論 文 内 容 の 要 旨 序 論 多 細 胞 生 物 の 形 態 形 成 過 程 において 細 胞 の 増 殖 と 分 化 は 必 要 不 可 欠 の 役 割 を 果 たしている 個 体 内 の 各 細 胞 は 外 的 および 内 的 環 境 からのシグナルに 応 答 して 分 化 を 開 始 す

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1 ひろ せ しげ のり 氏 名 ( 本 籍 地 ) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学 位 授 与 年 月 日 学 位 授 与 の 要 件 研 究 科, 専 攻 廣 瀬 滋 規 博 士 ( 生 命 科 学 ) 生 博 第 8 号 平 成 16 年 3 月 25 日 学 位 規 則 第 4 条 第 1 項 該 当 東 北 大 学 大 学 院 生 命 科 学 研 究 科 ( 博 士 課 程 ) 生 命 機 能 科 学 専 攻 論 文 題 目 新 奇 遺 伝 子 dia1 dia2 の 発 現 制 御 による 粘 菌 細 胞 の 増 殖 / 分 化 の 調 節 博 士 論 文 審 査 委 員 ( 主 査 ) 教 授 前 田 靖 男 教 授 山 本 和 生 教 授 水 野 健 作 41

2 論 文 内 容 の 要 旨 序 論 多 細 胞 生 物 の 形 態 形 成 過 程 において 細 胞 の 増 殖 と 分 化 は 必 要 不 可 欠 の 役 割 を 果 たしている 個 体 内 の 各 細 胞 は 外 的 および 内 的 環 境 からのシグナルに 応 答 して 分 化 を 開 始 する しかしながら 個 々の 細 胞 に 注 目 すると 細 胞 は 増 殖 か 分 化 のどちらかの 状 態 しかとることができず 増 殖 と 分 化 は 総 じて 背 反 的 な 関 係 にある 互 いに 相 容 れない 増 殖 と 分 化 は 時 間 的 空 間 的 に 制 御 されることで 生 物 は 複 雑 な 形 態 形 成 を 成 し 遂 げる この 機 構 がうまく 働 かない 場 合 個 体 発 生 の 異 常 をもたらし 最 終 的 には 致 死 となってしまう また 増 殖 と 分 化 の 統 御 機 構 の 異 常 は 個 体 に 甚 大 な 悪 影 響 を 与 え 例 えば 癌 化 やアルツハイマー 病 の 素 因 となる アルツハイマー 病 においては 脳 神 経 細 胞 の 細 胞 周 期 制 御 の 撹 乱 がアポトーシスを 引 き 起 こしさらには 脳 の 縮 小 につながる(Nagy et al., 1998) このように 増 殖 / 分 化 の 統 御 機 構 の 解 明 は 重 要 な 研 究 課 題 であり 発 生 生 物 学 のみならず 医 学 的 にも 意 義 深 い この 種 の 研 究 を 遂 行 するに 際 して 細 胞 性 粘 菌 は 非 常 に 優 れたモデル 生 物 だといえる 粘 菌 細 胞 は 外 部 の 栄 養 条 件 に 依 存 して 生 存 戦 略 ( 増 殖 分 化 )を 変 化 させるため 細 胞 の 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えの 観 察 が 容 易 である また すぐれた 細 胞 周 期 同 調 系 が 確 立 されているため(Maeda, 1986) 細 胞 周 期 の 同 調 によっ て 分 化 と 増 殖 の 関 係 を 細 胞 周 期 調 節 の 観 点 から 調 べることが 可 能 である 実 際 に 細 胞 周 期 上 の G2 後 期 に は 増 殖 / 分 化 のチェックポイント(putative-shift point ; PS 点 )が 特 定 され この 特 異 点 における 分 子 的 できごと を 明 らかにすることを 手 がかりに 粘 菌 細 胞 の 増 殖 / 分 化 統 御 機 構 を 解 析 できるようになった PS 点 の 解 析 についてはタンパク 質 のリン 酸 化 と 遺 伝 子 発 現 の 制 御 に 注 目 した 研 究 が 進 められている PS 点 特 異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 群 は differential screening differential display 法 によって 単 離 され 6 種 類 (quit1, quit2, quit3, dia1, dia2, dia3)がクローニングされている (Abe, 