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まれあたかにし
4 years ago
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1 Structure クイックスタートこのミニコースでは NCBI から提供されている Cn3D を用いてどのようにタンパク質の立体構造を可視化や注釈付けを行うかさらにはタンパク質内で保存されているドメインの確認の方法同様のドメインを持っている他のタンパク質の探索方法 3D モデリングのテンプレートとなるタンパク質の見つけ方 BLAST では認識できないような非常に離れたホモログの検出方法について学びます課題.1 この課題では以下のステップに従って学習していきます 1. タンパク質内に保存されているドメインを調べます 2. 同じドメインを含む他のタンパク質を探します 3. 問い合わせ配列に適した3Dモデリング用のテンプレートを探します 4. BLASTでは認識できないような非常に離れたホモログを探します "NCBI Conserved Domain Search" を使うことによって問い合わせとなるアミノ酸配列と既知なタンパク質間で保存されているドメインのライブラリとの間での比較が可能となりますまたこの結果を用いてマルチプルアライメントを作成したり問い合わせ配列用の 3D モデリングテンプレートを探したりすることができます Step.1-1 CDD へと移動してくださいそして CD-Search のテキストボックスに以下のアミノ酸配列を貼り付けて探索を開始してください探索用アミノ酸配列 MDPIALTAAVGADLLGDGRPETLWLGIGTLLMLIGTFYFIVKGWGVTDKEAREYYSITI LVPGIASAAYL SMFFGIGLTEVQVGSEMLDIYYARYADWLFTTPLLLLDLALLAKVDRVSIGTLVGVDAL MIVTGLVGALS HTPLARYTWWLFSTICMIVVLYFLATSLRAAAKERGPEVASTFNTLTALVLVLWTAYPI LWIIGTEGAGV VGLGIETLLFMVLDVTAKVGFGFILLRSRAILGDTEAPEPSAGAEASAAD このタンパク質に含まれるドメインにはどのようなものがありますか? また得られたドメインに関するより詳しい情報を NCBI's Bookshelf から調べてください Step.1-2 CD-Search の検索結果ページに戻ってください "Search for similar domain architectures" ボタンをクリックして今見つかったのと同様のドメインを持つタンパク質のリストを得てくださいリストを得るために配列へのリンクをクリックしてさらに "Look up Sequences in Entrez" をクリックしてくださいその後で表示オプションを "Summary" から "FASTA" に変更し配列を表示してください Step.1-3 CD-Search の検索結果ページに戻ってくださいドメインを示している図中の四角をクリックすることでそのドメインを代表する 10 本のアミノ酸配列によるマルチプルアライメントが表示されます "Row Diplay" プルダウンメニューから "Up to 5" を選択して配列アライメントを再描画してください上部にある "Structure" メニューをクリックして開いてくださいさらに "Show Structure" ボタンをクリックして問い合わせ配列を含むマルチプルアライメントの結果を 3 次元モデルのテンプレート上で Cn3D を利用して確認表示してください Halobacterium salinarum の halorhodopsin をテンプレートとし ( 今の version では 1GU8:Sensory Rhodopsin がテンプレートとなります ) 問い合わせ配列を含むアライメントが表示されています主鎖を見やすくするために側鎖をすべて非表示にしてください (Style オプションから Edit global style, Protein side chains を選択し非表示にします ) 問い合わせ配列はバクテリオロドプシンの特徴配列である (FMVLDVTAKVGF) を持っています中でも K( リジン ) はレチナールの結合部位となっています問い合わせ配列中のこれらの残基を確認して halorhodopsin 上で ( 今の Version では Sensory Rhodopsin) 対応するリジン残基をハイライト表示させてくださいこの残基の側鎖を表示させてください (Style オプションから Annotate, New, Edit Style を選択します

