Table 1 Comparison with three HIV antigen and antibody screening tests Principle Detection of anti-hiv antibody gp41 HIV-1 Detection of HIV antigen Ti

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いとはいそみ
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1 技術論文ルミパルス f を用いた同時検出試薬の性能評価石垣卓也 1) 康東天 2) 服部佳奈子 1) 山中基子 1) 堀田多恵子 1) 1) 九州大学病院検査部福岡県福岡市東区馬出 ) 九州大学大学院医学研究院臨床検査医学分野要旨今回富士レビオ社が開発した第 4 世代検査試薬であるルミパルス以下本試薬の性能評価を行った同時再現性日差再現性およびプロゾーン試験に関しては良好な結果であった同じ第 4 世代検査試薬であるアーキテクトコンボアッセイおよび試薬を用いた Seroconversion Panel の測定結果では 4 種中 2 種において本試薬が最も早期に検出した残り 2 種においても他試薬と同等の検出時期であった HIV-1 p24 抗原の希釈感度試験においても本試薬は試薬と同等の検出感度であり高い検出感度を有していることが示唆された一方干渉物質の影響では乳びにて負の影響および RF にて正の影響が認められたまた相関試験では本試薬のみ陽性となった検体が 2 例認められマイクロフィブリンの影響が示唆された以上のことから本試薬は第 4 世代検査試薬の特徴である HIV-1 p24 抗原の検出感度に優れ早期検出が期待できるが RF による影響やマイクロフィブリンによる偽陽性などが発生するため陽性を示した際は判定に注意する必要があるキーワードルミパルス f HIV HIV-1 p24 window period RF ヒト免疫不全ウイルス Human Immunodeficiency れていたしかし抗体検査法では感染成立から抗 virus HIV は後天性免疫不全症候群 Acquired 体産生までに一定の期間 window period が存在 Immune Deficiency Syndrome AIDS の病因でありし感染成立後早期に抗体を検出することは困難で遺伝学的系統関係から HIV-1 と HIV-2 の 2 種に分類あったこの期間をさらに短縮するため新たにされている我が国における HIV 感染者は年々増加 HIV-1 抗原 HIV-1 p24 抗原を同時に検出可能としし HIV スクリーニング検査の重要性がますますた第 4 世代検査法が開発され第 3 世代検査法より高まっているまた抗レトロウイルス療法 Anti- もさらに数日早く検出することが可能となった 3), 4) 1) Retroviral Therapy ART により HIV の増殖を抑今回我々はルミパルス f を用いた同制し患者の免疫能を回復させ AIDS 発症を遅ら時検出試薬の基本性能評価および現在市販されせることが可能となっているこのことから HIV ている同じ第 4 世代検査法間にて比較する機会を得感染症の早期発見は HIV の拡散防止のみならずたので報告する 2) 治療の観点からも重要である従来の HIV スクリーニング検査では IgG 型であ I 対象および方法る HIV-1 抗体および HIV-2 抗体を検出する第 2 世代検査法もしくは IgM 型である HIV-1 抗体および HIV-2 抗体を検出する第 3 世代検査法が広く用いら 1 試薬および装置本試薬はルミパルス f 富士レビオ社を用いて平成 27 年 2 月 23 日受付平成 27 年 3 月 19 日受理医学検査 Vol.64 No

高い検出感度を有していることが示唆された一方干渉物質の影響では乳びにて負の影響および RF にて正の影響が認められたまた相関試験では本試薬のみ陽性となった検体が 2 例認められマイクロフィブリンの影響が示唆された以上のことから本試薬は第 4 世代検査試薬の特徴である HIV-1 p24 抗原の検出感度に優れ早期検出が期待できるが RF による影響やマイクロフィブリ

