Site-directed mut agenesis system Mutan-K Enzyme Set

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かずまさますはら
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1 製品コード 6060 Site-directed mutagenesis system Mutan -K Enzyme Set 説明書

2 Mutan - K は Kunkel 法 1 )2 ) をシステム化し Site-directed mutagenesis 3 )4 ) を行なえるようにしたキットですこのキットによって DNA の塩基置換欠失挿入などが行なえ遺伝子やタンパク質の機能解析構造改変などに威力を発揮します I. キットの構成 Enzyme Set ( 20 回分 ) 20 保存 1.Annealing Buffer...20 μl 200 mm Tris-HCl( ph8.0 ) 100 mm MgCl2 500 mm NaCl 10 mm DTT 2.Extension Buffer500 μl 50 mm Tris-HCl( ph8.0 ) 60 mm 酢酸アンモニウム 5 mm MgCl2 5 mm DTT 0.1 mm NAD 0.5 mm each dntps( A, C, G, T ) 3.E. coli DNA Ligase( 60 U/μl )...20 μl 4.T4 DNA Polymerase( 1 U/μl )...20 μl 5.Control ssdna 溶液 A( 0.2 pmol/μl )... 5 μl M13mp11 am16 の一本鎖 DNA( dut -, ung - 株より調製 ) 6.Control ssdna 溶液 B( 0.2 pmol/μl )... 5 μl puc119 am16 の一本鎖 DNA( dut -, ung - 株より調製 ) 7.Control Synthetic Oligonucleotide Solution( 1 pmol/μl )... 5 μl 5' 末端リン酸化済み 5 pggttttcccagtcacg 3 2

3 II. 原理 Kunkel 法の原理を図 1 に示す E. coli CJ236 は F', dut -, ung - の大腸菌で dutpase (Dut) と Uracil-DNA glycosylase ( Ung ) を欠損しているそのため DNA 中の Thymine (T) の一部が deoxyuracil (du) におきかわった DNA を合成するこの CJ236 を宿主菌として変異導入の目標となる遺伝子をクローニングした M13 ファージの一本鎖 DNA を調製する続いてこれに変異導入用の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により相補鎖を合成するこの DNA を ung + の muts 株に導入すると DNA のミスマッチを抑えながらもとの du の含まれている側の DNA は Ung によって分解を受けるが in vitro で合成された相補鎖の側は分解されずに複製されているこのようにして DNA が選択を受け変異の導入されたファージが得られるこの方法は一本鎖 DNA として回収できるプラスミドベクター ( puc118/119 など ) を用いても行なうことができる ( プラスミドベクターを用いた場合はファージベクターに比べて 5 10 % 程度変異率が下がる ) 図 1.Kunkel 法の原理 3

4 III. 操作 A. ファージベクターの場合 1. キット以外に必要な試薬類 M13 mp 18 RF DNA( 製品コード 3118 ) E. Coli MV1184 M9 glucose 培地 : Na2HPO4 6 g/l KH2PO4 3 g/l NaCl 0.5 g/l NH4Cl 1 g/l thiamine * 1 mg/l MgSO4 * 1 mm CaCl2 * 0.1 mm glucose * 0.2 % * これらは別々にオートクレーブし無菌的に混合する M9 glucose plate: M9 glucose 培地に agar を 1.5 % 加える LB 培地 ( ph7.0 ): Bacto tryptone 10 g/l Bacto yeast extract 5 g/l NaCl 5 g/l LB-soft agar: LB 培地に agar を 0.6 % 加える LB plate: LB 培地に agar を 1.5 % 加える 2 YT 培地 ( ph7.6 ): Bacto tryptone 16 g/l Bacto yeast extract 10 g/l NaCl 5 g/l テトラサイクリンストレプトマイシンクロラムフェニコール NaCl/PEG 溶液 :2.5 M NaCl, 20 % ポリエチレングリコール #6000 TE Buffer( ph8.0 ):10 mm Tris-HCl( ph8.0 ), 1 mm EDTA 中和フェノール 3M 酢酸アンモニウム, ph8.0 クロロホルムイソアミルアルコール 70 % エタノールイソプロパノール 0.2 M EDTA( ph8.0 ) 滅菌水変異導入用合成オリゴヌクレオチド: DNA プライマー合成の依頼はタカラバイオ ( 株 ) ドラゴンジェノミクスセンターで承っております ( TEL FAX ) E. coli BMH71-18 muts Competent Cells ( 製品コード 9054 ) E. coli CJ236 Competent Cells( 製品コード 9053 ) コンピテントセルの形質転換効率が低いと十分な数のコロニーが得られないのでできるだけ効率のよいもの ( > 10 6 cfu/μg DNA ) を使う必要がある 2. 菌株の説明 CJ236 dut1, ung1, thi-1, rela1/pcj105( F'Cm r ) dut -, ung - の host strain で DNA 中の一部の Thymine (T) が deoxyuracil (du) におきかわった DNA を合成するための host strain であるこの菌株で変異を導入したい一本鎖 DNA を調製する BMH71-18 mut S ( lac-proab ), supe, thi-1, muts 215:: Tn10( tet r )/ F trad36, proab +, lac I q, lacz M15 mut S のためミスマッチの修復能が低下している株で合成オリゴヌクレオチドにより変異を導入した DNA をミスマッチを修復せずに固定するための host strain であるこの株でプラスミドを長期間保持させると目的以外の変異が入る可能性があるのでプラスミドの保持はなるべく短時間にする 4