2 protein bacjbone Rendering を Tube に Color Scheme を User Selection にさらに User Color を目立つ色例えば黄色に変更します同様な手順を Protein Sidecchains にも施して Protein Sidechains をオンにして見てください最後に Done ボタンをクリックします ) ズームインするためにキーボードの z ボタンを押してくださいリジン残基近くに位置する補酵素を確認してください Step.1-4 halorhodopsin タンパク質 ( 今のバージョンでは Sensory Rhodopsin タンパク質 ) に類似の構造を得るためにまず CD-Browser で表示されている 1E12_A( 今のバージョンでは 1GU8_A) をクリックしてください表示された 1E12_A ( 今のバージョンでは 1GU8_A) エントリの右上に示された Links をクリックすると表示されるプルダウンメニューから Structure を表示してください ( ここから先はエントリが課題設定当初と変わったため回答が存在しません ) そして 1E12 をクリックし次に表示される画面から図中 chaina をクリックしてくださいすると 1E12_A に類似構造をとるタンパク質の一覧が表示されます見たいものをいくつか選択しチェックボックスをオンにし "View 3D Alignment" をクリックすると Cn3D にこれらの構造が重ねて表示されます課題.2 この課題では以下のステップに従って学習していきます 1. タンパク質内に保存されているドメインを調べます 2. 同じドメインを含む他のタンパク質を探します 3. 問い合わせ配列に適した3Dモデリング用のテンプレートを探します 4. BLASTでは認識できないような非常に離れたホモログを探します "NCBI Conserved Domain Search" を使うことによって問い合わせとなるアミノ酸配列と既知なタンパク質間で保存されているドメインのライブラリとの間での比較が可能となりますまたこの結果を用いてマルチプルアライメントを作成したり問い合わせ配列用の 3D モデリングテンプレートを探したりすることができます Step.2-1 CDD へと移動してくださいそして CD-Search のテキストボックスに以下のアミノ酸配列を貼り付けて探索を開始してください探索用アミノ酸配列 >gi sp P25848 PHY1_CERPU Light-sensor Protein kinase MSATKKTYSSTTSAKSKHSVRVAQTTADAALEAVYEMSGDSGDSFDYSKSVGQSAESVP AGAVTAYLQRM QREGLIQNFGCMVAVEEPNFCVIAYSENASEFLDLIPQAVPSMGEMDVLGIGTDIRTLF TPSSSAALEKA AATQDISLLNPITVHCRRSGKPLYAIAHRIDIGIVIDFEAVKMIDVPVSAAAGALQSHK LAARAITRLQA LPGGDIELLCDTIVEEVRELTGYDRVMAFKFHEDEHGEVVAEIRRMDLEPYMGLHYPAT DIPQASRFLLM このタンパク質に含まれるドメインにはどのようなものがありますか? "Full Result" ボタンを押すことですべてのドメインを表示することができますおそらくその中でセリン / スレオニンキナーゼドメインに興味を持つことでしょうこのドメインに関するより詳しい情報を NCBI's Bookshelf から調べてください Step.2-2 CD-Search の検索結果ページに戻ってください "Search for similar domain architectures" ボタンをクリックして今見つかったのと同様のドメインを持つタンパク質のリストを得てくださいリストを得るために配列へのリンクをクリックしてさらに "Look up Sequences in Entrez" をクリックしてくださいその後で表示オプションを "Summary" から "FASTA" に変更し配列を表示してください Step.2-3 CD-Search の検索結果ページに戻ってくださいドメインを示している図中の四角から serine/threonine kinase domain(cdd 00180) をクリックすることでそのドメインを代表する 10 本のアミノ酸配列によるマルチプルアライメントが表示されます "Row Diplay" プルダウンメニューから "Up to 5" を選択して配列アライメントを再描画してくださいさら