2 Table 1 Comparison with three HIV antigen and antibody screening tests Principle Detection of anti-hiv antibody gp41 HIV-1 Detection of HIV antigen Time (min) Sample (μl) antibody N1-9 (mouse) antibody N3-3 (mouse) (Fujirebio) CLEIA Architect (Abbott japan) CLIA gp41 HIV-1 gp41 HIV-1(O) gp36 HIV-2 antibody (mouse) 29 1 (Sysmex) CLEIA undetermined antibody (human) 17 3 gp36 HIV-2 測定し比較対照法として同じ第 4 世代検査法である ARCHITECT アナライザー i2 アボットジャ II 成績結果パン社を用いたアーキテクトコンボアッセイ以下アーキテクトおよびシスメックス社を用いた試薬以 1 同時再現性陽性プール血清を陰性血清を用いて濃度の異な下を用いて測定した Table 1 る 3 種類の試料陰性低値陽性高値陽性を調 2 測定原理整したこれら 3 濃度の試料を連続 1 回測定し同本試薬はアルカリホスファターゼ ALP 標識抗時再現性について検討したなお前処理による要原あるいは抗体を用い化学発光基質として 3-2'- 因の影響を避けるため前処理を行った検体を基にスピロアダマンタン -4-メトキシ-4-3''-ホスホリ重複測定を行った陽性試料については低値陽性ルオキシフェニル-1,2-ジオキシセタン 2 ナトリ高値陽性ともに CV 4%未満と良好であったまたウム塩以下 AMPPD を使用する化学発光酵素陰性試料についても測定値は.2.3 C.O.I と安定免疫法 CLEIA 法を原理としている測定には前しており良好であった Table 2 処理操作が必要となっており検体 5 容量に対して 2 日差再現性処理液 1 容量を混合し測定用検体とする本試薬 3 にて凍結した上記試料およびメーカー指定では検体 2 μl に対して処理液 4 μl を加え測定のコントロール試料を用いて 1 日間 1 日 1 回測定用試料とした抗 HIV 抗体検出では HIV-1 リコンビを行った陽性試料については血清試料コントローナント gp41 抗原と HIV-2 リコンビナント gp36 抗原ル試料ともに CV 4%未満と良好であった陰性試料をそれぞれ結合させたフェライト粒子と検体中の抗についても測定値は.2.3 C.O.I と安定してお HIV-1 抗体および抗 HIV-2 抗体を反応させ免疫複り良好であった Table 3 合体を形成するまた HIV-1 p24 抗原検出では 3 希釈感度試験 HIV-1 p24 モノクローナル抗体 N1-9 と HIV-1 p24 モ WHO International Standard NIBSC code:9/636 ノクローナル抗体 N3-3 をそれぞれ結合させたフェ HIV-1 p24 抗原を基に.25 IU/mL から 2. ライト粒子と検体中の HIV-1 p24 抗原を反応させ IU/mL までの 6 系統の希釈系列を調整したこれら免疫複合体を形成する B/F 分離を行った後 ALP の試料を各試薬にて 1 回測定を行った本試薬標識 HIV-1 リコンビナント抗原や ALP 標識 HIV-2 はともに.5 IU/mL にて陽性と判定されたリコンビナント抗原および ALP 標識抗 HIV-1 p24 一方アーキテクトでは 1. IU/mL にて陽性と判定抗体を作用させ免疫複合体を形成させる再び B/F 分離を行った後基質である AMPPD を作用させ発 Table 2 Within-run precision 光した光を検出し抗 HIV-1 抗体抗 HIV-2 抗体 HIV-1 p24 抗原を検出している 344 Mean S.D. C.V. (%) Low positive High positive 医学検査 Vol.64 No.3 215

比較対照法として同じ第 4 世代検査法である ARCHITECT アナライザー i2 アボットジャ II 成績結果パン社を用いたアーキテクトコンボアッセイ以下アーキテクトおよびシスメックス社を用いた試薬以 1 同時再現性陽性プール血清を陰性血清を用いて濃度の異な下を用いて測定した Table 1 る 3 種類の試料陰性低値陽性高値陽性を調 2