5 MV1184 ( lac -pro AB ), ara, rpsl, thi ( φ80 lac Z M15 ), ( sr1 -reca )306:: Tn10( tetr )/ F trad 36, pro AB +, lac I q, lac Z M15 変異を導入固定した DNA を保持させ一本鎖 DNA 調製のための host strain である 3.dU を含む ssdna の調製 ( 1 ) 変異導入の目標となる遺伝子を M13mp18 DNA にクローニングし E. coli CJ236 Competent Cells にトランスフェクションしてプラークを形成させる ( 2 ) シングルプラークを CJ236 * の培養液 1 % を含む 2 YT 培地 ( クロラムフェニコール 30 μg/ml を含む )3 ml に接種し 37 で 6 時間培養する ( 3 ) 遠心分離で上清を回収する ( 4 保存可能 ) ( 4 ) この培養上清 1 ml を CJ236 の培養液 1 % を含む 2 YT 培地 ( クロラムフェニコール 30 μg/ml を含む )100 ml に接種し 37 で 6 時間培養する ( 5 ) 遠心分離で上清を回収する ( 一部を取り CJ236 と MV1184 を指示菌にしたときのタイターを測定しておく CJ236 に対して約 pfu/ml で MV1184 * に対するよりも倍高ければよい ) ( 6 ) 上清に NaCl/PEG 溶液 25 ml を加え撹拌し室温で 10 分間放置する ( 7 ) 遠心分離 ( 8000 g, 10 分 ) し沈殿を集める遠心は室温で行なう ( 8 ) TE Buffer 5 ml に溶かし等量の中和フェノールを加えて撹拌後 10 分間静置する ( 9 ) 遠心分離 ( 8000 g, 10 分 ) し水層を回収する ( 10 ) 等量の中和フェノール : クロロホルム : イソアミルアルコール ( 25:24:1 ) を加えて撹拌後 10 分間静置する ( 11 ) 遠心分離 ( 8000 g, 10 分 ) し水層を回収する ( 12 ) 等量のクロロホルム : イソアミルアルコール ( 24:1 ) を加えて撹拌後 10 分間静置する ( 13 ) 遠心分離 ( 8000 g, 10 分 ) し水層を回収する ( 14 )3M 酢酸アンモニウム ( ph8.0 ) を 500 μl イソプロピルアルコール 5 ml を加えて撹拌後遠心分離 ( 8000 g, 10 分 ) して沈殿を集める ( 15 ) 沈殿を 70 % エタノールで洗い減圧乾燥する ( 16 )TE Buffer 適当量に溶解し UV 吸収を測定する ( 260 nm/280 nm = がよい ) * CJ236 株 MV1184 株はコンピテントセルの一部を培養することによっても取得することができる取得した菌株を用いてグリセロルストックを作製しておくと便利である菌株は下記の方法で培養保存するとよい CJ236 L-plate( クロラムフェニコロール 30 μg/ml を含む ) 上で 37 一晩培養しシングルコロニーを形成させるコロニーを L-broth ( クロラムフェ二コール 30 μl/ml を含む ) で 37 一晩培養し培養液 1.5 ml を 20 % グリセロール溶液 1.5 ml と混合して 80 で保存するコロニーを作らせたプレートは 4 で保存可能だが一週間以上古いものは避ける MV1184 M9 glucose plate( テトラサイクリン 10 μg/ml ストレプトマイシン 30 μg/ml を含む ) 上で 37 一晩培養しシングルコロニーを形成させるコロニーを M9 glucose 培地 ( テトラサイクリン 10 μg/ml ストレプトマイシン 30 μg/ml を含む ) で 37 一晩培養し培養液 1.5 ml を 20 % グリセロール 1.5 ml と混合して 80 で保存する 5