3 に "Show Structure" ボタンをクリックして問い合わせ配列を含むマルチプルアライメントの結果を 3 次元モデルのテンプレート上で Cn3D を利用して確認表示してください一番上に表示された構造のみを表示するために下矢印キーを押してください主鎖を見やすくするために側鎖をすべて非表示にしてください (Style オプションから Edit global style, Protein side chains を選択し非表示にします ) 問い合わせ配列はセリン / スレオニンキナーゼ活性部位の特徴配列である (IIHRDLKSMNILV) を持っています中でも K( リジン ) は ATP の結合部位となっています問い合わせ配列中のこれらの残基を確認して対応するリジン残基をハイライト表示させてくださいこの残基の側鎖を表示させてください (Style オプションから Annotate, New, Edit Style を選択します protein bacjbone Rendering を Tube に Color Scheme を User Selection にさらに User Color を目立つ色例えば黄色に変更します同様な手順を Protein Sidecchains にも施して Protein Sidechains をオンにして見てください最後に Done ボタンをクリックします ) ズームインするためにキーボードの z ボタンを押してくださいリジン残基近くに位置する heterogen を確認してください Step.2-4 セリン / スレオニンキナーゼタンパク質に類似の構造を得るためにまず CD-Browser で表示されている 1JNK をクリックしてください ( ここから先は NCBI 側のデータ構造が課題設定当初と変わったため回答が存在しません ) 表示された 1JNK エントリの右上に示された Links をクリックすると表示されるプルダウンメニューから Structure を表示してくださいそして 1JNK をクリックし次に表示される画面から図中 chain をクリックしてくださいすると 1JNK に類似構造をとるタンパク質の一覧が表示されます見たいものをいくつか選択しチェックボックスをオンにし "View 3D Alignment" をクリックすると Cn3D にこれらの構造が重ねて表示されます解答解説解答 1-1 CD-Search の利用問題に示されたリンクあるいは NCBI のトップページ上部にあるメニューから Structure( 図中赤四角 ) を選択し

4 その次のページから CDD( 図中赤四角 ) を選択することで

5 CDD のトップ画面に移動します

rpsblast を用いて実現することで問い合わせ配列中に含まれるドメイン情報を比較的高速に得ることが可能となっています

6 CDD(Consered Domain Databse) とはタンパク質間で共通に見られるドメインに関するデータベースであり SMART, Pfam などで作られているモチーフデータベースを変換したものとなっていますこれらから各ドメインに共通する配列のプロファイルを作成しそのプロファイルに対しての検索を rpsblast を用いて実現することで問い合わせ配列中に含まれるドメイン情報を比較的高速に得ることが可能となっています上部のテキストボックスに課題中に示されたアミノ酸配列を入力しドメイン探索を実行しますすると下図のような検索結果が得られますバクテリオロドプシンのドメインが問い合わせ配列に含まれていることが確認できます

7 NCBI Bookshelf の利用このバクテリオロドプシンに関するより詳しい情報を NCBI Bookshelf を使って調べましょう問題に示されたリンクあるいは NCBI のトップページ左にあるメニューから Literature databases( 図中赤四角 ) を選択し

8 その次のページから Bookshelf( 図中赤四角 ) を選択することで

9 NCBI Bookshelf のトップページに移動します

10 上部の検索ボックスに "Bacteriorhodopsin" と入力し探索を実行してください

11 6 書籍に Baceriorhodopsin に関する記載があることが確認できます "Molecular Biology of the Cell" の横の 11items をクリックして書籍内部の Bacteriorhodopsin に関する記載を見てみましょうまずは 11 件の一覧が表示されます

12 一件目をクリックしてその内容を見てみましょう

13 解答 1-2 同じドメインを持つ配列の取得 CD-Seacrh の結果画面に戻り "Search for similar domain architectures"( 図中赤四角 ) をクリックし

14 この問い合わせ配列と同様なドメインを持つ配列を取得してくださいこの画面では問い合わせ配列に含まれるのと同様なドメインを持つ配列が模式図として示されていますそれらをまとめると 2 種類に大別でき一つ目の構造を持つ配列は 2 本ですがバクテリオロドプシンのドメインのみを持つ配列が 786 本あることが確認できますこの 786 Sequences をクリックすると 786 配列分の模式図が表示されます

15 さらに画面の左下にある "Look Up Sequences in Entrez"( 画面赤四角 ) を押すとこの 786 本分の配列情報を Entrez から得ることができます

