がスカベ ンジャーレセプター AI(SR-AI) inos TNF 一 α interleukin-1β(il-1β) IL-6 などの発現 を抑制することが報告され (Ricote et al.1998) 抗炎症作用と同時に抗動脈硬化作用とし てマクロファージ機能制御に PPARγ が深く関与していることが示唆された しかし現在で は PPARγ の活 1 生化はコレステロール引き抜きに関与する ABCA1 の発現を誘導し 脱泡 18

25 沫化の誘導を促進することが考えられている (Chinetti et al.2001) 以上のことより PPARγ はマクロファージ由来泡沫細胞の関与する動脈硬化初期病変の発症 進展に 何らかの形 で関与している可能性が考えられる 5 一 (6) 酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化作用 近年 動脈硬化惹起因子である酸化 LDL が 血管内皮細胞において PPARα の活性を誘導 すること (Lee et al.2000, Delerivea et al.2000) またサル腎臓由来線維芽細胞である CV-1 細胞において PPARγ の活性化を誘導すること (Nagy et al.1998.) が報告された その活性 化の機序としては 酸化 LDL 中に存在する酸化リン脂質や 9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE) 13-hydroxyoctadecadienoic acid(13-hode) などがそれ単独で PPARα PPARγ の活 1 生化を誘導することから これら酸化脂質による作用であると考えられているが 詳細は不明である 一方 酸化 LDLによるこれらPPARの活 1 生化は スカベンジャーレセプターの一つであるCD36の産生を誘導し 酸化 :LDLの取り込みを増加させることが報告され マクロファージの泡沫化にも関与する可能性が考えられた (Nagy et al.1998) しかしながらチアゾリジン系薬剤を用いた検討で PPARγの活性化した状態では CD36 産生増加を起因とした変性 LDLの取り込み増加率は非常にわずかで 逆にABCA1の産生からコレステロールの引き出し効果が強く現れることが知られている (Chinetti et al.2001) また PPARα 及び PPARγ の活性化は明らかな抗炎症作用を引き起こすが 同様に酸化 L,D しもまたし P S など の炎症性応答によるサイトカイン産生を抑制する効果を持つことが 一部のグループより 報告されており (Hamilton et al.1995) この応答は酸化 :LDL の持つ PPARα PPARγ の活性 化を介して引き起こされている可能性が考えられる 5 一 (7) 本研究の目的 19

26 前述のように 酸化 LDLは動脈硬化症の発症 進展において重要な役割を担っていることが報告されている その一方で 酸化 LDLは抗動脈硬化作用を持つPPARα PPARγの活性化能をも持ちうるが その活性化機序の詳細や 臨床的意義に関しては 全く知られていない そこで本研究では 酸化 LDLによるPPARα PPARy 活性化の詳細なメカニズムを解明するとともに 酸化 LDLによるPPAR 活 1 生化を介した動脈硬化惹起因子への影響を検討することで 酸化 :LDLのPPAR 活性化の臨床的意義を解明し さらにはその機序を応用した動脈硬化新規治療法の確立を目的とした 20

27 6. 材料と実験方法 6 一 (1) リポタンパクの精製 LDL(d=LO19~1.0639/ml) は 本研究に対し同意を得た正脂血症健常人より 空腹時に採血し得られた血漿から超遠心法を用いて調整した (H:akamata et a1 1994) LDLはl mm EDTA 生理食塩水で透析し 4 で保存した LDLはアガロースゲル電気泳動及び SDS-PAGEを用いて電気泳動度及びアポ蛋白組成を確認した 6 一 (2) 酸化 LDL (Ox-LDL) の調整 LD:L を PB S で 1 mg/ml に希釈し 最終濃度 5μM の硫酸銅を加えた 37 で 20 時間放置し た後 最終濃度 1mMのEDTAを添加し 氷中で冷却した 濃縮の後 l mm EDTA 生理食塩水で透析し 4 で保存した またmildly oxidized LDL (m-ox-ldl) はLDLをPBSで0.1 mg/mlに希釈し 最終濃度 5μMの硫酸銅を加え 37 で5 時間放置した後 最終濃度 1 mm のEDTAを添加し 氷中で冷却した マウス腹腔常在マクロファージを使った本実験系において エンドトキシンはlng/ml 未満の濃度では細胞毒性はなく 増殖にも影響がないことを確認しており 本実験で使用した酸化 LDL 中のエンドトキシン濃度はlpg/mg protein 未満であった マクロファージによるLDLの酸化は 100μgのLDLと100nMの硫酸銅を添加した 細胞培養液 (6 一 (3) 細胞参照 ) でマウスの腹腔マクロファージを20 時間培養したもの を macrophage mediated oxidized LDL(Mm-Ox-LDL) として用いた (Lindstedt et al 1993) 脂質の酸化は Nagano らに従い チオバルビツール酸反応陽性物質 (thiobarbituric acid-reactive substabces:tbars) を測定し確認した (Nagano et al.1991) 21

28 6 一 (3) 糸田月包 雄性 DDYマウス (6~8 週齢 ) をジエチルエーテル麻酔し頚動脈及び鎖骨下動脈を切断 流水下に失血死させた後 腹部を70% エタノールで消毒し表皮を切開した 氷冷したPBS を10ml 注射器で腹腔内へ注入し 腹腔洗浄により腹腔細胞を回収した 回収した細胞は 4 で1000rpm 5 分間遠心して上清を吸引破棄後 RPM %FCSに再懸濁し 血球計算板を用いて細胞数を算定しプレートへ分配した CO2 培養器 (37 5%CO2) 内で 2 時間艀置した後 浮遊細胞をPBSで洗浄除去し プレートに付着した腹腔マクロファー ジを実験に使用した 溶液の組成 :RPMI l %FCS RPMI 1640 (Gibco:BRL 社 ) 10.4 g NaHCO3 HEPES ペニシリン ストレプトマイシン 1.2 g 2,38 g U p 100mg 以上を蒸留水に溶解し ph 72 に滴定後 900 ml とし 100 ml のウシ胎児血清 (Fetal Calf Serum:FCS, INTERGEN 社 ) を加えフィルター滅菌し 細胞培養液として使用した Mouse macrophage の cell llne である RAW 細胞は 同じ RPMI %FCS にて 培養し 2x105 から 2x106 個 /ml の濃度で実験に使用した Human monocyte の cell line である THP-1 細胞は 同じ RPMI %FCS にて培養し 200nM の phorbol myristate acetate(pms) で 8 時間刺激し macrophage へ分化誘導した 浮遊細胞を PB S(phosphate-buffered saline) で 2 度 洗浄除去し 再び実験で使用するまで 22

29 RPMI l640-10%fcs にて培養した 6 一 (4) 実験動物 動物実験は熊本大学動物実験指針及び動物実験資源局 (lnstitute of Laboratory Animal Resources:ILAR) ガイドラインに準じて行った 熊本大学生命資源研究 支援センターに て specific pathogen-free(spf) の環境下で 人工照明を 12 時間の明暗周期で管理し 飼料 及び水は不断給与できる環境とした 動物実験には 24 週齢の雄の ApoE ノックアウトマウ スと コント n 一一ルとして背景を揃えた 24 週齢の雄の C57BL/6 マウスを用いた (wild type: WT) 飼料は SPF グレードのマウス通常食 CLEA Rodent Diet CE-7(CLEA 社 ) にて飼育し た 6 一 (5) 組織免疫染色 ApoE ノックアウトマウスと wild type(wt) マウスより大動脈洞を採取し oil red O で染 色した (Fujiwara et al.2007) 免疫染色には 3μm の厚さのパラフィン固定切片を作成した 酸化 LDL の免疫染色は一次抗体にビオチン化した FOH:1 a/dlh3 を用い マクロファージの CD l l b には anti-integrinαm (goat)(santa Cruz Biotechnology 社 ) を用いた 二次抗体に は 酸化 LDL に対しては peroxidase-conjugated atreptavidin (Nichirei 社 ) CD l l b に対しては Hitofine Simple Stain Mouse MAX-PO(goat) (Nichirei 社 ) を用いた 最後に 3,3-diaminobenzidine で発色させた後 核をヘマトキシリンで染色した コントロールは 一次抗体を省いた同様の手技で行った 6 一 (6)PPARct PPARγ 活性 (fu11-length PPAR assay) の検討 23