3 Table 3 Between-day precision Serum sample Control sample Low positive High positive Positive 1 (anti-hiv-1 antiboby) Positive 2 (anti-hiv-2 antiboby) Positive 3 (HIV-1 p24 antigen) Mean S.D. C.V. (%) Table 4 Comparison of the sensitivities of three HIV antigen and antibody screening tests using WHO International Standard NIBSC IU/mL Architect (S/CO) されており本試薬の HIV-1 p24 抗原に対する感度はと同等でありアーキテクトと比較して高はが他の第 4 世代検査法と異なり最も遅く 21 日目に陽性となる結果となったこれは第 3 世代検査法であるオーソ HIV-1/2 と同じ検出時期であった 5 プロゾーン試験 HIV-1 抗体強陽性検体 ProMedDx 社および HIV-2 抗体強陽性検体 SCIPAC 社 HIV 抗原強陽性検体の 1 倍希釈による多段希釈系列を調整し各測定試薬のプロゾーン現象の有無を確認したその結果全ての測定試薬にてプロゾーン現象は確認されなかった Table 6 6 干渉物質の影響干渉物質の影響を調べるため干渉チェック A プい感度を有していた Table 4 ラスシスメックス社を用いて陽性試料陰性試 4 感染初期の早期検出能試験料に添加し評価を行ったその結果遊離型ビリ Boston Biomedical Inc. (BBI) HIV Seroconversion Panel (PRB4, PRB961) および ZeptoMetriy Seroconversion Panel (HIV912, HIV932)を用い感染初期の早期検出能について検討を行った Table 5 各 Panel の No. 1 は HIV に感染したと疑われ採血を始めた日 Day であり No. 2 以降の検体については No. 1 からの経過日数を表記しているルミパルスプレストオーソ HIV-1/2 第 3 世代検査法ルミパルスオーソ HIV-1/2 第 2 世代検査法における各 Panel の測定は富士レビオ社に依頼した HIV-1 RNA Western blotting の結果については各 Panel 付随の添付資料より引用した本試薬は全てのパネル血清においてアーキテクトと比較して同等かまたはそれよりも早期に検出することが可能であった PRB4 HIV912 HIV932 では第 4 世代検査法であるアーキテクトに対して 2 日から 7 日早期に検出できており早期検出能を有していた PRB4 において医学検査 Vol.64 No ルビンでは 19.5 mg/dl まで抱合型ビリルビンでは 2.9 mg/dl までヘモグロビンでは 487 mg/dl まで影響は認められなかった一方乳びでは陽性試料にて濃度に応じた負の影響を認めた干渉チェック RF プラスを用いた評価では陽性試料陰性試料ともに RF の濃度に応じて測定値に正の影響が認められた Figure 1 このことを確認するため高値 RF 患者血清 3 例を用いた添加回収試験を行った陽性試料が 1 倍希釈になるように高値 RF 患者血清を添加し測定した対照として RF 濃度 31 U/mL の患者血清を同様に添加し測定を行ったその結果対照を 1% とした場合全ての検体において正の影響が認められた Table 7 7 相関陽性相関として 212 年 12 月から 213 年 4 月の間に HIV-1 RNA 検査にて陽性が確認された 16 例陰性相関として入院および外来患者の残血清 99 例計 115 例の検体を用い本試薬と対照法との相関を 345

(%) Table 4 Comparison of the sensitivities of three HIV antigen and antibody screening tests using WHO International Standard NIBSC IU/mL Architect (S/CO).6 1. 1.4 1.8 2.7 3.5.37.68.99 1.27 1.78 2.

4 Table 5 Detection of HIV infection in four HIV seroconversion panels Panel No. Day Architect Presto Ortho HIV-1/2 Ortho HIV-1/2 HIV-1 RNA* Western blotting* Generation 4th 4th 4th 3rd 2nd C.O.I Result S/CO Result C.O.I Result copies/ml PRB 4 PRB 961 HIV 912 HIV BLD NEG BLD NEG BLD NEG , NEG , NEG , NEG 7 21 > >8, NEG <5 IND <5 IND <5 IND <5 IND <5 IND <5 IND IND , IND 9 29 > , IND NEG <5 NEG NEG NEG ,74 NEG ,8 NEG 7 21 > > >5, NEG 8 23 > > >5, p24 p16(vf) <5 NEG <5 NEG <5 NEG <5 NEG NEG ,57 NEG ,6 NEG ,815 NEG ,3 p ,425 p24, p ,161 p24, p ,52 p24, p ,967 p24, p65, gp ,377 p24, p65, gp16 *Data from panel data sheet. BLD; below limits of detection, NEG; negative, IND; indeterminate. 評価したその結果, 陽性検体では全例一致したが, 陰性検体において 2 例, 本試薬のみが陽性を示した (Table 8) 乖離した 2 例について各分析試薬での測定値及び, 本試薬にて再検査を実施した結果を示す (Table 9) No. 1 は 3 回再検を行ったが, 再現性は得られず, No. 2 では 2 回再検して全て陰性となった乖離した 2 例は HIV-1 RNA 検査の依頼がなく,HIV 感染歴は不明であったが, 再検査での測定値が初回値と異な 346 医学検査 Vol.64 No.3 215

1 + 1.2.2 >8, NEG 1.2.8..2.1 <5 IND 2 5.2.6..2.1 <5 IND 3 7.2.9..2.1 <5 IND 4 12.2.9..2.1 <5 IND 5 14.2.9..2.1 <5 IND 6 19.2.9..2.1 <5 IND 7 21.2.1..2.1 48 IND 8 27 1.4 + 8.7 + 13.7 +.2.1 15, IND 9 29 >15 + 26.