6 ( 参考 )( 7 ) と ( 8 ) の操作の間に以下の操作を加えると純度の高い一本鎖 DNA が調製できるので変異導入の効率が高くなる 10 ml の 100 mm Tris-HCl, ph7.6, 10 mm MgCl2 の溶液に溶かし DNase I を 100 μg/ml, RNase A を 10 μg/ml となるように加える 37 で 1 時間インキュベートする 2.5 ml の NaCl/PEG 溶液を加え室温で 10 分間放置する遠心分離により沈殿を集める ( 室温で行なう ) 4. 変異導入用合成オリゴヌクレオチド変異の導入は変換したい塩基を中心にして前後に 8 10 塩基全体で塩基程度のシーケンスプライマーグレードの合成 DNA( 5' 末端リン酸化済 ) を用いる欠失挿入または多数の塩基置換を行なう場合はミスマッチをしているところより前後に塩基のプライマーを合成するまた 3' 末端は A,T より G,C が望ましい用いる合成 DNA が変異導入に適したものかどうかの検定は 3. の ssdna を鋳型にしこの合成 DNA をプライマーにして dideoxy sequencing を行なった時に明瞭なラダーが見られるかどうかで判定するのがよい 5. 相補鎖の合成 ssdna Annealing Buffer 滅菌水 Total 0.2 pmol 1 μl X μl 10 μl ( 1 ) 上記の ssdna 溶液 1 μl とリン酸化した変異導入用合成オリゴヌクレオチド溶液 1 μl( 1 pmol/μl ) を混合し分分間静置する ( 合成オリゴヌクレオチドの配列鎖長などによりアニーリングの温度を調製した方がよい場合があるポイントミューテーション程度ならこの条件よいが欠失挿入などミスマッチが多くなる程アニーリングの条件は重要になる ) ( 2 )25 μl の Extension Buffer, 60 U の E. coli DNA Ligase, 1 U の T4 DNA polymerase を加え 25 2 時間静置する ( 3 )3 μl の 0.2 M EDTA, ph8.0 を加え 65 )5 分間静置する ( 20 保存可能凍結融解は繰り返さないようにする ) 6. トランスフェクション ( 1 )E. coli BMH71-18 muts コンピテントセルを 100 μl と 5. の DNA 溶液 10 μl を混合し 0 30 分間秒分間静置する ( 2 )37 の SOC 培地を加えて 1 ml とし 37 で一時間振とうするトランスフォーメーション効率の悪いコンピテントセルを使用する場合は 2 3 時間振とうするこの時通気撹拌が悪いとファージの回収が悪くなる ( 3 ) 遠心分離で上清を回収し 10, 10 2, 10 3 倍の希釈液を作る ( 4 ) 希釈液 100 μl MV1184 培養液 ml LB-soft agar 3 ml を混合し LB-plate に重層する ( 5 )37 で静置してプラークを形成させそのうちのいくつかから ssdna を調製しシーケンスを行なってミュータントを確認する 6

