H29年報 08 共同利用推進室(渡邉淳)MO

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1 共同利用推進室 (1) 構成員室長渡邉淳客員研究員脇田英明研究生吉田裕孝研究補助員松崎三記子 (2) 平成 29 年度研究活動の概要長寿医療研究を推進していく上で様々な共同利用機器は必要不可欠であり 当研究室では前年度に引き続き共同利用機器の円滑かつ効率的な管理運用及び共同利用スペースの整備を行った 本年度は ルミノイメージアナライザー Amersham Imager 680 を導入し 講習会を行った さらに 当センターの各研究部 室及び外部の研究機関から依頼されたサンプルの質量分析等の研究支援を行った 研究に関しては 質量分析による微量タンパク質解析法の開発及びヒト血漿中の ApoE の翻訳後修飾及び結合タンパク質の解析を行った の選択や流速及びグラジエント等のパラメーターの条件検討を行い 解析方法の最適化を試みた 標品としてリコンビナントApoEを用い SDS 電気泳動後ゲルを銀染色し 得られた ApoEのバンドを切り出し 還元アルキル化後 トリプシンで消化した 得られた消化物はC18 column (Magic C18AQ, 0.1 x 300 mm; Michrom Bioresources, Inc.) を用いて 500nl/min といった低流量で流せる HPLCを連結し 高感度質量分析装置 LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific) によるショットガン分析に供した 質量分析によって得られたデータは Proteome discoverer1.3 software (Thermo Fisher Scientific) で mascot 検索を行いタンパク質の同定を行った 条件検討を行った結果 現在リコンビナントApoE 0.25ugから ApoEの配列のほぼ80% の領域をカバーすることが出来た アルツハイマー病の早期診断法の開発を目的として 先ず nano-lc/ms/msをベースとする微量蛋白質の解析 同定システムを構築した 質量分析による微量タンパク質解析法の開発 : 患者の血液の網羅的解析でマーカー候補となるペプチドの同定率を上げるには 液体クロマトグラフィーでのペプチドの分離条件の検討が必要不可欠であることから カラム ヒト血漿中のApoEの翻訳後修飾及び結合タンパク質の解析 : アルツハイマー病患者及び認知機能正常者の血漿中 ApoEを調べることで ApoEの翻訳後修飾や結合タンパク質の同定を試みた Dynabeads ProteinG (VERITAS) を用い アルツハイマー病

2 患者及び認知機能正常者の血漿 100ul から ApoE 抗体 (A299; IBL) による免疫沈降によって各々 ApoEを精製し さらにApoEとともに溶出されたタンパク質をSDS 電気泳動で分離した ゲルは銀染色し 得られたバンドは切り出し 還元アルキル化後 トリプシンで消化した 得られた消化物は上記で構築したシステムを用い 質量分析装置によるショットガン分析に供した 質量分析によって得られたデータはmascot 検索を行いタンパク質の同定を行った アルツハイマー病患者及び認知機能正常者の血漿 100ulからそれぞれApoEの配列の約 65% 及び約 70% の領域をカバーすることが出来た 逆に同定出来なかった領域については翻訳後修飾の可能性があり 特にApoEのN 末側の同定率が低かったので アルツハイマー病患者及び認知機能正常者で 違いがないか さらなる解析を試みている ApoEとともに溶出されたタンパク質については Immunoglobulin Complement C1q Serum albumin Coiled-coil domaincontaining protein Probable ATPdependent RNA helicase Syntaxinbinding protein Apolipoprotein L domain-containing protein Tyrosineprotein kinase Fes/Fps Potassium voltage-gated channel subfamily KQT member Protein virilizer homologといったタンパク質が同定されたが Immunoglobulinが多く同定されており ProteinGにヒト血液由来の Immunoglobulinが結合し ApoEとは無関係に溶出された可能性もあるので 今後 Immunoglobulinをアフィニティーカラムで除いた上で解析する必要があると考えられた

3 研究業績 ( 共同利用推進室 ) I. 論文発表 1. 原著 Matsuoka K, Kohara Y, Naoe Y, Watanabe A, Ito M, Ikeda K, Takeshita S. WAIF1 is a cell surface CTHRC1 binding protein coupling bone resorption and formation. J Bone Miner Res., in press. Shirafuji N, Hamano T, Yen SH, Kanaan NM, Yoshida H, Hayashi K, Ikawa M, Yamamura O, Kuriyama M, Nakamoto Y. Int J Mol Sci.,19(3), 891, Mizutani K, Sonoda S, Wakita H. Ritanserin, a serotonin-2 receptor antagonist, inhibits functional recovery after cerebral infarction. Neuroreport., 29:54-58, 総説 Wakita H, Shindo A, Tomimoto H. What is the Aftermath of Cerebral Microembolism? J Alzheimers Dis Parkinsonism., 7:375, 脇田英明 冨本秀和 認知症の治療の進歩 神経治療学 2017, 34, 著書 Chapters 4. その他 5. 新聞 報道, 等

4 認知症の人への運転中止指導 中日新聞, 2017 年 10 月 17 日 6. 特許申請 取得状況 II. 学会 研究会等発表 1. シンポジウム 特別講演 2. 国際学会発表 Wakita H, Takahashi Y, Masuzugawa S, Ito K, Miyasaka H, Sonoda S, Tomimoto H. Driving performance in patients with Alzheimer s disease, Dementia with Lewy Bodies, and mild cognitive impairment. XXIII World Congress of Neurology, September 20, 2017, Kyoto Takahashi Y, Wakita H, Mizutani K, Sonoda S, Tomimoto H. Spatial and temporal distribution of adiponectin in the rat brain under chronic cerebral hypoperfusion. XXIII World Congress of Neurology, September 20, 2017, Kyoto 3. 国内学会発表渡邉淳. 血漿中のApoEのプロテオーム解析第 36 回日本認知症学会学術集会, 2017 年 11 月 24 日, 金沢 吉田裕孝. Characterization of extracellular tau 第 36 回日本認知症学会学術集会, 2017 年 11 月 24 日, 金沢 高橋雄 宮坂裕之 園田茂 真鈴川聡 冨本秀和 脇田英明 ドライビングシュミレーターを用いた認知症患者の自動車運転特性の解析 第 59 回日本老年医学会学術集会, 2017 年 6 月, 名古屋

5 4. その他 セミナー等 III. 競争的資金獲得実績 1. 日本医療研究開発機構 2. 厚生労働省 3. 文部科学省 吉田裕孝 ( 主任 ) 117 万円科学研究費補助金挑戦的萌芽研究 4. 財団 その他 該当

5-53 -

5-53 - 5-53 - プロテオームプロファイリング ( タンパク質組成分析 ) は組織 血液などのペプチドやタンパク質の検出を目指す技術です 液体クロマトグラフィー タンデム質量分析法に基づき タンパク質の混合物を質量分析法で同定し データ解析が行われます トランスクリプトーム解析とともに 生体システムにおけるダイナミックな変化を網羅的に解析できます 高解像度と高精度 : 解像度は 10 5 超 精度は 1ppm

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