30 PPAR の活性化は PPARα, PPARγ 発現ベクター 及び PPAR 結合領域 (PPR:E) の sequence (UAS) が 3 コピー存在する luciferase reporter plasmid((aox)3-1uc) を用い測定した ( 血 ll-length PPAR. assay) PPARα 発現ベクター (pcmv-hpparα) は Miyamoto Kakizawa ら に PPARγ 発現ベクター (pcmx-pp ARy2) は Brownlee らに供与を受け実験に使用した PPA:Rα 活性を測定するため 1 穴あたり 2xlO6 個の RAW264.7 細胞を付着させた 6 穴プ レート ( 直径 34mm) に対し l well あたり 1μg の pcmv-hpparα (AOX)3-luc を 1well あたり 5μ1 の LIPOFECTAMI:NE 2000(lnvitrogen 社 ) を用いて導入した また PPARγ 活 性を測定するため 1 穴あたり 2xlO6 個の RAW264.7 細胞を付着させた 6 穴プレート ( 直 径 34mm) に対し 1well あたり 1μg の pcmv-hpparγ (AOX)3-luc を 1well あたり 5 μ1 の LIPOFECTAMINE 2000(lnvitrogen 社 ) を用いて導入した 5 時間培養後 種々の刺 激を添加したのちにさらに 24 時間培養し 細胞溶解液を用いて細胞を溶解した後 溶解液 をサンプルとし Dual-Luciferase Reporter Gene Assay system(promega 社 ) を用いてルシフ ェラーゼ活 1 生を測定した 得られた結果は 同時に導入した SV40 をそのプロモーター部 位に持つ intemal control plasmid(renilla luciferase plasmid;promega 社 ) による Iuciferase 活 性の値を用いてトランスフェクション効率の補正を行った 6 一 (7)PPARα PPARy リガンド結合活性 (PPAR ligand-binding assay) の検討 PPARα のリガンド結合活 1 生は 哺乳類には存在しない GAL4 の DNA 結合領域と PPARα のリガンド結合領域の血 sion 蛋白を発現させる plasmid(pm-ppa:rα) と GAL4 の DNA 結合領域の sequence(uas) が 4 コピー存在する luciferase reporter plasmid(p4xuasg-tk-1uc) を用い測定した (PPARct ligand-binding assay) 同様に PPARγ のリガンド結合活性は GAL4 の DNA 結合領域と PPARγ のリガンド結合領域の血 sion 蛋白を発現させる plasmid 24

31 (pm-pparγ) と GA:L4 の DNA 結合領域の sequence(uas) が 4 コピー存在する luciferase reporter plasmid (p4xuasg-tk-1uc) を用い測定した (PPARγligand-binding assay) PPARαリガンド結合活性を測定するため 1 穴あたり2x106 個のRAW264.7 細胞を付着させた6 穴プレート ( 直径 34mm) に対し 1wellあたり1 ptgのpm-pparα p4xuasg-tk-luc を Iwe11あたり5μ1のUPOFECTAMI:NE 2000(lnvitrogen 社 ) を用いて導入した 同様に PPARγリガンド結合活性を測定するため 1 穴あたり2xIO6 個のRAW264.7 細胞を付着させた6 穴プレート ( 直径 34mm) に対し 1wellあたり1 pgのpm-pparα p4xuasg-tk-lucを 1we11あたり5μ1のLIPOFECTAM NE 2000(lnvitrogen 社 ) を用いて導入した 5 時間培養後 各種刺激を添加したのちにさらに24 時間培養し 細胞溶解液を用いて細胞を溶解した後 溶解液をサンプルとし Dual-Luciferase Reporter Gene Assay system(promega 社 ) を用いてルシフェラーゼ活性を測定した 得られた結果は 同時に 導入した SV40 をそのプロモーター部位に持つ intemal control plasmid(renilla luciferase plasmid;promega 社 ) による luciferase 活性の値を用いてトランスフェクション効率の補正 を行った 6 一 (8)Enzyme-linked immunosorbent assay(elisa) による PPARs 転写活性測定 普通食で飼育した 24 週齢の雄の ApoE ノックアウトマウスと 24 週齢の雄の C57BL,/6 マウスより大動脈洞を採取し PPARα PPARγ の転写活性測定を PPARα PPARδ PPARγ Comp 豆 ete Transcription Factor Assay キット (Cayman Chemical 社 ) を用いて行った 6 一 (9)NF-KB 活性測定 NF-icB の活性を測定するため 1 穴あたり 2x106 個の RAW264.7 細胞 マウス腹腔マク 25

32 ロファージ THP-1 細胞を それぞれ付着させた 6 穴プレート ( 直径 34 mm) に対し 1well あたり 1pg の NF 一田の luciferase reporter plasmid(p]n[f i(b-luc) を 1well あたり 5μ1 の LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen 社 ) を用いて導入した 5 時間培養後 各種薬剤を添加 したのちにさらに 24 時間培養し 細胞溶解液を用いて細胞を溶解した後 溶解液をサンプ ルとし Dual-Luciferase Reporter Gene Assay system(promega) を用いてルシフェラーゼ活 性を測定した 得られた結果は 同時に導入した SV40 をそのプロモ L 一一一ター部位に持つ internal control plasmid(renilla luciferase plasmid;promega 社 ) による luciferase 活性の値を 用いてトランスフェクション効率の補正を行った 6 一 (10)short interfering RNA(siRNA) の導入 1 穴あたり2x106 個のRAW264.7 細胞 マウス腹腔マクロファージをそれぞれ付着させた6 穴プレート ( 直径 34mm) に対し 1wellあたり1μgのCOX-2 PPARα PPARγ controlのsirna(santa Cruz Biotechnology 社 ) を 1wellあたり5 叫のLIPOFECTAI)vllNE 2000 (Invitrogen 社 ) を用いて導入した 4 時間培養後 メディウムをRPMI %FCSに交換し 各種刺激を添加したのちにさらに24 時間培養し mrna ウェスタンプロットのサンプルとした 6 一 (11)RT-PCR 法による COX-2 ABCA1 MCP-1 mrna 発現の検討 (A)RNAの抽出 1 穴あたり2 106 個の細胞を付着させた6 穴プレート ( 直径 34mm) に各種薬剤を添加し 2mlの培養液で培養した 40Cに冷やしたPB Sで洗浄した後 1 mlのtrizol 試薬 (Invitrogen 社 ) を加え 細胞をスクレイパーにてプレートより剥離し 1.5 mlチューブに 26

33 移した 室温にて 5 分間静置後 クロロホルムを 200μ1 加え 30 秒間よく撹拝し さらに 2 分間室温に静置 次に 15,000 回転 4 で 15 分間遠心し 上清 400μ1 を新しい 15ml チューブに移した 400 pl のイソプロパノールを加え 室温にて 10 分間静置後 15,000 回 転 4 で10 分間遠心した 上清を取り除き lmlの75% エタノールを加え 軽く撹搾した後 15,000 回転 4 で5 分間遠心した 上清を取り除き ペレットを軽く空乾した後 RNA 分解酵素を含まない水に溶解し 分光測光法で濃度を測定した 1μgのtotal RNA からReverTraAce-alpha(TOYOB O 社 ) を用いてfirst strand cdnaを合成した (B)rea1-time RT-PCR 法による COX-2 ABCAI MCP-1 mrna 発現量の定量 以下に示すプライマー及び条件で Light Cycler システム SYBER Green 1(Roche Molecular Biochemicals 社 ) を使用し それぞれ mr:na の発現量を定量した (Bendriss-Vermare et al. 2001). PCRプライマー : COX-2: forward primer: 5 一 CCAGAGCAGAGAGATGAAA-3 reverse primer: 5 一 GGTACAGTTCCATGACATC-3 P-actin: forward primer: 5 一 GTGGGCCGCTCTA(]K3CAC CAA-3 reverse primer: 5 一 CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3 ABCAI: forward primer: 5 一 ATTGCCAGACooAGCCG-3 reverse primer: 5 一 TGCCAAAGGGTGGCACA-3 27