16 最後に Display オプションのプルダウンメニューを "FASTA" にすることでアミノ酸配列を表示することができます

17 解答 1-3 同じドメインを持つ配列の立体構造表示 CD-Search の検索結果ページに戻りドメインを示している図中の赤四角をクリックしてください

pfam0136 ドメインを含んだ代表的な 10 本のアミノ酸配列と問い合わせ配列のマルチプルアライメントが表示されます ( 注 :

18 すると今クリックしたドメインの詳細な情報が表示されます表示されていた "Bacteriorhodopsin" は Superfamily でその下のクラスとして pfam01036 と COG5524 が含まれることが分かります pfam0136 をクリックしてくださいこれにより pfam0136 ドメインを含んだ代表的な 10 本のアミノ酸配列と問い合わせ配列のマルチプルアライメントが表示されます ( 注 : 本来はこの際にユーザが投入した問い合わせ配列が引数として以下のページに渡されるはずですが現在渡らない状況となっていますこの解説では渡されたものとして各ページを紹介していきます )

19 "Row Display" プルダウンメニューを操作し "up to 5" を選択して表示されるアライメントを 5 本にします

20 続いて上部の "Strucrure" と書かれた箇所の横にある "+" をクリックしてメニューを表示させてください "Structure View" ボタンをクリックしてください ( 図中青四角 ) この際 Cn3D がインストールされていない場合には正しく表示することができないのでまず Cn3D をインストールする必要がありますインストールされている人はこの部分は読み飛ばしてください Cn3D のインストール

21 まず Download Cn3D と書かれた箇所をクリックしますすると NCBI Structure のページへ移動します上部にある "Download"Cn3D 4.1 と書かれた箇所をクリックして Cn3D のダウンロード画面へ移動します

22 するとインストールするコンピュータの OS を聞かれますので該当する OS の部分をクリックしその先は OS ごとに書かれた指示に従って Cn3D をインストールしてください Cn3D を用いた立体構造の表示正しく Cn3D がインストールされている場合には問い合わせ配列を含むマルチプルアライメントの結果が 3 次元モデルのテンプレート上に重ねられた形で表示されます

図中紫で太く示されているのがテンプレートとなっている配列で Sequence/Alignment

Natronomonas pharaonis の Sensory Rhodoosin

23 図中紫で太く示されているのがテンプレートとなっている配列で Sequence/Alignment Viewer の一番上に示されている 1GU8_A であることがわかりますこのエントリに関する詳細な情報は CDD Descriptive Items という別画面に表示されていてそれによると PDB に 1GU8 として登録されている Natronomonas pharaonis の Sensory Rhodoosin であることがわかります見やすくするために Style からメニューで Edit Global Style を選んで表示オプション画面を表示させてください

24 その中から Protein sidechains の表示に関するチェックボックスを外すことで側鎖の表示を消してください主鎖だけが表示されるようになります下図中赤で囲んだ領域に示されるようにこれらの配列の下流部分には FMVLDVTAKVGF というバクテリオロドプシンに共通な配列部分が存在します

次元構造ビューア上で黄色くハイライトされていることが確認できます ( 図中水色ので囲まれた箇所 )

25 レチナール結合部位であるリジン (K) を 3 次元構造上で確かめるためにテンプレートとなっている 1GU8_A 上の K をダブルクリックしてください ( 図中青四角で示しています ) すると 3 次元構造ビューア上で黄色くハイライトされていることが確認できます ( 図中水色ので囲まれた箇所 ) この残基をより目立たせるために側鎖を含めてハイライト表示させることにしましょうまずメニューから Style を選択しその中の Annotate を選択します

26 するとユーザ定義に基づいた表示オプションの設定画面が立ち上がりますのでその中から New を選択して新しく定義づけを行います新しく設定する定義に名前をつけるように促されますので適当な名前 ( ここでは lysin としました ) をつけて Edit Style ボタンをクリックします

27 Style 設定画面が立ち上がります残基の主鎖および側鎖をハイライトさせるために Protein back bone について Rendering を Tubes Color Scheme を User Selection User Color を黄色に同様に Protein sidechains も設定し Show をチェックします