1993; Chae, 1997) quit1 は PS 点 からの 分 化 に 伴 って 発 現 し camp レセプター1 をコードする 遺 伝 子 car1 と 同 一 である(Abe and Maeda, 1994) car1 遺 伝 子 の 破 壊 は 粘 菌 細 胞 の 分 化 不 全 を 引 き 起 こし car1 破 壊 株 は 集 合 すらできなくなることから car1 は 初 期 分 化 の 発 現 に 必 須 である(Sun et al., 1990; Sun and Devreotes, 1991) 粘 菌 細 胞 の 集 合 には camp が 走 化 性 物 質 として 機 能 しており camp と 結 合 した car1 は3 量 体 G タンパク 質 を 介 したシグナル 伝 達 系 を 作 動 させる(Devereotes, 1994; Michael and Loomis, 1998) car1 はまた 3 量 体 G タンパク 質 を 介 することな く 細 胞 外 Ca 2+ の 流 入 を 誘 起 する(Milne, et al., 1995) この 様 に car1 と camp との 結 合 は 数 多 くのシグナル 伝 達 系 を 活 性 化 し 分 化 特 に 細 胞 集 合 プロセスに 関 わる 遺 伝 子 の 発 現 を 誘 導 して 初 期 分 化 に 中 心 的 な 役 割 を 担 っている(Soede et al., 1994) PS 点 特 異 的 遺 伝 子 quit2 は 新 奇 の Ca 2+ 結 合 タンパク 質 (CAF-1)をコー ドしており caf1 遺 伝 子 の 過 剰 発 現 は 細 胞 外 Ca 2+ 濃 度 依 存 的 に 初 期 分 化 を 促 進 する(Itoh et al., 1998) ま た quit3 は annexinvii 遺 伝 子 と 相 補 的 な DNA 配 列 を 持 ち 細 胞 内 での Ca 2+ ホメオスタシスに 関 与 するアネ クシン VII の 合 成 をアンチセンス RNA により 制 御 する 可 能 性 が 示 唆 されている(Okafuji et al., 1997) ミトコ ンドリアゲノムにコードされ PS 点 からの 分 化 に 伴 って 一 過 的 に 発 現 する 遺 伝 子 dia3 は 4 つの 遺 伝 子 42

3 (NADH 脱 水 素 酵 素 サブユニット 5(nad5) 11(nad11)およびリボソームタンパク 質 S4 (rps4), S2 (rps2))から なる 遺 伝 子 クラスターとして 転 写 される rps4 遺 伝 子 を 部 分 破 壊 してミトコンドリアをヘテロプラスミー (mitochondrial heteroplasmy) 状 態 にしてやると 粘 菌 細 胞 の 分 化 が 著 しく 阻 害 され 逆 に rps4 を 過 剰 発 現 す ると 早 熟 的 な 分 化 が 誘 導 される この dia3 の 発 見 は 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 え 機 構 の 中 でミトコンドリア 特 に RPS4 が 重 要 な 役 割 を 果 たすことを 示 唆 しており 非 常 に 興 味 深 い 以 上 のように PS 点 特 異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 は 多 岐 にわたり 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 え 機 構 には 数 多 くの 因 子 が 複 雑 なネットワークを 構 成 しながら 関 与 していると 考 えられる 要 約 本 研 究 においては PS 点 の 実 体 を 明 らかにするために 2 つのアプローチを 試 みた 一 つは 従 来 どおり に PS 点 特 異 的 に 発 現 するが その 機 能 については 未 知 のままであった 2 つの 遺 伝 子 dia1, dia2 の 機 能 解 析 を 通 して PS 点 における 役 割 を 解 明 することを 目 的 とした もう 一 つは これまで 解 析 が 行 われていなかった PS 点 における 遺 伝 子 の 転 写 調 節 機 構 を 明 らかにするために dia1 遺 伝 子 のプロモーター 解 析 をした また この 過 程 で 粘 菌 細 胞 の 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えを 