34 MCP-1: fbrward primer 二 5 一 GGTCCCTGTCATGCTTCT-3 reverse primer: 5 一 CATCTTGCTGGTGAATGAGT-3 条件 : Annealing 55 OC. denature 95 OC. enlongation 72 OC 40 cycles 内部コントロールとしてβ 一アクチンを同様の方法で定量し mrna 発現量を補正した Light Cycllerソフトウエアによって得られたデータを解析し それぞれのmRNA 濃度を定量した 最後の増幅サイクルの後 PCR 産物の特異性を評価するためにMelting curve 分析を実行した さらにPCR 産物は2% アガロースゲルで電気泳動し 臭化エチジウムで染色した後 紫外線イメージングにより可視化し 単一のバンドであることを確認した 6 一 (12) ウェスタンプロット法による蛋白質リン酸化及び蛋白質発現の検討 (A) 蛋白精製 1 穴あたり2 106 個の細胞を付着させた6 穴プレート ( 直径 34mm) に各種薬剤を添加し2mlの培養液で培養した 4 に冷やしたPBSで洗浄した後 300μ1の蛋白抽出用溶液を加え 細胞をスクレイパーにてプレートより剥離し 1.5mlチューブに移した 4 20,000 g 10 分間の遠心分離を施行し 上清を試料として使用した また 動物より採取した組織に対しては 1.5mlチューブに移し 500 Pt1の蛋白抽出用溶液を加え ホモジナイズ後 4 20,000 g 10 分間の遠心分離を施行し 上清を試料として使用した 蛋白抽出液はCoomasie brilliant blue(cbb)g250を用いたbradfbrd 色素結合法 (Bio 一一 Rad 社 ) 28

35 にて 吸光度計で蛋白濃度を測定した 蛋白抽出用溶液の組成を下記に示す 蛋白抽出用溶液 30 mmol/l Tris (ph 7.4) 150 mmol/l NaCl 10 mmol/l EDTA 1 mmol/l Na3VO4 20 mmol/l Na4P mmol/l NaF 1 O/, NP-40 1mmol/l phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 10 pg/ml aprotinin 1 pmol/l leupeptin (B) ウェスタンプロット法 精製した各蛋白を 50μg ずつ分注し 試料溶解用溶液を加え 95 5 分間煮沸し sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(sd S-PAGE) を行った SDS-PAGE 終了後 セミドライ転写器を用いてニトロセルロース膜 (Schleicher&Schuell 社 ) に電気的に転写した 目的とする蛋白の検出方法はChemiluminescence Western Blottingキット (BOEmmGER MANNHEIM 社 ) に付属の使用法に従い行った まず ブロッキング液中で膜をブロッキング 次に一次抗体反応 ( 室温 2 時間 ) 二次抗体反応( ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG 抗体 室温 30 分 ) を行ったあと 発光基質を加え 発光をX 線フィルムに感光した 定量 はフィルムをスキャナ 一一で画像として取り込み N 田 Image analyser にて解析を行った 蛋白 のリン酸化の強度は 非リン酸化抗体で検出した蛋白発現量で補正した後 4 回の実験を平 29

36 均化した また非刺激対照群のリン酸化強度を 100 とした時の %± 標準偏差で表した 以下 に一次抗体反応で用いた抗体を示す 抗 COX-2 抗体 (Cayman Chemical 社 ) 抗 ERK 1/2 抗体 (Santa Cruz Biotechnology 社 ) 抗 phospho-erki/2 抗体 (Cell Signaling 社 ) 抗 p38mapk 抗体 (Santa Cruz Bioteclmology 社 ) 抗 phospho-p38mapk 抗体 (Santa Cruz Biotechnology 社 ) 抗 PPARα 抗体 (Santa Cruz Biotechnology 社 ) 抗 PPARγ 抗体 (Santa Cruz B iotechnology 社 ) 6 一 (13) アデノウイルスベクターを用いた優性ネガティブ変異体の強制発現 dominant negative ERK (DN-ERK) dominant negative p38mapk (DN-p38 MAPK) そ れぞれの遺伝子を有する複製能の欠失したアデノウイルスを 感染多重度 (multiplicity of infection;moi) を約 50 に調整し 細胞に感染させた 3 時間の感染操作後 細胞培養液を 交換し 48 時間培養後 細胞を実験に用いた 6 一 (14)Enzyme Immunoassay(EIA) による 15d-PGJ2 PGE2 PGD2 測定 1 穴あたり 2x106 個の RAW264.7 細胞をそれぞれ付着させた 6 穴プレート ( 直径 34 mm) に対し 各種刺激を添加した後に さらに 40μg/ml の酸化 LDL または LDL を添加 し 24 時間培養後 浮遊細胞を PB S で洗浄除去し 15d-PGJ2 PGE2 PGD2 の測定を EIA キット (Cayman Chemical 社 ) に付属の使用法に従い行った 30

37 6 一 (15) ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸組成の検討 1 穴あたり2x106 個のRAW264.7 細胞をそれぞれ付着させた6 穴プレート ( 直径 34 mm) に対し 各種刺激を添加した後 24 時間培養し Beckman Coulter Counter Z2を用いて 各サンプルの細胞数を2xlO4 個に揃えた Folchらの方法にてサンプルより 総脂質の抽出を行った (Folch et al.1957) KOHで脱水し 脂肪酸をBF3でメチルエステル化後 ガスクロマトグラフィー (GC-17A 島津製作所 ) により アラキドン酸 オレイン酸 リノレイン酸 ドコサヘキサエン酸を測定した 6 一 (16) 統計学的解析 数値は平均値 ± 標準偏差 (SEM) で表記した 数群間の有意差は, ANOVA にて検定し た また 2 群問の検定に関しては student st-test にて有意差を検定した いずれも p<0.05 の際 に 統計学的に有意と判断した 31

38 7. 実験結果 7 一 (1) マクロファージにおける酸化 LDL による PPARα PPA:Rγ 活性化の検討まず 酸化 LDL によるマクロファージにおける PPARα PPARγ 活性化を検討した 5μM の硫酸銅で 20 時間処理した酸化 LD: しの添加により PPARα PPARγ 活 1 生 ( 図 4-1A) PPARα PPARγ リガンド結合活性 ( 図 4-1B) は 共に酸化 LDL の濃度依存性に上昇した しかし :LDL の添加では上昇しなかった 自邸ω煽Ω 一〇一隔 匡 呂 場O 明く 脚O=1=繭コ 0 A Ox-LDL (pglml) LDL (pglml) % Full-length PPARoc 團 F ll-1 ngth PPARγD)一 })-一(())0葡-(() 0一ハ {{))50 ゥ((100} ( 一 ) ( 一 ) (100) B 9 08轟04つ 0の(一三ω邸Ω眉廓O一 1一匡 き旧 旧りO邸O 旧 =旧ρ一恩=60昌 匡イ n哺n廟va Ga14-PPARor N Gat4-PPARy Ox-LDL (pglm 1) ( 一 } (1) (1 0) (20} (50) LDL (pglml) ( 一 } ( 一 } ( 一 ) ( 一 ) { 一 ) 図 4-1: 酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化の検討 RAW264.7 cell に示した濃度の酸化 L 肌 LDL を添加し 24 時間培養した たように PPAR 活性 (A) 平均値 ± 標準偏差を表した ft, p O.Ol, 対対象の細胞群 32 (100) ( 一 ) { 一 ) (100) 材料と実験方法 に示し PPAR. リガンド結合活性 (B) を測定した 結果は 4 回の実験を平均化し