28 最後に Done を押してこの画面を閉じ Edit Annotation, User Annotation の画面も閉じます 3 次元ビューアでこのリジンがハイライトされていることがわかります

29 キーボードの z を押してズームインしてその構造をよく確認してくださいそのリジンのそばに C で表された CL 分子があることが確認できます

30 解答 1-4 データベースに含まれる配列と類似構造の配列を取得する CD-Browser で表示されている 1GU8_A をクリックしてください表示された 1GU8_A エントリの右上に示された Links をクリックし ( 赤 ) 表示されるプルダウンメニューから "Related Structure( 青四角 ) を選択してください

31 1GU8 と類似の立体構造既知の配列が表示されていることが確認できます画面中 1GU8 と書かれた左横の絵をクリックしてください ( 現状図がうまく表示されていないようです )

問題に示されたリンクあるいは NCBI のトップページ上部にあるメニューから Structure を選択しその次のページから CDD

32 1GU8 に含まれる構造ドメインの情報が表示されているのが確認できます ( ここより先の課題はエントリが課題設定当初と変わってしまったために回答が存在しません ) 解答解説 2 解答 2-1 CD-Search の利用 2 問題に示されたリンクあるいは NCBI のトップページ上部にあるメニューから Structure を選択しその次のページから CDD を選択することで CDD のトップ画面に移動します上部のテキストボックスに課題中に示されたアミノ酸配列を入力しドメイン探索を実行しますすると下図のような検索結果が得られます

33 このエントリには多くのドメインが含まれますが右上部の "Show Full Display" ボタンを選択することですべてのドメインが表示されます

セリン / スレオニンキナーゼを初めとして多くのドメインが問い合わせ配列に含まれていることが確認できます NCBI Bookshelf の利用 2 このセリン / スレオニンキナーゼに関するより詳しい情報を NCBI Bookshelf を使って調べましょう問題に示されたリンクあるいは NCBI のトップページ左にあるメニューから Literature を選択し

34 セリン / スレオニンキナーゼを初めとして多くのドメインが問い合わせ配列に含まれていることが確認できます NCBI Bookshelf の利用 2 このセリン / スレオニンキナーゼに関するより詳しい情報を NCBI Bookshelf を使って調べましょう問題に示されたリンクあるいは NCBI のトップページ左にあるメニューから Literature を選択しその次のページから Bookshelf を選択することで NCBI Bookshelf のトップページに移動します上部の検索ボックスに "Serine/Threonine protein kinases" と入力し探索を実行してくださいその結果をクリックしていくことで書籍内部の Serine/Threonine protein kinases に関する記載を読むことができるようになります

37 解答 2-2 同じドメインを持つ配列の取得 2 CD-Seacrh の結果画面に戻り "Search for similar domain architectures" をクリックしこの問い合わせ配列と同様なドメインを持つ配列を取得してくださいまずクリックすると問い合わせ配列に含まれるのと同様なドメインを持つ配列が模式図として示されてます

38 それらは非常に多くの種類に大別されさらにはそれぞれが 4 本 2 本といった配列を含んだクラスタであることがわかります例えば上から 9 つ目の模式図として示されている構造には 6 本の配列が含まれておりこの 6Sequences をクリックすると 6 本分の模式図が表示されます

39 さらに画面の左下にある "Look Up Sequences in Entrez" を押すとこの 6 本分の情報を Entrez から得ることができます

40 最後に Display オプションのプルダウンメニューを "Fasta" にすることでアミノ酸配列を表示することができます

41 解答 2-3 同じドメインを持つ配列の立体構造表示 2 CD-Search の検索結果ページに戻り

serine/threonine kinase ドメインを示している "S_TKc" と書かれた図中の四角 ( 赤く囲まれている部分 ) をクリックしてください同様のドメインが集められた Superfamily に関する情報が記載されたページへと移動しますこの中からドメインの一つである "cd00180"( 図中青く囲んだ領域 )

