研究成果報告書

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あおいあんさい
4 years ago
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1 IgE Can f 1 Can f 2 X -sheet (Can f 3) IgE Human-animal bonds become stronger. Dogs as behalf of pets are tightly associated with human living life. Due to the intimate relationship, human may be sensitized with and exhibit allergic response to dog allergens. To prevent dog allergy and assess the risk of dog allergens, characterization of dog allergens was performed. From the analysis of amino-acid sequence of Can f 1 and Can f 2 (major dog allergens), both allergens revealed the barrel structure and one disulfide bond, which were the charters of popular antigenic proteins. X-ray small angle scattering analysis and circular dichroism photometric method indicated that both allergens were globular and -sheet-abundant proteins, and showed mono-molecular distribution in water-solutions. Also, both allergens showed the values of molecular weight in solution, which was accordance with those estimated from the amino-acid sequence. Dog albumin (Can f 3) being as one of dog allergens was also examined its allergic cross reactions. The IgE antibody in the serum of dog allergy patients bound to albumin of dog and other animal species. This fact indicates that dog allergens must be recognized as widely distributed risk substances. 1

2 Can f 1Can f 2 QXVXG

3 (1) (2) (3) IgE (1) Can f 1Can f 2 BLAST Basic Local Alignment Search Tool; 20,000 Protein Data Bank PDB 19) SWISS-MODEL workspace Can f 1 Can f 2 GROMOS 22) GROnigen MOlecular Simulation computer program package Can f 1Can f 2 Can f 1Can f 2 pgex-4t-2 E.coli BL21 X Can f 1 Can f 2 A Can f 1Can f mg/ml 5.0 mg/ml 8.0 mg/ml 12.0 mg/ml ovalbumin (Mr = 45,000) lysozyme (Mr = 14,307) B X SPring-8 BL40B2 X Å m25 ºC R-AXIS IV++ RIGAKU C

A 遠紫外領域 far-uv 円偏光二色性測定等量混合した溶液を 96 µl 加えて室温で 5 と二次構造含有量予測分間反応させプレートリーダーで 490 nm 測定は J-820 spectropolarimeter Jasco をの吸光度を測定しパパインの酵素活性量と用い測定波長200~260 nm において行ったした Can f 1およびCan

2 M リン酸カリハムスターアレルギー患者についてアレルゲン解析をした結果アルブミンに感作を受けている患者血清とイヌのアルブミンとの反応性を解析した抗ヒト IgE 抗体を用いてアルブミンにおける動物種の違いとアレウムバッファー ph 6.0 4 mm EDTA およびルギー反応性を検討した 0.2 mm システインを含むに溶解した 0.

0 に EDTA (1)イヌアレルゲンのタンパク質構造解析を加えたものは室温で保存しシステイン加 ①イヌアレルゲンのホモロジーモデル構造えたものは即日使用したパパインの阻害剤による立体構造予測として鶏卵白由来シスタチン以下シスタモデル構造より Can f 1 およびCan f 2 チンを用いたシスタチンのバッファーにともに

に溶解して 4 で保存し使用のたであろうcavity を有することが推測されたびに蒸留水で 10 倍希釈した最終濃度 3 mg/ml パパインの反応停止剤に 5 mm の 4クロロマーキュリー安息香酸以下 CMB を使用した 0.1785 g の CMB を 6 ml の 0.5 M NaOH に溶かして 0.

4 A 遠紫外領域 far-uv 円偏光二色性測定等量混合した溶液を 96 µl 加えて室温で 5 と二次構造含有量予測分間反応させプレートリーダーで 490 nm 測定は J-820 spectropolarimeter Jasco をの吸光度を測定しパパインの酵素活性量と用い測定波長200~260 nm において行ったした Can f 1およびCan f 2 の二次構造含有量の予 (3)アルブミンアレルギーとの交差性測は DICROPROT )プログラムを用いて計算した (2) イヌアレルゲンのパパインの酵素活性への影響パパイン SIGMA は 0.2 M リン酸カリハムスターアレルギー患者についてアレルゲン解析をした結果アルブミンに感作を受けている患者血清とイヌのアルブミンとの反応性を解析した抗ヒト IgE 抗体を用いてアルブミンにおける動物種の違いとアレウムバッファー ph mm EDTA およびルギー反応性を検討した 0.2 mm システインを含むに溶解した 0.2 M ４研究成果リン酸カリウムバッファー ph 6.0 に EDTA (1)イヌアレルゲンのタンパク質構造解析を加えたものは室温で保存しシステイン加 ①イヌアレルゲンのホモロジーモデル構造えたものは即日使用したパパインの阻害剤による立体構造予測として鶏卵白由来シスタチン以下シスタモデル構造より Can f 1 およびCan f 2 チンを用いたシスタチンのバッファーにともにリポカリン蛋白質特有の構造的特徴は PBS を使用したパパインの基質にはベンである8 本のβ-strand からなるβ-barrel 構ゾイル-DL-アルギニン-ナフチルアミド以下造 1 本の長いα-helix および分子内ジスル BANA を使用した 30 mg の BANA を 1 ml フィド結合を有し疎水性低分子を結合するの DMSO に溶解して 4 で保存し使用のたであろうcavity を有することが推測されたびに蒸留水で 10 倍希釈した最終濃度 3 mg/ml パパインの反応停止剤に 5 mm の 4クロロマーキュリー安息香酸以下 CMB を使用した g の CMB を 6 ml の 0.5 M NaOH に溶かして 0.5 M EDTA を 5 ml 加えて蒸留水で 45 ml にし 1 M HCl で ph 6.0 Can f 1の立体構造モデルにし蒸留水で 50 ml にして作成し室温で保存したパパインが BANA を分解して生成した 2 ナフチルアミドと反応して発色する呈色剤に 0.15 mg/ml のファーストガーネット GBC を使用したファーストガーネット GBC は 4% Brij-35 に溶かして即日使った Can f 2の立体構造モデルプレート１ウェルあたりパパイン 60 µl シスタチンまたはイヌアレルゲン 40 µl をいホモロジーモデル構造からもCan f 1およれ 5 分間 37 で反応させたこの後 BANA びCan f 2 はリポカリン蛋白質であることがを 40 µl 加え 15 分間 37 で反応させたそ示唆されたまたリポカリン蛋白質においして CMB とファーストガーネット GBC をて βd-strandとc 末端部を結ぶ分子内ジス

5 X Can f 1 Can f 2 A Can f 1 Can f 2 Can f 1 Can f 2 Can f 1 Can f 2 (2) 20 mg/ml 490 nm Can f 1 Can f 2

6 0 0 4

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研究用 TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 説明書 v201701da TaKaRa Bradford Protein Assay Kit は Coomassie Dye を用いる Bradford 法に基づいたキットであり簡単な操作で迅速に濃度範囲が 1 ~ 1,000 μg/ml のタンパク質溶液の定量を行うことができます本キットの定量の原理は Coomassie