39 蓄 旧ぢ巴=旧要旧Ω亡影O旧剛匡く 0マウスの腹腔マクロファージに 50μg/ml の酸化 LDL を添加し 同様の実験を行ったところ PPARα PPA:Rγ のリガンド結合活性はそれぞれ 6.3 倍 5.8 倍に上昇した また THP-1 細胞でもそれぞれ 5.2 倍 4.9 倍に上昇が認められた 次に mildly oxidized LD:L(m-Ox-LDL) での PPARα PPARγ 活性化を検討した m-ox-ldl は酸化 LD: しに比べ表 2 に示すように酸化度の変化が軽度であったが m-ox-ldl でも PPARα PPARγ のリガンド結合活 1 生は上昇していた ( 図 4-2) TBARS mobili Intact apob LDL nmol MDA/mg 2.2 土 0.2 relative to l %of loo m-ox-ldl 8.3± ± ±2.2 Ox-LDL 22,8 土 ± ±1.8 表 2: 硫酸銅による LDL の酸化反応の検討 LDL に 5pM の硫酸銅を加え 37 で 20 時間放置した Ox-LDL と 5 時間放置した m-ox-ldl を作製し その酸化 LDL の酸化度の変化を TBARS Electrophoretic mobility Intact apob の量で評価した,p<0.Ol, 対し DL5自嘱ω邸Ω眉一〇 コ 匡 4321 ( ) Ox-LDL m-ox-ldl (20 pglml) {20 pglml) 図 4-2:m-Ox-LDL による PPARα PPARγ リガンド結合活性への影響 RAW 264.7cell に 20μg!ml の酸化 LDL m-ox-ldl を添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように PPARα PPARγ リガンド結合活性を測定した 結果は 3 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した t,p く ().Ol, 対し DL の細胞群 33

40 また 生体内では LDL の酸化は血管内皮細胞やマクロファージにより受けると考えら れている そこで より生体内に近い酸化 LDL としてマクロファージにて酸化させた酸化 LDL(Mm-Ox-LDL) を用い PPARα PPARγ の活性化能を検討した Mm-Ox-LDL は TB ARS が 7.1±0.3 nmol MDAImg LD: しであったのに対し マクロファージ非存在下で同様に培養し た LDL (c-ld:l) では TBARS が 2.4±0.4 nmol MDA/mg LDL と native な LDL と同程度で あった さらにこの酸化 LDL を用いて PPARα PPARγ の活性化を検討したところ Mm-Ox-LDL では PPARα PPARγ リガンド結合活性は上昇したが c-ldl では活性の上昇は 認められなかった ( 図 4-3) 5 言葺 4 g. o 窃 tt ll 3 器 v 匹 川 li ヨ 2 9 巴 E i o lipoproteins.. c-ldl Mm-Ox-LDL (pg/ml) ( 一 ) (20) (20) 図 4-3:Mm-Ox-LDLによるPPARα PPARγリガンド結合活性への影響マウスの腹腔マクロファージに100μgのLDLと100 nmの硫酸銅を添加し 20 時間培養後 培養液よりLDLを抽出し RAW 264.7cellに20μ9/mlの LDL Mm-Ox-LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したようにPPARα PPARγリガンド結合活性を測定した 結果は3 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対しDLの細胞群 34

41 くZα一ヒ瓠 OO7 一 (2) マクロファージにおける酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化に対する COX-2 の 検討 次にマクロファージにおいて 酸化 LDL が COX-2 の発現を誘導するか RT-PCR ウェスタ ンプロット法にて検討した RAW264.7 ce11 は 40 mg/m1 の酸化 LD:L 添加にて COX-2 の mrna 発現 蛋白発現ともに添加後 1 時間より上昇し この発現上昇は 6 時間継続して認められた ( 図 5-1) A 76543Time 210( 一ユ切要ρコ {h) o 1 3 * 6 酬ヒ 切=6旧1一〇 島Nl 10ごつη h m B C X.2 β 一 ac 電 in iiii 載籔 雛 辮鵬撒蝦 Time (h) O {一下ωd54321 一り O駒 鰍懸弾, 灘甥澗淵職蒙 O l 3 6 図 5-1: 酸化 LDLによるCOX-2 発現誘導効果 RAW 264.7cellに40μglm1の酸化 LDLを添加し 添加前 添加後 1 時間 3 時間 6 時間培養後 材料と実験方法 に示したようにCOX-2の (A)mRNA 発現をRT-PCRにて 0(B) 蛋白発現ウェスタンプロット法にて測定した 結果は3 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対対象の細胞群 次に COX-2 阻害による影響を検討するため COX-2 の特異的阻害剤である NS-398 meloxicam の酸化 LDL による PPAR 活性化への影響を検討した 酸化 LDL による PPARα PPARγ 活 1 生化は NS-398 meloxicam により部分的にではあるが 有意に抑制された さらに cox-2 の sirna による酸化 L,D しによる PPAR 活性化への影響を検討した cox-2 の sirna 処 理により酸化 :LD: しによる COX-2 の蛋白発現は 86% 抑制され 酸化 LDL による PPARα 35 PPARγ

42 76鑑U439嗣10( 活性化はそれぞれ 58.8% 56.1% 抑制された ( 図 5-2) A 書 ぢ邸習石三ρも嵜O旧 配く店店( 6ω邸Ω 騨O 鵬 コー 匡 9 8 Ox-LDL 一 ) (+) (+) (+) ( 一一一 ) { 一 } NS-398 ( 一 ) ( 一 } (+) ( 一 ) (+} ( 一 ) meloxicam ( 一 ) ( 一 ) ( 一 ) (+) ( 一 ) (+) B COX-2 P-actin sirna Ox-LDL 蕪脳縣織肇燃灘 z iiiliili 藝 iiiiiiiiiiiiliii 籔 i 灘蹴繍 cont COX-2 ( 一 ) 8隷 7一 ??@ 臨酬 桑惹 鰯 灘 i 懸 照澱 が ゴへ なロロト c cont cox-2 蓋 ロ { 昼 莚 9倉雨ω6ρコε5 匡 Ox-LDL ( 一 ) (+) ZGa14-PPARoc 團 G 14.PPARγ ( 一 ) (+) sirna cont cont cox-2 cox-2 図 5-2: 酸化 LDLによるPPARα PPARγ 活性化へのCOX-2 阻害の影響 RAW 264.7cellに (A)10μMのNS-398と10μMのmeloxicamで1 時間前処理後 40μglinlの酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したようにPPARα PPARγリガンド結合活性を測定した (B) (c) 材料と実験方法 で示したようにcox-2のsiRNA 処理後 40μg!m1の酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように (B) 蛋白を抽出し 抗 COX-2 抗体 抗 β 一 actin 抗体でウェスタンプロット法を行った (C)PPARα PPARγリガンド結合活性を測定した 結果は3 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,P<0.01, 対対象の細胞群, P<0.Ol, 対 LDL 添加の細胞群 36

