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あまめふじがわ
5 years ago
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9 クルマエビホワイトスポット病の防除対策 Table 1. List of WSSV confirmed naturally and/or experimentally infected host species

13 クルマエビホワイトスポット病の防除対策 Fig. 8. Disease control in shrimp hatchery. に組換え大腸菌で発現した WSSV 構造タンパク質第章種苗生産過程における WSD の発生状況 recombinant viral protein, rvp をクルマエビウシエビ White leg shrimp アメリカザ１目的リガニに筋肉接種あるいは経口投与することで自国内の種苗生産機関主として中間育成期での然感染耐過エビと同様に WSSV に対する防御効果が WSD の発生はクルマエビ以外ではこれまでヨ誘導されることが確認されている Namikoshi シエビでの発生事例 Momoyama.,, 1997 が報 2004; Witteveldt, 2004a, b 2006; Vaseenharan 告されているに過ぎない本章では 1996年および, 2006; Jha, 2006, 2007 ワクチン様効果とも 1997年の志布志庁舎におけるクルマエビ種苗生産過程言うべき現象の防除技術へ応用が期待されている本研究ではクルマエビにおける WSSV の防除対策を確立することを目的に第中間育成も含むでの WSSV の検出および WSD の発生状況について述べるなおクルマエビの幼生期章において種苗生産の名称は我が国では伝統的にノープリウスゾエア過程における WSD の発生状況について報告した第ミシスおよびポストラーバという通称が使われている章においてはクルマエビ受精卵のポビドンヨードがこれらの通称は十脚甲殻類の国際的な名称とは必剤による消毒の安全性と効果について調査を行ったずしも一致しない倉田 1986 本尾 1988 国際第的な名称に従えば各ステージの呼称はノープリウ章では WSSV の攻撃量の把握と発現タンパク質の経口投与による WSSV 防御効果に関する試験をス令 = ノープリウスゾエア令行った第章では WSSV 発現タンパク質の経口 = プロトゾエアあるいはゾエアミシス 10 13令投与によって誘導される WSSV に対する防御効果の = ミシスあるいはゾエアポストラーバ 13 14令発現時期持続期間および追加投与効果に関する試験 = メガロパ 15令以降 = 稚エビとのように修正さを行ったれるしかし我が国の種苗生産現場ではいまだにこれらの通称が慣用されている現状から本研究にお

Jun SATOH 含む754塩基を標的とするものであるなお増幅反応の反応条件は 72-10分間および95 反応後 95 を分間 55 - 分間の分間 72 - 分間サイクルとし計30サイクル行った後 72 - 分社を用い定法に従い行い自動シークエンサー 373A DNA シークエンサー, ABI 社により解析した解析結果より VP26および VP28遺伝子がクローニン

24 Jun SATOH 含む754塩基を標的とするものであるなお増幅反応の反応条件は 72-10分間および95 反応後 95 を分間 55 - 分間の分間 72 - 分間サイクルとし計30サイクル行った後 72 - 分社を用い定法に従い行い自動シークエンサー 373A DNA シークエンサー, ABI 社により解析した解析結果より VP26および VP28遺伝子がクローニングされていることが確認された Fig rvp26および rvp28発現系の構築間とした 3 VP26および VP28遺伝子のクローニング VP26F-VP26R および VF28F-VP28R を用い VP26遺伝子の発現用プライマーとして VP26F の5 端側に I および RI の認識配列を含む11塩基 WSSV DNA 試料から VP26および VP28遺伝子の増のリンカー配列 5 -aaagaattcat-3 を付加した計31 幅産物を付属のプロトコールに従いプラスミドベク塩基長の VP26expF プライマー 5 -aaagaattcat-atg ター pcr-script SK + Stratagene の GAA TTT GGC AAC CTA AC-3 および VP26R I 部位へ挿入した後大腸菌 DH5αコンピテント細胞を形質の5 端側に転換した得られた形質転換菌はアンピシリンを含むー配列 5 -gctgtcgac-3 を付加した計31塩基長 LB 寒天培地上で培養し同培地上で青色コロニーをの VP26expR プライマー 5 -gctgtcgac-tta CTT 選択することで DNA 断片を有する組換え菌を選択し CTT CTT GAT TTC GTC C- 3 を作製したまたた VP28遺伝子発現用プライマーとして VP28F の5 端クローニングした遺伝子の塩基配列はダイタ側に I の認識配列を含む9塩基のリンカ I および RI の認識配列を含む11塩基のーミネーターサイクルシーケンシングキット Dye リンカー配列 5 -aaagaattcat-3 を付加した計34塩 primer thermal cycle sequence kit ABI 社およ基長の VP28expF プライマー 5 - aaagaattcat-atg び T3/T7ダイプライマー T3/T7 dye primer ABI GAT CTT TCT TTC ACT CTT TC - 3 および Fig. 13. Nucleotide sequence and amino acid sequence of structural protein (VP26) of WSDV. Primer sequences underlined Green coloring indicate the nucleotide sequence of VP26 coded gene.