可 視 化 するための 優 れたマーカーシステムを 構 築 できたので それにについても 述 べる 第 1 部 dia1 の 機 能 解 析 dia1 (differentiation-associated gene 1) は 新 奇 遺 伝 子 で 推 定 分 子 量 約 48 kda のタンパク 質 (DIA1)を コードしている DIA1 の 主 な 特 徴 としては C 末 端 領 域 に 非 常 に 多 くのセリン 残 基 を 持 つことが 挙 げられ その 一 次 構 造 から GPI アンカーを 介 して 細 胞 膜 に 局 在 していることが 予 測 される dia1 に 関 する 形 質 転 換 体 の 作 製 とその 解 析 から dia1 の 過 剰 発 現 は 分 化 の 開 始 を 遅 らせ 細 胞 集 合 過 程 での camp シグナル 伝 達 に 関 わ る 遺 伝 子 群 の 発 現 を 抑 制 することが 示 された これに 関 連 して camp のシグナル 伝 達 系 は dia1 の 発 現 お よび DIA1 タンパク 質 の 機 能 を 抑 制 することが 示 された これらの 結 果 から dia1 の 発 現 (DIA1)は PS 点 から の 分 化 の 進 行 にブレーキをかけ 飢 餓 処 理 時 点 の 細 胞 周 期 の 差 に 応 じて 生 ずる 細 胞 間 での 分 化 段 階 の 不 揃 いをある 程 度 そろえ すべての 細 胞 を 形 態 形 成 に 参 加 させる 役 割 を 担 っているのではないかと 推 測 され る 第 2 部 dia2 遺 伝 子 の 機 能 解 析 PS 点 特 異 的 な 発 現 を 示 すもう 一 つの 遺 伝 子 dia2 は 推 定 分 子 量 16.9kDa のタンパク 質 (DIA2)をコー ドする 新 奇 遺 伝 子 である dia2 の 発 現 をアンチセンス RNA の 発 現 によって 抑 制 した 株 (dia2 AS 細 胞 )では 細 胞 集 合 に 顕 著 な 異 常 が 観 察 される しかしながら この 発 生 異 常 は 少 数 の 野 生 株 の 存 在 によって 解 除 される ことが 分 かり これには 野 生 株 から 分 泌 される camp が 関 与 していることが 示 唆 された 今 回 粘 菌 細 胞 への 43

4 camp パルス 投 与 は 飢 餓 処 理 後 の dia2 の 発 現 を 誘 導 できることも 確 認 され DIA2 タンパク 質 が 粘 菌 細 胞 の 集 合 期 における camp シグナル 伝 達 系 において 重 要 な 役 割 を 果 たしていることが 明 らかにされた また DIA2-GFP 融 合 タンパク 質 は 細 胞 内 において 小 胞 体 に 局 在 していることが 判 明 し この DIA2 の 小 胞 体 局 在 はまた DIA2 に 対 する 特 異 抗 体 を 用 いたウェスタンブロッティングによっても 確 認 された 第 3 部 dia1 プロモーター 領 域 の 解 析 dia1 遺 伝 子 のプロモーターは 興 味 深 い 特 徴 をもち fkbp2 遺 伝 子 と 対 をなしながらプロモーター 領 域 を 共 有 することが 分 かった fkbp2 は 増 殖 期 において 特 異 的 に 発 現 し 細 胞 周 期 同 調 系 を 用 いたより 詳 細 な 発 現 解 析 によると fkbp2 の 発 現 は 飢 餓 に 特 異 的 に 応 答 して 抑 制 されることが 示 された fkbp2 の 発 現 制 御 様 式 は PS 点 での 飢 餓 に 伴 って 特 異 的 に 発 現 増 大 をする dia1 とは 対 照 的 で 両 者 のプロモーター 領 域 は 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 え 時 において 逆 相 関 でもって ON/OFF されることが 明 らかとなった EMSA (electrophoreic mobility shift assay) とプロモーターデリーションによる 解 析 の 結 果 増 殖 期 と 分 化 期 においてこの dia1/fkbp2 プロモーター 領 域 には 異 なる DNA 結 合 タンパク 質 が 結 合 することが 明 らかにされ その 標 的 配 列 は AAACTGATTAGCTCGATCCCCT であった この 配 列 は 面 白 いことに DNA 結 合 タンパク 質 である Myb の 標 