7 B. プラスミドベクター ( puc118/119 ) の場合 1. 試薬類 ( A. 以外に必要なもの ) puc118/119 DNA( 製品コード 3318/3319 ) M13KO7 ファージ液 ( pfu/ml ) アンピシリンカナマイシン 2.dU を含む ssdna の調製 ( 1 ) 変異導入の目標となる遺伝子を puc118( または puc119 )DNA にクローニングしたプラスミドを作製し E. coli CJ236 Competent Cells にトランスフェクションして適当量を LB-plate( アンピシリン 150 μg/ml とクロラムフェニコール 30 μg/ml を含む ) にひろげ 37 でコロニーを形成させる ( 2 ) シングルコロニーを 2 YT 培地 ( アンピシリン 150 μg/ml とクロラムフェニコール 30 μg/ml を含む ) 前培養する ( 3 ) この培養液 1 ml を 2 YT 培地 ( アンピシリン 150 μg/ml とクロラムフェニコール 30 μg/ml を含む )100 ml に接種し M13KO7 ファージを m.o.i. = 2 10 で感染させる puc118 or puc119 にクローニングされたインサートによりクロラムフェニコールを入れると ssdna が回収できない場合があるその場合はクロラムフェニコールを抜いた培地で培養する通常の場合でもクロラムフェニコールを入れずに培養しても ssdna の収量には問題は無い ( 4 )37 で 30 分間静置後 70 μg/ml となるようにカナマイシンを加える ( 5 ) 時間振とう ( 200 rpm 以上 ) 培養する ( 6 ) 遠心分離で上清を回収する ( 7 ) 一部を取って適当に希釈した上清 20 μl と CJ236 あるいは MV1184 )80 μl を混合し分間静置したのち 50 μl を LB-plate( アンピシリン 150 μg/ml を含む ) にひろげて 37 で静置しコロニーを数えてタイターの測定を行なう CJ236 に対して約 pfu/ml で MV1184 に対するよりも倍高ければよい ( 8 ) この上清から A. と同様に ssdna を調製する * この ssdna を A. の場合と同様に相補鎖合成を行ない以下のようにトランスフォーメーションする 3. 形質転換 ( 1 )E. coli BMH71-18 muts コンピテントセル 100 μl と相補鎖合成を行なった DNA 溶液 10 μl を混合し 0 30 分秒分間静置する ( 2 )37 の SOC 培地を加えて 1 ml とし 37 1 時間振とう培養する ( 3 )30 μl の M13KO7 ファージを加え分静置する ( 4 ) この培養液をあらかじめ 37 にインキュベートした 2 YT 培地 ( アンピシリン 150 μg/ml とカナマイシン 70 μg/ml を含む )1 ml に % 接種し 37 で時間振とう ( 200 rpm 以上 ) 培養する ( 5 ) 遠心分離で上清を回収する ( 6 ) 倍に希釈した上清 20 μl と M9 培地で一晩培養した MV μl を混合し分間静置しそのうち 50 μl を LB-plate( アンピシリン 150 μg/ml を含む ) にひろげて 37 で静置する ( 7 ) 出来たコロニーのいくつかから DNA を調製しシーケンスを解析してミュータントを確認する 7

8 IV. コントロール実験 < 図 2 参照 > 原理 lac Z am16 変異は野生型の lac Z 遺伝子のコドン 16 のアンバーミュータントです M13mp11 am16 はこの変異が lac Z α ペプチドに導入してあるので α 相補性が発揮されず X-Gal を含んだプレートで白いプラークしか作れませんそこにアンバーコドン TAG をトリプトファンコドン TGG へ変換するように変異の導入をしてやると正しく変異のかかったものだけが青いプラークを形成できるようになりますこの青いプラークが全プラークに占める割合から変異効率が算出されます操作コントロール ssdna 溶液 ( A または B ) Annealing Buffer 滅菌水 1 μl 1 μl 8 μl 上記の溶液を操作手順の通りに処理し ssdna 溶液 A の場合は最後のプラーク形成のとき soft agar に 50 μl の X-Gal( 20 mg/ml ) 20 μl の IPTG( 0.1 M ) を加える通常 70 % 以上の青いプラークができる ssdna 溶液 B の場合は最後のコロニー形成の時 LB-plate に 20 μg/ml の X-Gal 0.2 mm の IPTG を加える通常 60 % 以上の青いコロニーができる図 2. コントロール実験の原理図 8