43 7 一 (3) 酸化 LDL の COX-2 発現増加に対する ERK1/2 の関与の検討 これまで当教室の Seno km chi らは酸化 LDL が ERK1/2 p38mapk を活性化することを報告 してきた (SenokUchi et.al 2004) この ERK 1/2 MAPK がマクロファージにおいて COX-2 の産生を誘導することはよく知られている そのため この酸化 LDLによるCOX-2の発現増加がMAPKを介しているのではないかと考えられた そこでまずRAW264.7 cellを用い 酸化 LDLによるERK 1/2 p38mapkの活性化について検討した 40μg/mlの酸化 :LDL 添加後 1 時間よりERK1/2 p38mapkのリン酸化が認められ そのリン酸化は6 時間後まで継続し ていた ( 図 6-1) P-ERK i li 灘 i 卿欝婁誓織豊総懸 v 6 t 制一 ERK 癒翔驕 騨 _ 器 4 P-P38 iili 讐羅 ii i 嚢灘 馨 iilili 嚢 ilili ii l!i 灘 iiii iiii iii ii ii 罷 l o t tal-p38 韓甲羅甲羅 lel Ti me (h) O Ti me (h). 禽 闘., c * 一 ERKI12 A iei P38 MAPK 嚢嚢 典 b...4. 嚢 O l 3 6 図 6-1: 酸化 LDLによるERK1/2 p38mapk 活性化の検討 RAW 264.7cellに40μg!mlの酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように蛋白を抽出し 抗 ERKI12 抗体 抗 phospho ERKI/2 抗体 抗 p38mapk 抗体 抗 phospho p38mapk 抗体でウェスタンプロット法を行った 結果は4 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対対象の細胞群 次に ERK1/2 の特異的阻害剤である PD98059 p38mapk の特異的阻害剤である SB を用いて 酸化 LD: しによる PPARα PPARγ 活性化の検討を行った RAW264.7 cell に酸化 LDL を 40μg/ml 添加した 3 時間後 COX-2 の mrna 発現は約 3 倍に上昇するが ERKI/2 の特異的阻 害剤 PD98059 はこの上昇を抑制した しかし p38mapk の特異的阻害剤 SB では抑制 を受けなかった ( 図 6-2) 37

44 43<Z匡 N, O含邸ω6ΩU一〇ヒ 1 記 =O応O=に =旧 眉=60L一匡イ帖 2t COX-2 B-actin Ox-LDL ii 顯難顛麺噸 tt 麓 覇逐一罐錘灘 謹 ( 一 ) (+) (+) (+) PD SB Oo Ox-LDL ( 一 ) (+) (+} (+) ( 一 ) ( 一 ) PD SB PD SB 図 6-2: 酸化 LDLによるCOX.2 発現誘導に対するERK112 阻害剤 p38mapk 阻害剤の影響 RAW 264.7cellに20μMのPD98059と10μMのSB203580で1 時間前処理後 40μg!mlの酸化 LDLを添加し (A)3 時間培養後 材料と実験方法 に示したようにCOX-2のmRNA 発現をRT-PCRにて測定した 結果は4 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した (B)6 時間培養後 材料と実験方法 に示したように蛋白を抽出し 抗 COX-2 抗体 抗 β 一 ac 廿 n 抗体でウェスタンブuット法を行った 結果は3 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した *,p<0.ol, 対対象の細胞群, p<0.ol, 対 LDL 添加の細胞群 また 酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化は ERK1/2 の特異的阻害剤 PD98059 で抑制さ れたが p38mapk の特異的阻害剤 SB では抑制されなかった ( 図 6-3) 店Ox-LDL (一6ω6Ω疇U一〇 鴨 1隔匡 o ( 一 ) (+) (+) (+) ( 一 ) ( 一 ) PD SB PD SB 図 6-3: 酸化 LDLによるPPARsリガンド結合活性誘導効果に対するERKI12 阻害剤 p38mapk 阻害剤の影響 RAW 264.7cellに20μMのPD98059と10 pmのsb203580で1 時間前処理後 40μg!mlの酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したようにPPARα PPARy Vガンド結合活性を測定した 結果は4 回の実験を平均化し 平均値土標準偏差を表した ft,p<o.ol, 対対象の細胞群, P<0.Ol, 対しDL 添加の細胞群 38

45 喜 ぢ邸〇三眉三Ω亡 9旧をく 匹(一邸ω6Ω眉 O m 一匡 1さらに DN-ERK 1/2 では酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化は抑制されたが DN-p38MAPK では抑制されなかった ( 図 6-4) これらのことから 酸化 LDL による PPARα PPARγ 活 1 生化には EPK1/2 を介した COX-2 発現増加が関与していると考えられた 10 0( 一 ) (+) (+) (+) Adeno virus LacZ N DN 一 DN- ERK p38 図 6-4= 酸化 LDLによるPPARsリガンド結合活性誘導効果に対するERKI/2 阻害 p38mapk 阻害の影響 RAW 264.7cellに 材料と実験方法 に示したようにDN-ERKI/2 DN-p38MAPK LacZを感染後 40μg!ml の酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したようにPPARα PPARγリガンド結合活性を測定した 結果は3 回の実験を平均化し 平均値土標準偏差を表した,p<0.Ol, 対対象の細胞群,p<0.Ol, 対しDL 添加の細胞群 7 一 (4) マクロファージにおける酸化 LDL による細胞内脂質 15d-PGJ2 検討 PPARα PPARγ の生体内のリガンドとしては長鎖脂肪酸が挙げられることから 酸化 LDL による PPARα PPA:Rγ 活性化の機序に 細胞内長鎖脂肪酸の関与が考えられた そこで今 回 酸化 LDLによる細胞内長鎖脂肪酸 ( アラキドン酸 オレイン酸 リノレイン酸 ドコサヘキサエン酸 ) の変化量を検討した 興味深いことに 酸化 LDLにより細胞内のこれら長鎖脂肪酸は減少していた ( 表 3) このことから 酸化 LDLによるPPARs 活性化への長鎖 39

46 脂肪酸の関与は否定的であった contro1 Ox-LDL LDL alachidonic acid( ド g/m1) 0.77 土 土 0.03 嚢 0.81±0.04 oleic acid(μ9/ml) L58± ±0 08 慶 1.63 土 inOleiC acid( ド 9/ml) 0.52± ±0 OP 0.57±0.04 docosahexaenoic ac 重 d(μg/ml) 0.55 土 ±0.02 嚢 0.58±0.05 表 3: 酸化 LDLによる細胞内脂肪酸量への影響 RAW 264.7cellに40μglm1の酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 細胞を回収し 材料と実験方法 に示したようにガスクロマトグラフィーにて 細胞内の脂肪酸組成を測定した 結果は3 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した t,p<0.ol, 対対象の細胞群 一方 COX-2 の過剰発現は PPARγ のリガンドである 15d-PGJ2 の増加を引き起こす可能 性が考えられるため 次に酸化 LDLによる細胞内 15d-PGJ2 生成量の変化を検討した 予想したとおり 酸化 LDL(40μg/m1) は細胞内 15d-PGJ2 含有量を著明に増加させた さらに COX-2の特異的阻害剤 (NS-398 meloxicam) やCOX-2 sirna 処置にて この15d-PGJ2 生成量の増加は有意に抑制された また ERK 1/2を特異的阻害剤 (PD98059) やDN-ERK I/2 処置で阻害しても この増加は有意に抑制された ( 図 7-1) また 酸化 LDLは15d-PGJ2だけでなく PGE2 PGD2も著明に増加させた ( 図 7-2) 一方 酸化 LDLはPPARαを活性化し COX-2を阻害するとこの活性化が抑制されることから 15d-PGJ2がPPARαも活性化するのではないかと考えられた そこで 15d-PGJ2に よる PPARα PPARγ 活 1 生三二を検討したところ 15d-PGJ2 は PPARγ だけでなく PPARα も その濃度依存性に活性化した ( 図 7-3) また 酸化 LDL 中の 15d-PGJ2 含有量を測定したと ころ LDL 中の 15d-PGJ2 含有量と比較して著明に低く ( 酸化 LDL 中の 15d-PGJ2 含有量 :LDL 中の 15d-PGJ2 含有量 0.55 ng/ml protein:2.3 ng/ml protein., P<0,01) この酸化 LDL 中の 15d-PGJ2 は PPA:Rα PPARγ 活性にほとんど影響していないと考えられた 40