的 配 列 を 含 んでいる なお プロモーターのデリーション 解 析 によって この 領 域 は 増 殖 期 におい て fkbp2 遺 伝 子 の 発 現 を 活 性 化 する 機 能 をもっている 事 が 明 らかとなった dia1/fkbp2 プロモーターのユニー クな 特 徴 を 利 用 したマーキングシステム suika の 確 立 によって 粘 菌 細 胞 の 増 殖 から 分 化 への 状 態 変 化 を 可 視 化 することに 成 功 した さらに この suika システムを 種 々の 発 生 異 常 を 示 す 形 質 転 換 体 に 導 入 した 結 果 このマーカーは 粘 菌 細 胞 におけるの 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えプロセスと 初 期 分 化 のプロセスを 明 瞭 に 区 別 する ことを 可 能 にした そして アデニル 酸 シクラーゼ(ACA) 3 量 体 G タンパク 質 βサブユニット(gβ)は 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えプロセスに camp レセプタ 1(cAR1)は 初 期 分 化 プロセスに 関 与 することが 示 された まとめ 本 研 究 で 解 析 した dia1 および dia2 は PS 点 から 分 化 を 開 始 した 際 に 特 異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 として 単 離 されたもので 分 化 の 開 始 にあたって 重 要 な 位 置 を 占 める 遺 伝 子 である DIA1 と camp シグナル 伝 達 系 は 粘 菌 の 初 期 分 化 期 に 負 のフィードバック 関 係 にることが 示 された この 発 見 は PS 点 特 異 的 に 発 現 する 遺 伝 子 の 多 くが 分 化 に 促 進 的 であることとは 対 照 的 であり PS 点 での 分 子 機 構 に 新 たな 視 点 が 与 えられた 一 方 で dia2 遺 伝 子 は camp シグナル 伝 達 系 に 促 進 的 に 係 わっており その 遺 伝 子 産 物 DIA2 は 小 胞 体 に 局 在 して camp の 分 泌 に 関 わる 可 能 性 を 示 した dia1 のプロモーターの 機 能 解 析 は 思 いもよらない 結 果 をもたらしてくれた 今 回 細 胞 の 状 態 ( 増 殖 およ び 分 化 )によって 異 なる DNA 結 合 タンパク 質 が fkbp2/dia1 プロモーター 内 にある 反 復 配 列 (AAACTGATTAGCTCGATCCCCT)と 相 互 作 用 して 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 え 時 の fkbp2 から dia1 への 発 現 44

5 の 切 り 換 えにはたらくことが 示 された 加 えて プロモーターデリーション 解 析 によって 両 遺 伝 子 の 発 現 に 必 須 の 領 域 も 特 定 できた また dia1/fkbp2 プロモーターの 特 性 を 利 用 した 増 殖 分 化 統 御 のマーカー suika の 作 製 により これまで 困 難 を 伴 った 粘 菌 細 胞 の 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えプロセスと 初 期 分 化 プロセスの 分 離 に 成 功 し これを 用 いたアッセイにより 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えプロセスに 係 る 遺 伝 子 と 初 期 分 化 プロセスに 係 る 遺 伝 子 を 特 定 できたことは 意 義 深 いといえる 今 後 DIA1 および DIA2 とその 他 の PS 点 に 関 与 するタンパク 質 との 関 係 を 調 べることで PS 点 近 傍 での 分 子 ネットワークを 明 らにし それらの 機 能 解 析 を 通 じて 行 けば 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 えにおけるメカニズムに 肉 薄 できることを 期 待 する 45

