DNA DNA

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1 Estimation of optimal growth temperature and species identification of wood rotting fungi collected in Tosayamada town

2 DNA DNA

3 1 PCB 4 KUT0401KUT0404 3

4 2 2-1 KUT0401 KUT0404PDA PDA PDA PDA ph mM KUT0401KUT m 80 m ph plate) 24 1PDA 400ml 4

5 PDAKUT0401 KUT0404 PDA DNA DNA 15mTE 2.5m m 1.510SDS rpmRG55mm 30 CIA 48000rpmRG55mm 20 1/10 3M NaOAc rpmRG55mm rpmRG55mm rpmRG55mm 20 5 TE 500 Template dntp2blend Taq 0.08ITS1ITS4 2 1 Template 1 13PCR ITS pgempcr 2 2Ligation Buffer 5T4 DNA Ligase 1Vector 2, 2 Ligation 27 Transformation Ligation LB X-galIPTG 50 LB DNA Transformation DNA DNA DNA 5

6 LB 5m SDS rpmRG55mm 2 Solution.1 * 100 Slution.2 * Solution.3 * CIA rpm RG55mm rpmRG55mm rpmRG55mm 5 4 TE 100 Rnase Solution.1 * 50mM 0.91up 25mM Tris-HCl(pH8.0) 2.5ml 100ml A.C 10mM EDTA(pH8.0) 2 ml Solution.2 * 0.2N NaOH 200 1SDS 100 H2O 700 Solution.3 * 5M K-O-Ac 60ml up CH3COOH 11.5ml 100ml A.C H2O 28.5ml 6

7 KUT0401KUT

8 3-2 クランプ結合の観察 KUT0401 KUT0402 KUT0403 KUT0404 写真 1 各木材腐朽菌のクランプ結合 0.01mm 顕微 観察から 各菌株において担子菌 特有のクランプ結合が確認された 写真 1 このため単離した菌株 KUT0401 KUT0404 は担子菌 であると判定した 8

9 3-3 バーベンダム反応 KUT0401 KUT0402 KUT0403 KUT0404 カワラタケ オオウズラタケ 写真 2 各木材腐朽菌のバーベンダム反応 KUT0401 KUT0404 のすべてについて培地が 色に変化した また比Ԕに用いた白色腐 朽菌のカワラタケ 色腐朽菌のオオウズラタケはそれぞれ 色 白色を示した したがっ てバーベンダム反応より KUT0401 KUT0404 のすべてが白色腐朽菌であることが判明した また木材腐朽菌によって培地の色が変化する時期にずれがあった このことから 培養時 9

10 10

11 3-2 2 KUT0401 mm/day KUT0402 mm/day KUT0403 mm/day

12 KUT0404 mm/day KUT KUT0402KUT0403KUT KUT KUT KUT0402 KUT0403 KUT KUT0401 KUT KUT0401KUT0403 KUT0402KUT DNA Transformation Ligation 2 50LB 400KUT0401KUT0404 Ligation LB 200KUT0401 Ligation DNA -SDS KUT0401 SDS 12

13 4 KUT0401KUT KUT0401KUT0404 KUT0401KUT KUT KUT0402KUT0403 KUT KUT DNA KUT0401 SDS 6 7 1, , White T.J. et al., PCR protocols:aguide to methods and applications, Academic, San Diego(1990),pp

2

2 1 2 3 4 5 (written by Dr. ) Stock Solution (one liter) in 4 Buffer A: 0.05 M glucose 20% (1.1 M) glucose 22.7 ml 0.025 M Tris-Cl ph8 1 M Tris (ph8.0) 12.5 ml 0.01 M EDTA 0.5 M EDTA 10 ml Buffer B: 5 M

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手順 ) 1) プライマーの設計 発注変異導入部位がプライマーのほぼ中央になるようにする 可能であれば 制限酵素サイトができるようにすると確認が容易になる プライマーは 25-45mer で TM 値が 78 以上になるようにする Tm= (%GC)-675/N-%mismatch Mutagenesis 目的 ) 既存の遺伝子に PCR を利用して変異を導入する 1 点変異導入方法 ) Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) のプロトコールを流用 http://www.stratagene.com/products/showproduct.aspx?pid=131 Kit 中では DNA polymerase

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