47 O 嶋 )ユ8 りU ε 1р嘱剛コ=OO煽 脚ω叫一〇 r1 創 m) 1眉り} 邸ε門=一 OO邸 一 A (一30 O20 10 o Ox-LDL 一t t t C 60 ( 一 ) (+) (+) (+) (+) (+) PD SB NS mel 〇>O幽N m )ユ, O甲 6剛コ=1O歪一=B 言 e3.20 Ox-LDL 10 o ( 一 ) (+) LacZ LacZ * t (+) DN 一 ERK (一ξ 陶o p38 *t (+) Ox-LDL ( 一 ) (+) sirna cont cont COX-2 図 7-1=マクロファージにおける酸化 L 肌による15d-PGJ, 生成量の検討 RAW264.7 細胞に 材料と実験方法 に示したように10μMのNS FtMのmeloxicam 20μMの PD98059と10 pcmのsb203580で1 時間前処理後 (A) またはDN-ERKI/2 DN-p38MAPK LacZを 感染後 (B) またはCOX-2 sirnaを細胞内に導入後 (C) 40μglmlの酸化 LDLを添加し 24 時間 培養後 材料と実験方法 に示したようにEIA 法にて 15d-PGJ2を測定した 結果は4 回の実験を 平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対対象の細胞群, p<0.ol, 対 LDL 添加の細胞 群 41

48 一〇 рn N口m) 6 ε5 一〇〇6 Un圃q川 m) 超一5ε Oр一一〇〇邸 一あ呂 旧り060=旧噌り 旧ρ.眉 邸O旧一匡イ帖店A (幽葦O10 =5 o B 含 O10 =5 o Ox-LDL ( 一 ) (+) Ox-LDL ( 一 ) (+) 図 7-2: マクロファージにおける酸化 LI) しによるPGE2 PGD, の検討 RAW264.7 細胞に40μg!mlの酸化 LDLを添加し 24 時間培養 材料と実験方法 に示したようにEIA 法にて PGE2(A) PGD2(B) を測定した 結果は4 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対対象の細胞群 (16 嘱儲ω14 6Ω眉12 剛O 10 隔 8 匡 o Z Ga14-chimera PPARct 國 Ga14-chimera PPARγ 15d-PGJ { 醐 } 一 } O 図 7-3: マクロファージにおける15d-PGJ2によるPPARα PPARγ 活性化の検討 RAW264.7 細胞に15d-PGJ2を示した濃度添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように PPARα PPARγリガンド結合活性を測定した 結果は4 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した ト ルρ<0.Ol, 対対象の細胞群 42

49 7 一 (5)Apo:E ノックアウトマウスの動脈硬化病変における COX-2 15d-PGJ2 発現と PPARα PPARγ 活性化の検討 まず 通常食を 24 週間与えた ApoE ノックアウトマウスと WT マウスの血漿脂質を比較検 討した 血漿の Total cholesterol(tc) は Apo:E ノックアウトマウスで約 7 倍に上昇していた 一方 HDL-cholesterol(HD:L-C) 中性脂肪 (TG) には差を認めなかった ( 表 4) Body weight (g) TC (mg/dl) TG (mgldl) HD レ C(mg/dl) WT (n =10) 24.4± 土 土 士 8 apoe 一 一 (n= 9) 25.8± 土 82* 55 士 27 48±6 表 4:WT マウスと ApoE ノックアウトマウスの血漿脂質プロフィール結果は 4 匹の結果を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対 TC, total cholesterol; TG, triglycerides; HDL-C, HDL cholesterol. 対象 次に動脈硬化病変を組織学的に検討した ApoE ノックアウトマウスの大動脈洞には WT マウスと比較して Oil red O 陽性の明らかな動脈硬化病変が存在しており またこの動脈 硬化病変部には マクロファージの局在に一致した酸化 :LD: しの存在を認めた ( 図 8-1) さらに ApoE ノックアウトマウスマウスと WT マウスの大動脈洞の COX-2 15d-PGJ2 の発現 PPARα PPARγ 活 1 生化を検討したところ WT マウスに比し ApoE ノックアウトマ ウスでは COX-2 15d-PGJ2 発現が増加しており PPARα の転写活性は 2.55 倍 PPARγ の転写 活性は 2.28 倍に増加していた ( 図 8-2) 43

50 纏聯 曳.鐘.譲達 ぜ攣燕贈.撃騨鞍駁匿磁響退藩無瓢 写底奏 姶轟ヂワット.,点ψ 畑ト ル物鯵鱒綿 ///////////iiilllllllil,,1/tt,illllllllli 11iliiil 11ill illillllilllflllll: i c: Hee. il d: CDIlb 歴繁幡郭轡も 1 ゼ 鷲 5 誰毒睡子 論議 5 ゴ瓢捕 e: Ox-LDL f: cont 籠綾軋 鴬國溜竃虹無アールち牽嚇謡.鞠 キロ 繍6 絃陶窺嵐績ψ キロ風乱餅岬垂 ン嘗 轄礎亀叩爾剤〆瞬麟一 攣ゴ脚,. ポ篠噛 轡 嬢.漕砧トン瓶ミリ.瀞謹ノ, 濯伽 一 額騨躍名. キロ舗キロ ゴ勲 5 罐鞍一アールイ寄E 凱O F.図 8-1=WT マウスと ApoE ノックアウトマウスの動脈硬化巣病理所見 a,wt マウス,b, ApoE ノックアウトマウスの大動脈洞の Oil red O 染色 ( 60) c,d, e, f ApoE ノックアウトマウスの大動脈洞免疫染色 ( 200) c, HE. 染色 d, CD l lb 免疫染色 e, 酸化 LDL 免疫染色 f, コントロール 44

51 A. 騨 21i 轍礪 i 細細礫ミ.β,qqtin s 慧 鼎彫達 繊 黙黙繊 _ w qpoe7i 一. B 一=旧O}O O ξoω一石>o O匹墨眉嶋甲 6一5=OO6お=圏WT apoe 一含雨ω邸Ω眉 O N墜 轟UO}c o 3 9 -含邸ω邸6一一り O ω赤く 一 一 O>一旧 旧UOイ o WT apoe-i 一 WT apoe-1 一図 8-2:ApoE ノックアウトマウスにおける COX 2 15d-PGJ2 発現 PPARα PPARy 活性化の検討 ApoE ノックアウトマウスから 大動脈洞を採取し A, 材料と実験方法 に示したように COX-2 の蛋白発現をウェスタンプロット法にて検討した B, 採取した大動脈洞を 材料と実験方法 に示したように EIA 法にて 15d PGJ2 を検討した C, 採取した大動脈洞を 材料と実験方法 に示したように ELISA 法にて PPARα PPARγ 活性化を検討した *.ρ<0.ol 対対象の細胞群 7 一 (6) マクロファージにおける PPARα PPARγ 阻害による酸化 L,D しによる ABCA-l mrna 発現の検討まず 酸化 LDL による PPAR.α PPARγ 活性化に対する PPARα PPARγ アンタゴニストの適正濃度を検討するため PPARα のアンタゴニスト GW6471 PPARγ のアンタゴニスト TOO70907 の酸化 LD: しによる PPARα PPARγ 活性化に対する抑制効果を検討した ( 図 9-1) GW6471 は 0.5μM の濃度で PPARγ のリガンド結合活性に影響することなく PPARα のリガ 45