6 論 文 審 査 結 果 の 要 旨 発 生 細 胞 研 究 のモデル 生 物 として 注 目 されている 細 胞 性 粘 菌 では きわめて 優 れた 同 調 培 養 系 が 既 に 確 立 されており 増 殖 から 分 化 へのチェックポイントが 細 胞 周 期 上 に1つの 特 異 点 (PS 点 ) と して 特 定 されている したがって この 生 物 は 増 殖 と 分 化 との 関 係 とりわけ 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 え(growth/differentiation transition; GDT)の 分 子 機 構 を 解 析 する 上 で 格 好 の 実 験 系 になっている PS 点 からの 分 化 に 伴 って 特 異 的 に 発 現 する6つの 遺 伝 子 のうち 申 請 者 は 特 に dia1 遺 伝 子 について 機 能 解 析 を 進 め 以 下 に 示 すような 顕 著 な 研 究 成 果 を 得 た dia1 遺 伝 子 は PS 点 での 飢 餓 すなわち 分 化 開 始 に 伴 って 特 異 的 に 発 現 するものであるが その 過 剰 発 現 は 分 化 の 進 行 をむしろ 抑 制 し ホモロガス リコンビネーションによる 遺 伝 子 破 壊 は 分 化 に 促 進 的 にはたらくことが 明 らかにされた dia1 は 面 白 いことに 別 の 遺 伝 子 (fkbp2)とプロモータ ー 領 域 を 共 有 しており この 共 通 プロモーター 領 域 は 双 方 向 性 をもち fkbp2 遺 伝 子 は 飢 餓 に 伴 って その 発 現 を 停 止 し 逆 に dia1 遺 伝 子 は 飢 餓 ( 分 化 )に 際 して 発 現 を 開 始 することが 示 された また このプロモーター 領 域 のきわめて 短 い 領 域 ( 約 140bp)が 両 遺 伝 子 の 主 要 な 活 性 調 節 部 位 であること そして 増 殖 期 と 分 化 期 では 相 異 なる 転 写 調 節 因 子 がこのプロモーター 領 域 に 結 合 していることを 明 らかにした さらに 増 殖 / 分 化 の 切 り 換 え(GDT)を 可 視 化 する 目 的 で 共 通 プロモーター 領 域 の fkbp2 側 に GFP 遺 伝 子 を dia1 側 に DS-red 遺 伝 子 を 繋 ぎ このベクター( suika ベクターと 命 名 )を 粘 菌 細 胞 に 導 入 したところ 得 られた 形 質 転 換 体 は 蛍 光 顕 微 鏡 下 において 増 殖 期 においては 緑 色 を 分 化 期 では 赤 色 を 呈 することが 実 際 に 確 認 された さらに この suika ベクターを 種 々の 集 合 不 能 変 異 種 に 導 入 して 解 析 した 結 果 アデニル 酸 シクラーゼ(ACA)とGタンパク 質 βサブユニット(gβ)は まさに GDT のプロセスで また camp レセプター1(CAR1)は GDT 以 降 の 初 期 分 化 のプロセスで 機 能 していることが 示 された これらの 事 実 はまた REMI( 制 限 酵 素 介 在 型 遺 伝 子 挿 入 ) 法 によってラ ンダム 変 異 を 導 入 した 細 胞 に suika ベクターを 導 入 すれば 種 々の GDT あるいは 分 化 不 能 変 異 種 を FACS(cell sorter)により 効 率 的 に 峻 別 採 取 できる 可 能 性 を 示 唆 した これらの 成 果 は いずれも 学 問 的 に 高 く 評 価 されるものであり 将 来 的 にも GDT の 分 子 的 メカニ ズムを 解 明 する 上 できわめて 有 望 なシステムを 提 供 するものである これらは 申 請 者 の 高 い 学 問 的 素 養 すぐれた 実 験 技 術 と 実 行 力 に 支 えられてはじめて 達 成 できたものと 判 断 する このことは 本 人 が 自 立 して 研 究 活 動 を 行 うに 必 要 な 高 度 の 研 究 能 力 と 学 識 を 有 することを 示 している したがって 広 瀬 滋 規 提 出 の 論 文 は 博 士 ( 生 命 科 学 )の 学 位 論 文 として 合 格 と 認 める 46

- 1 - 総 控 負 傷 疾 病 療 養 産 産 女 性 責 帰 べ 由 試 ~ 8 契 約 契 約 完 了 ほ 契 約 超 締 結 専 門 的 知 識 技 術 験 専 門 的 知 識 高 大 臣 専 門 的 知 識 高 専 門 的 知 識 締 結 契 約 満 歳 締 結 契 約 契 約 係 始

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