9 図 3.Mutan K のフローチャート Template DNA 溶液 ssdna 0.2 pmol 10 μl Annealing buffer 1 μl 滅菌水 1 μl 変異導入用オリゴヌクレオチド ( 1 pmol リン酸化済 ) 2 μl Annealing( 変異の導入 ) Extension 分分 25 μl Extension buffer 60 U E. coli DNA Ligase 1 U T4 DNA polymerase 25 2 時間 * extension 反応を確認する場合には * のステップを 2 倍の容量で行ない反応を停止させる直前に二等分して一方を全量電気泳動に使用する電気泳動で確認 3 μl 0.2 M EDTA( ph8.0 ) 65 5 分 sample dsdna 溶液 10 μl 100 μl E. coli BMH71-18 muts コンピテントセル 0 30 分秒分 890 μl SOC 培地 37 1 時間振とう ( ファージベクターの場合 ) ( プラスミドベクターの場合 :puc118/119 ) 30 μl M13KO7 ファージ遠心分培養液 μl 上清 10,10 2,10 3 倍の希釈液各 100 μl LB-plate プラーク 37 1 晩 Transfection or Transformation MV1184 の培養液 LB-soft agar ml 3 ml 50 μl 1 ml 2 YT 培地 ( +Ap, +Km ) 時間振とう遠心上清 10 5,10 6,10 7 の希釈液各 20 μl MV1184 の培養液 80 μl 分 LB-plate( +Ap ) 37 1 晩コロニーシーケンス解析ミュータントを確認 9

10 VIII.Q & A 1. 変異導入用プライマーの設計 Q1: 変異導入用プライマー設計ポイントは? A1: 変異の導入には変換したい塩基を中心にして前後に 8 ~ 10 塩基全体で 15 ~ 20 塩基程度のシーケンスプライマーグレードの合成 DNA をご使用下さいまた他の部位との相同性が高くならないように長さ等を調節しなければなりませんさらに 3' 末端は A, T より G, C が良いでしょう例えば連続した 3 塩基の変異導入を行なう場合には変異部分の両側に 10 塩基ずつ追加したものこの場合は 23 塩基プライマーで可能となりますまた変異導入部分以外のところが AT rich な場合 ( GC 40 % ) はさらに両側もしくは AT rich な側に 3 ~ 4 塩基追加する必要がありますアニーリング温度も何通りか検討するほうがいいでしょうなお変異導入用プライマーは必ず 5' 末端リン酸化済みのオリゴヌクレオチドをご使用下さい Q2: 変異導入用プライマーの適否の判定は? A2: 合成したプライマーを Dideoxy Sequencing にプライマーとして使用し明瞭なラダーが得られれば変異導入用プライマーとして利用できると考えられます Q3: 複数箇所の変異を導入する場合のプライマー設計は? A3: それぞれの変異部分の両端に 8 ~ 10 塩基ずつあることが望ましいですこの場合変異部分の両端が短いと難しい場合もあります 2. 目的断片のクローニングについて Q1: 目的のフラグメントがベクターにクローニングされているかどうか調べる方法は? A1: 3 つの方法が考えられます ( a ) フラグメントをベクターにライゲーションした時電気泳動でサイズを確認する ( b )ssdna を調製した時の電気泳動でサイズを確認する ( c ) その ssdna のシーケンスを確認するただし ( b ) の方法はゲル中の ssdna の挙動について不明な点が多いので注意を要します 3. ファージミドの調製について Q1: ヘルパーファージ M13 KO7 を使ってファージミドを調製する方法は? A1: 説明書本文中に記載の方法の他に次の方法のように始めに宿主とヘルパーファージを混合した後スケールアップすることも出来ますヘルパーファージを m.o.i. = 2 ~ 10 で感染させる手順 30 μg/ml クロラムフェニコールを含む培地で前培養を行なった CJ236 株の培養液 1 ml とヘルパーファージ M13 KO7( タイター = /ml 以上 )1 ml を混合し 37 で 30 分間静置する 2 YT 培地 100 ml [ 150 μg/ml アンピシリン 70 μg/ml カナマイシン ( ヘルパーファージ由来耐性 ) を含む ] に先の混合液を全量加える ( クローニングしたインサートによっては主培養でクロラムフェニコールを加えない方が良い場合がある ) 37 で 16 ~ 20 時間振とう培養するこの操作でだいたい m.o.i. = 2 ~ 10 で感染させることになりますまた CJ236 株の前培養でクロラムフェニコールを加えないと F 因子が脱落する恐れがありますのでご注意下さい 10