42 serine/threonine kinase ドメインを示している "S_TKc" と書かれた図中の四角 ( 赤く囲まれている部分 ) をクリックしてください同様のドメインが集められた Superfamily に関する情報が記載されたページへと移動しますこの中からドメインの一つである "cd00180"( 図中青く囲んだ領域 ) をクリックしてくださいこれにより cd00180 ドメインを含んだ代表的な 10 本のアミノ酸配列と問い合わせ配列のマルチプルアライメントが表示されます ( 注 : 本来はこの際にユーザが投入した問い合わせ配列が引数として以下のページに渡されるはずですが現在渡らない状況となっていますこの解説では渡されたものとして各ページを紹介していきます )

43 "Row Display" プルダウンメニューを操作し "up to 5" を選択して表示されるアライメントを 5 本にします

44 続いて "Structure View" ボタン ( 図中赤四角 ) をクリックしてください正しく Cn3D がインストールされている場合には問い合わせ配列を含むマルチプルアライメントの結果が 3 次元モデルのテンプレート上に重ねられた形で表示されます Cn3D を用いた立体構造の表示 2

45 一番上に表示された構造のみを表示するために下矢印キーを押してください Style からメニューで Edit Global Style を選んで表示オプション画面を表示させてくださいその中から Protein sidechains の表示に関するチェックボックスを外すことで側鎖の表示を消してください主鎖だけが表示されるようになります

結合部位であるリジン (K) を 3 次元構造上で確かめるためにテンプレートとなっている 1JNK

46 下図中赤で囲んだ領域に示されるようにこれらの配列の下流部分に IIHRDLKSMNILV というセリン / スレオニンキナーゼ活性部位に共通な配列部分が存在します ATP 結合部位であるリジン (K) を 3 次元構造上で確かめるためにテンプレートとなっている 1JNK 上の K をダブルクリックしてください ( 図中青四角で示す ) すると 3 次元構造ビューア上で黄色くハイライトされます

この残基をより目立たせるために側鎖を含めてハイライト表示させますまずメニューから Style を選択しその中の Annotate を選択しますするとユーザ定義に基づいた表示オプションの設定画面が立ち上がりますのでその中から New を選択して新しく定義づけを行います新しく設定する定義に名前をつけるように促されますので適当な名前をつけて Edit Style ボタンをクリックします

47 この残基をより目立たせるために側鎖を含めてハイライト表示させますまずメニューから Style を選択しその中の Annotate を選択しますするとユーザ定義に基づいた表示オプションの設定画面が立ち上がりますのでその中から New を選択して新しく定義づけを行います新しく設定する定義に名前をつけるように促されますので適当な名前をつけて Edit Style ボタンをクリックします Style 設定画面が立ち上がりますのでこの残基の主鎖および側鎖をハイライトさせるために Protein back bone について Rendering を Tubes Color Scheme を User Selection User Color を黄色に同様に Protein sidechains も設定し Show をチェックします最後に Done を押してこの画面を閉じます 3 次元ビューアでこのリジンがハイライトされていますキーボードの z を押してズームインしてその構造をよく確認してくださいそのリジンのそばに Mg 分子があることが確認できます

48 解答 2-4 データベースに含まれる配列と類似構造の配列を取得する 2 CD-Browser で表示されている 1JNK をクリックしてください

( ここより先の課題は NCBI のデータ構造が課題設定当初と変わってしまったために回答が存在しません ) 原文更新日 : 2006 年 3 月 28 日日本語版更新日 : 2009 年

内容 1 はじめにインストールの手順起動の手順 Enterprise Architect のプロジェクトファイルを開く内容を参照するプロジェクトブラウザを利用するダイアグラムを開く便利な機能.

内容 1 はじめにインストールの手順起動の手順 Enterprise Architect のプロジェクトファイルを開く内容を参照するプロジェクトブラウザを利用するダイアグラムを開く便利な機能. Viewer manual by SparxSystems Japan Enterprise Architect 読み込み専用版 (Viewer) 利用マニュアル内容 1 はじめに...3 2 インストールの手順...3 3 起動の手順...6 4 Enterprise Architect のプロジェクトファイルを開く...7 5 内容を参照する...8 5.1 プロジェクトブラウザを利用する...8