52 書 旧ぢ雨2旧要旧ρ-眉器O旧一二く 需 眉O邸O=旧眉=旧ρ 眉=6 旧剛匡 一 1ンド結合活 1 生を抑制した しかし 1pMの濃度ではPPARαリガンド結合活性だけでなく PPA:Rγリガンド結合活 1 生も完全に抑制した 一方 TOO70907は0.Ol pm 以上の濃度で酸化 LDLによるPPARγのリガンド結合活性を完全に抑制した 意外なことに 1μMのTOO70907 はPPARαのリガンド結合活 1 生を増加した これらのことから PPARαを特異的に抑制する GW6471 の濃度は 0.5μM PPARγ を特異的に抑制する TOO70907 の濃度は 0.OlμM と考えられ た A 67 5(一6ω62眉幽O コ 配 4 B 67 一 A GAL4-PPARct 一 GAL4-PPARy 32ワ五一一 ら 匿 GAL4 幽 PPARα 金 GAL4-PPARγ ナ 21 (圏煽亀ゆ雨Ω眉隔O 匡 54 3_, 五 レ潅 * * 嚢 嚢 一0 OiO O.O O.1 O O.OOO O.OO O.O O.1 1 GW6472 (pm) TOO70907 (pm) 図 9-1 酸化 LDLによるPPARα PPARγ 活性化に対するPPARα PPARγ 阻害剤の効果 RAW264 7 細胞に示す濃度のPPARαの阻害剤 GW6472(A) PPARγ 阻害剤 TOO70907(B) を示した濃度添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように PPARα( ) PPARγ( ) リガンド結合活性を測定した 結果は4 回の実験を平均化し 平均値 ± 標準偏差を表した,p<0.Ol, 対対象の細胞群 次に 酸化 LDL による ABCA1 発現における ERK 1/2 COX-2 の役割を検討した マウスの 腹腔マクロファージにおいて 40μ9/ml の酸化 LDL は A:BCA1 の mrna 発現を著明に増加させ その効果は COX-2 の阻害剤 NS-398(NS) ERK1/2 の阻害剤 PD98059(PD) にて抑制を受 けた また 0.5μM の PPARα 阻害剤 GW6471(GW) 0.01μM の PPA:Rγ 阻害剤 TOO70907 で は この増加を部分的に抑制し PPARα PPARγ 共に抑制することにより相加効果が認め られた 同様の効果を PPARα PPA:Rγ の sirna を用いて検討した PPARα PPARγ の sirna 46

53 OX処置にてマクロファージ内の PPARα PPARγ 発現はそれぞれ 72% 77% に減弱した また PPARγ の sirna は PPARγ1 PPARγ2 ともに抑制した この PPARα PPARLγ sirna 処置細胞で は コントロールと比較して 酸化 LDL による ABCA1 の mrna の発 i 現を著明に抑制し PPAR.α PPARγ ともに阻害することにより相加効果が得られた ( 図 9-2) A s ( 隅 Uω6暑圏9<歪 ミO 理o Ox-LDL lnhibitors c D一隔}{ PPARct B-actin sirna PPARγ2 t t (+) (+) (+) ( 一 ) PD NS 1 獺嚢鱒麟璽 v 鞭灘 i con ct PPARγ1 鯉 灘簾 に ひ解擁織鰯欄頴 β actin 羅郷覆灘轍撒灘 i sirna con y B s 含応ω2コε くZ匡 }くOロく4321ODL D( 6ω8コε <Z匡 甲くO暫 くo ( 一一 ) (+) (+) (+) (+) #### Ox-LDL ( 一 ) (+) (+) (+) (+) sirna con con ct y ct+y 図 9-2: マウス腹腔マクロファージにおける酸化 L ) しによるABCAI 発現の検討 マウス腹腔マクロファージにERK l/2 阻害薬 PDOO70907(PD) COX-2 阻害薬 NS-398(NS) (A) PPARαの阻害剤 GW6472(GW) PPARγ 阻害剤 TOO70907(T)(B) で1 時間前処理 もしくは PPARα PPARγのsiRNAを感染 (C, D) 後 20μg!mlの酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように PPARα PPARγの蛋白発現をウェスタンプロット法 (C) にて ABCAIのmRNA 発現 をRT-PCR 法 (A, B, D) にて測定した *, p<0.ol, 対対象, p<0.ol, 対酸化 LDL 添加の細胞群,p<O.Ol, 対 酸化 LDLとGW 若しくはT 添加の細胞群 #,<0.Ol, 対 酸化 LDL 添加の細胞群 ##, p<0 01, 対酸化 LDLとPPARα PPARyのsiRNAを感染させた細胞群 47

54 ##7 一 (7) マクロファージにおける酸化 LDL による MCP 1 mrna 発現における PPAR 活 1 生化の 検討 次に PPARα PPARγ のアンタゴニストを用いて酸化 LDL による MCP-l mrna 発現に対す る各種阻害剤の効果を検討した マウスの腹腔マクロファージにおいて 40μg/ml の酸化 LDL は MCP-1 の mrna 発現を 4.7 倍増加した PPARα の阻害剤 GW6472(GW) PPARγ 阻害 剤 TOO70907(T) にて MCP-1 の mrna 発現は増加し PPARα PPARγ を同時に阻害すること で MCP-1 の mrna 発現を相加的に増加させた ( 図 10-1) A Oヒ<Z匡 甲,乱O雪Ox-LDL B 14 自何ω邸Ω眉隔Oヒ<Z }一 OOx-LDL * ## o o ( 一 ) (+} (+) (+) (+) sirna ( 一 ) (+) (+) (+) (+) con con ct y ctty 図 10-1: マウス腹腔マクロファ v 一ジにおける酸化 L 肌による MCP-1 発現の検討マウス腹腔マクロファージに 材料と実験方法 に示したように PPARα の阻害剤 GW6472(GW) PPARγ 阻害剤 Too70907(T) で 1 時間前処理 (A) 若しくは PPARα PPARγ の sirna を感染後 (B) 40μglml の酸化 LDL を添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように MCP-1 の m:rna 発現を RT.PCR 法にて測定した, p<0.ol, 対対象 t, p<0.ol, 対酸化 LDL 添加の細胞群, p< 0.Ol, 対酸化 L 肌と GW 若しくは T 添加の細胞群瓶く 0.Ol, 対酸化 LDL 添加の細胞群 ##, p<0.01, 対酸化 LDL と PPA:Rα PPARγ の sirna を感染させた細胞群 酸化 LDL はマクロファージにおいて抗炎症作用を呈することが報告されている (Hamilton et al.1995,0hl sson et a11996) PPARα PPARγ が この酸化 LDL による抗炎症 作用に関与しているかを検討するために LP S による MCP-1 mrna 発現に対する PPARα 48

55 B( 6ω8コε くZ匡 τ店o1a含6ω邸ωコ <Z匡 }, O1PPARγ 特異的阻害の効果を検討した 1μg/mlのLipopolysaccharide(LPS) 刺激にて マウス腹腔マクロファージにおいて MCP-1 のmRNA 発現は10.5 倍に上昇したが 酸化 LDLはこの上昇を抑制した PPARα 阻害剤 GW6472(GW) PPARγ 阻害剤 TOO70907(T) はこの抑制を著明に回復させ GW6472 TOO70907でPPARct PPARyを共に抑制すると 相加的に回復した また PPARα PPARy の sirna はそれぞれコントロールと比較して 酸化 LDL による MCP-1 mrna 発現抑制を著 明に回復し PPARα PPARγ を共に sirna にて処理することにより その回復には相加効 果がみられた ( 図 10-2) LPS ( 一 ) (+) (+) (+) (+) (+) LPS (ny 一一 ) (+) (+) (+) (+) (+) Ox-LDL ( 一 ) ( 一 ) (+) (+} (+) (+) Ox-LDL ( 一 } ( 一 ) (+) (+) (+) (+) sirna con con con ct y ct+y 図 10-2:LPSによるMCP-1 発現誘導に対する酸化 mしの効果マウス腹腔マクロファージに 材料と実験方法 に示したように PPARαの阻害剤 GW6472(GW) PPARγ 阻害剤 Too700907(T) で1 時間前処理 (A) 若しくは PPARα PPARγのsiRNAを感染後 (B) 40pg 〆 mlの酸化 LDLを添加し 24 時間培養後 材料と実験方法 に示したように MCP-1のmRNA 発現をRT-PCR 法にて測定した *, p<o.o l, 対対象, p<0.ol, 対酸化 LDL 添加の細胞群, p< 0.Ol, 対酸化 LDLとGW 若しくはT 添加の細胞群 #,<O.Ol, 対酸化 L 肌添加の細胞学 ##, p<0,01, 対酸化 LDLとPPARα PPARγのsiRNAを感染させた細胞群 一方 MCP-1 の発 i 現は転写因子の一つである NF-KB の活 1 生化に誘導を受けることが報告さ れている (Ueda et al.1997) そこで次に 酸化 LDL による NF 一田の活性化について検討し 49