11 4.dU-ssDNA の調製について Q1: CJ236 株と MV1184 株を指示菌にしてタイターを比較する理由は? A1: du を含む ssdna が正しく形成されている場合 MV1184 株は遺伝子的に du-ssdna を分解してしまうのでコロニーまたはプラークの形成率が低くなりますしたがって CJ236 株は MV1184 株に対して 10 5 ~ 10 6 倍高いタイターになりますこのとき使用する CJ236 株はクロラムフェニコールを含む LB-broth MV1184 株は M9 培地で培養したものでないと F 因子の脱落がおこり正確なタイター値が出ないことがあります Q2: CJ236 株中で du を含む pic118 の ssdna を作らせようとしたがヘルパーファージを感染させても回収できない A2: F 因子の脱落が原因でしょう CJ236 株の前培養でクロラムフェニコール ( 30 μg/ml ) を添加しヘルパーファージ感染に必要な F 因子を保有していることを確認して下さいクロラムフェニコール非存在下で植継ぎを繰り返すと F 因子が脱落しますので注意して下さいまた du を取り込んでいるかどうかは CJ236 株 ( dut -, ung - ) と MV1184 株 JM109 株 ( dut +, ung + ) 等でのタイター ( 10 5 ~ 10 6 の差が出る ) を測定することにより容易に確認できます Q3: du を含む ssdna 調製において CJ236 株に対するタイターが 10 8 ~ 10 9 pfu/ml にしかならない A3: 主培養の 2 YT 培地からクロラムフェニコールを抜いて下さい Q4: 調製した ssdna にヘルパーファージの DNA が多くコンタミしている A4: 主培養の 2 YT 培地からクロラムフェニコールを抜いて下さい 5. 宿主について Q1: MV1184 株が M9 plate で生えない A1: まずテトラサイクリンストレプトマイシン入りの LB-plate で菌を生育させそれを M9 plate に植替えてくださいこの操作により F 因子が脱落するのを防げますコンピテントセルを作る時は M9 plate に生えた菌を M9 培地で前培養を行ない更に LB-broth で調製すればいいでしょう Q2: CJ236 株の培地中のアンピシリン濃度 ( 150 μg/ml ) が一般的な値 ( 15 ~ 50 μg/ml ) よりも高いのはなぜか A2: 15 ~ 50 μg/ml の範囲では培地調製時や使用保存の条件によってアンピシリンが分解してしまうこともあるので多めに加えています 6. 結果が良くない Q1: 最終的に MV1184 株でコロニーが形成されない A1: 次の項目についてチェックして下さいプライマーのアニーリングに問題は無いか? dsdna の形成は正常か? BMH71-18 株の培養時のエアレーションは充分か? MV1184 株の成長は良好か? F 因子が脱落していないか? Q2: 変異が導入されたクローン全てに一定の鎖長の欠失が生じている A2: Mutation が成功しているものだけに起こっている場合にはプライマーデザインに問題がある可能性がありますベクターも含めてできるだけ対象領域全体の塩基配列とプライマーとの相同性を検討してください 11

12 IX. 参考文献 1) Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, ) Kunkel, T. A. et al. (1987) Methods in Enzymology 154, ) Zoller, M. J. and Smith, M. (1983) Methods in Enzymology 100, ) 広瀬進 (1986) 続生化学実験講座 1 遺伝子研究法 II 105. X. 関連商品 M13mp18 RF DNA( 製品コード 3118 ) puc118 RF DNA( 製品コード 3318 ) puc119 RF DNA( 製品コード 3319 ) E. coli DNA Ligase( 製品コード 2060 ) T4 DNA Polymerase( 製品コード 2040A/2040B ) プライマー合成受託 E. coli Competent Cells CJ236( 製品コード 9053 ) E. coli Competent Cells BMH71-18 muts( 製品コード 9054 ) E. coli Competent Cells MV1184( 製品コード 9055 ) XI. 注意本製品は研究用として販売しておりますヒト動物への医療臨床診断用には使用しないようご注意くださいまた食品化粧品家庭用品等として使用しないでくださいタカラバイオの承認を得ずに製品の再販譲渡再販譲渡のための改変商用製品の製造に使用することは禁止されています Da

Mutan-Express Km Enzyme/Oligo Set, Vector/Host Set

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