25 クルマエビホワイトスポット病の防除対策 Fig. 14. Nucleotide sequence and amino acid sequence of structural protein (VP28) of WSDV. Primer sequences underlined Green coloring indicate the nucleotide sequence of VP28 coded gene. VP28R の5 端側に Sal I の認識配列を含む塩基のリンカー配列 5 -gctgtcgac-3 を付加した計27塩基長の VP28expR プライマー 5 - gctgtcgac-ttact CGGTCTCAGTGCC- 3 を作製した大腸菌 pet VP26および pet VP28を LB-amp 液体培地 1% bact-trypton, 0.5% bact-yeast extract, VP26expF-VP26expR および VP28expF-VP28expR を用い WSSV VP26および VP28遺伝子を PCR 増幅 min, 95-9 min, 30 cycles of 95-1 min, 55 - rvp26および rvp28発現系を用いた rvp26および rvp28の発現 1% NaCl ph7.4 50μ g/ml ampicillin を用い菌体濁度 OD660 が0 5程度になるまで約時間 37 で振とう培養した培養液に終濃度が分間 72-1 min, and 72-5 min した後 1mM となるよう IPTG isopropyl β D - - フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿 thiogalactopyranoside を添加しさらに37 で3時により増幅産物を濃縮した増幅産物は１% 低融点ア間培養することで標的遺伝子を発現させた培養液ガロースゲル電気泳動に供した後 GeneClean kit をを4 で一晩静置し遠心分離 930 g, 20min, 4 用いて目的の DNA 断片を回収しした後細胞を TE 緩衝液に懸濁し Triton X-100およ I および I で処理した後発現ベクター pet-25b + Novagen びリゾチームを終濃度が0.1% および100 μ g/ml との I 部位にライゲーションキットタカなるよう添加し 30 で15分間処理した菌体懸濁ラバイオ社を用いて組み込み大腸菌 BL21のコン液を超音波破砕処理した後遠心分離 12,000 g, 15 ピテント細胞の形質転換に用いた得られた rvp26 min, 4 に供し遠心分離後の沈殿物を rvp26およおよび rvp28遺伝子を発現する大腸菌株を各々 pet び rvp28の発現タンパク質ワクチンとして15ml の VP26および pet VP28株と呼ぶ PBS に懸濁した I-

無細胞タンパク質合成試薬キット　Transdirect insect cell

無細胞タンパク質合成試薬キット　Transdirect insect cell 発現プラスミドの構築 1. インサート DNA の調製開始コドンは出来るだけ 5'UTR に近い位置に挿入して下さい経験的に ptd1 の EcoRV/KpnI サイトへのライゲーション効率が最も高いことを確認しています本プロトコルに従うとインサートサイズにも依りますが 90% 以上のコロニーがインサートの挿入されたクローンとして得られます可能な限り EcoRV/KpnI サイトへ挿入されるお奨めします