56 ## 詔 署06m図1 た 40μg/mlの酸化 LDLによりNF-KBの活性化は上昇した PPARα PPARγをそれぞれsiRNA で阻害すると この活性化の上昇は増強され PPARα PPARγをともにsiRNAで抑制すると 相加的な増強効果が認められた さらに1μg/mlのLPSはNF-mbの活性化を上昇させるが 酸化 :LDLはこの活性化の上昇を抑制した PPARα PPARγをそれぞれsiRNAで阻害すると この活性化の抑制は回復し PPARα PPARyをともにsiRNAで抑制すると 相加的な回復効果が認められた ( 図 10-3) A 溜 旧り06口図 5 奮6ω4 6Ω眉 3 O匹 2 Zコ匡 1 ## B lo 8スω6Ω噌U闇O 隔 4( 匡Z 2 6* * 嚢 # 一 一 ## o Ox-LDL ( 一 ) (+) (+) (+) (+) sirna con ct y ct+y o LPS ( 一一 ) (+) (+) (+) (+) (+) ( 一 ) ( 一 ) (+) (+) (+) (+) Ox-LDL sirna con ct y ct+y 図 10-3:NF-KB 活性に対する酸化 LDLの影響マウス腹腔マクロファージに 材料と実験方法 に示したように PPARα PPARγ LacZのsilVNAを感染後 40μg!mlの酸化 LDLを単独添加し24 時間培養後 (A) または 40μg!m lの酸化 LDLとlpglm 1 のlipopolysaccharide(LPS) を同時に添加し24 時間培養後 (B) 材料と実験方法 に示したように NF KBの活性を測定した, p<0.ol, 対対象,p<0.Ol, 対 LPS 添加の細胞群 #, p<0.ol, 対酸 化 LDL と PPARα PPARγ LacZ の sirna を感染させた (LPS 添加の ) 細胞群 ##, p<0,01, 対酸化 LDL と PPARα PPARγ の sirna を感染させた (LPs 添加の ) 細胞群 50

57 8. 考察 酸化 :LDL と PPARs の活性化 これまで 酸化 LDL による PP ARα PPARy の活 1 生化には酸化 LDL に含まれる 9-HODE 13-HODE 酸化リン脂質などが その直接的なリガンドとなり活 1 生化を誘導すると報告さ れてきた (Lee et al.2000, Nagy et al.1998) しかし今回の検討により 酸化 LDL による PPARα PPARγ の活性化には COX-2 の過剰発現も関与していることが考えられた 酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化が LDL の酸化の程度に起因しているかを検討す るため 酸化の程度を弱めた mildly oxidized LDL(m-Ox-LDL) を用いて検討した すると m-ox-ldl でも著明に PPARα PPARγ の活性化を誘導することから 酸化 LDL による PPARα PPARy の活性化にはその :LDL の酸化に起因するものと考えられた さらに 硫酸銅による LDL の酸化よりも 動脈硬化病変でより生理的に起こっていると思われる マクロファー ジの存在下で酸化を誘導した macrophage-mediated Ox-LDL(Mm-Ox-LDL) を作製し その効 果を検討したところ やはり同様に PPARα PPARγ の活性化が認められたことから 実際 に動脈硬化巣において 酸化 LDL による PPAR の活 1 生化が引き起こされている可能性が考 えられる 酸化 :LD: しによる PPARs 活性化機序一 COX-2 の関与 COX-2 は prostaglandin(pg) 合成における律速酵素であり アラキドン酸から PGG2 を 経て PGH2 までの合成に関与している (Campbell W B et al.1996) 酸化 LDL, が単球 マク ロファージにおいて COX-2 の発現を誘導することは既に幾つか報告されている (Pontsler et 51

58 al. 2002,Claus et al.1996) が その詳細な機序 臨床的意義については不明な点が多く残 されていた 今回の検討により マクロファージにおいて酸化 LDL が COX-2 の発現を誘導 : するが こ の時 酸化 LDL により誘導される p38mapk の活性化は関与せず ERK 1/2 の活性化が関与す ることを見出した さらに 酸化 LDL による PPARα PPARy の活性化は COX-2 ERK1/2 の 阻害により有意に阻害されることから マクロファージにおいて 酸化 LDL による PPARα PPARγ の活性化は EPK 1/2 を介した COX-2 の発現に起因すると考えられた 興味深いことに 申請者らはスタチン製剤が PPARα PPARγ の活性化能を持つこと その機序に COX-2 の過 剰発現が関与することを報告している (Yano et al.2007) これらの事象は COX-2 の過 剰発現に繋がる細胞応答には PPARα PPARγ 活性誘導の可能性が存在することを示唆し ている 様 々な刺激による COX-2 の転写調節機構としては 転写因子である CCAAT/enhancer-binding protein 一 β(c/eb 耶 ) や AP-1 の関与が報告されている 一方 今回 の検討で COX-2 発現には ERK1/2 が関与することを見出したが この AP-1 や C 旭 BPβ の活性 は MAPK のシグナル伝達により制御されていると考えられている このことから 酸化 LD: し による COX-2 発現には これら転写因子の関与が予想される 今後 これらの証明のため にさらなる検討を行う予定である 酸化 :LD: しによる PPARs 活性化機序 一 ERK I/2-COX-2 シグナルを介した 15d-PGJ2 産生の関与 本研究では 酸化 LDL による COX-2 の発現が細胞内の 15d-PGJ2 を増加させることを見出 した さらに 酸化 LD:L は 15d-PGJ2 のみならず PGD2 PGE2 も増加させることから 酸化 LDL による COX-2 発現は PG の下流のシグナルを調節していると考えられる 15d-PGJ2 が 52

59 PPARγ の強力なリガンドであることは良く知られているが Forman らは 15d-PGJ2 が PPARα の直接的なリガンドではないが PPARα の活性化能を持ちうることを報告しており (Forman et al.1997) この点は本研究の実験結果と一致している このことにより COX-2 による 15d-PGJ2 の増加は酸化 LDL による PPARα PPARγ 活性化の機序の一つと考えられる 様々な動脈硬化巣には COX-2 の産生増加が認められること さらには LDL 受容体欠損マ ウスにおいて COX-2 を選択的に阻害すると 動脈硬化病変の形成を抑制すること (Burleigh et al.2002) などから これまで COX-2 は動脈硬化症の促進因子であると考えられてきた しかしながら 最近の研究では ヒトにおいて COX-2 阻害薬が動脈硬化病変を減少させず 反対に心血管イベントを増加させる (FitzGerald.2004, Furberg et al. 2005, Wong et al.2005) ことが報告されている 本研究の結果からも COX-2は15d-PGJ2などのある種のエイコサノイド産生誘導の結果 PPARsの活 1 生化を介して動脈硬化症に対し抑制的に働いている可能性が考えられる さらに本研究では ApoEノックアウトマウスを用いた検討で マクロファージに一致した酸化 LDLの存在する動脈硬化病変でのPPARα PPARγの活性が有意に上昇していることを見出した 同部位においてCOX-2の発 i 現が増加していることも示した が これは既存の報告 (Burleigk et al.2002, HernAndez-Presa 2002, Palinski et al.1989) と一 致したものである 加えて 本研究では 動脈硬化病変において 15d-PGJ2 の発現の増加 が認められることをしていることを確認している これらのことから in vivo においても この酸化 LDL が COX-2 を介した 15d-PGJ2 の増加により PPA:R α PPARγ を活性化している 可能性が考えられる 一方 cox-2 sirna の処置により酸化 LD: しによる cox-2 発現は 86% 抑制されるものの 酸化 LDL による PPARα PPARγ の活性化はそれぞれ 50% 程度しか抑制されず さらに COX-2 やERK 1/2の阻害剤が酸化 LDLによる細胞内 15d-PGJ2 含有量の増加を80% 以上抑制するものの PPARα PPARγの活性化は同様に50% 程度にしか抑制しないことから 酸化 LDLによるPPARα PPA:Rγの活性化にはCOX-2 以外の機序が存在する可能性が考えられた これま 53