5 Table 9 Comparison of two unmatch test and retest of Lumipluse Table 6 Prozone phenomenon of high titers HIV-1 Ab positive HIV-2 Ab positive HIV-1 p24 Ag positive Architect HIV Ag/Ab combo assay (S/CO) Dilution > > > 年に出版された診療における HIV-1/2 感染症診断のためのフローチャートにおいて HIV-1/ 十分に高い検査法であることが望まれている 5) 今 1 1, >1. 回検討に用いた BBI Seroconversion Panel および 11 1, > ,28.65 >1. ZeptoMetriy Seroconversion Panel にて本試薬は比較 > >1. かそれ以上早期に HIV を検出可能であったまた HIV-1 p24 抗原を用いた希釈感度試験の結果か Architect HIV Ag/Ab (S/CO) Retest III 考察スクリーニング検査法に用いられる方法は感度が対照としたアーキテクトやに対して同等らも HIV 早期検出能の高さを示しており他の第 4 世代検査法と比較して検出感度の高い検査法であることが確認された一方相関に用いた検体にお Table 7 Recovery test of RF No. 1 No. 2 No. 3 No. 1 No. 2 いて 2 例偽陽性検体が認められた初回値と再検 RF Concentration (IU/mL) Contrast quantity Recovered quantity Recovery (%) 値の乖離については検体由来のマイクロフィブリ 1,188 1, もマイクロフィブリンによる影響が示唆されたこンによる影響が報告されており 6) 本試薬においてのことから本試薬添付文書においても陽性となった検体については再検査を行い再現性を確認する Table 8 Corelation between and comparison assay に知られており各社 RF の影響を考慮した試薬が Positive Total Architect combo assay を調べた際本試薬は RF の濃度に比例して正の影響を受けていた RF による測定値への影響は一般的 n = 115 ことが推奨されているまた干渉物質による影響 Positive Total Concordance rate 98.3% 設計されている本試薬が RF の影響を受けた原因は不明であるが影響を受けることから陽性検体に対する扱いや再検基準の設定などには十分注意する必要がある Seroconversion Panel PRB4 を用いた評価ではり再現性が得られないことから検体由来の影響が第 4 世代検査法であるが第 3 世代検査法と考えられ検体中に含まれるマイクロフィブリンの同じ時期となったが他の Panel 希釈感度試験に用影響が示唆されたいた試料プロゾーン試験で使用した HIV-1 p24 リコンビナント抗原などを用いた評価ではの医学検査 Vol.64 No

3 症診断のためのフローチャートにおいて HIV-1/2 14.4.83.1 15.2.16. 十分に高い検査法であることが望まれている 5) 今 1 1,645.47 >1. 回検討に用いた BBI Seroconversion Panel および 11 1,616.22 >1. 12 1,28.65 >1.

6 C.O.I Bilirubin F C.O.I Bilirubin C C.O.I Hemoglobin C.O.I Turbidity Bilirubin F 15 Positive Bilirubin C Positive Hemoglobin Positive C.O.I Rheumatoid factor C.O.I Rheumatoid factor 7.8 Positive , 1,5 Turbidity Positive 5 1, 1, IU/mL IU/mL Figure 1 Effect of interference substances and Rheumatoid factor (RF) HIV-1 p24 抗原に対する感度は他の第 4 世代と同 Seroconversion Panel においても本試薬のみが他の等かそれ以上の性能であったこのことから PRB4 試薬に比べ早期に検出することが可能であったまにてが HIV 抗原と反応しなかったのはた偽陰性などの未反応もなくスクリーニング試 HIV-1 p24 抗原認識部位に変異が発生しの薬としての性能を十分に満たしているといえるモノクローナル HIV-1 p24 抗体が反応できなかった可能性が考えられる認識部位の変異による抗原検出の偽陰性は B 型肝炎ウイルスにおける HBs 抗原検査などで報告例があり PRB4 の HIV も同様に抗原認識部位であ 7 ), 8 ) る gag 領域に変異が発生し偽陰性になったと推測しかし相関検体における偽陽性検体や RF による偽陽性反応など非特異反応が見られることがあるため判定の際には十分注意する必要がある今後 HIV 感染者数は増加していくと考えられ早期発見による拡散防止や早期治療のため本試薬のスクリーニング試薬としての有用性が期待されるされるこれに対して本試薬では抗原決定基が 2 つあり HIV に変異が起こり 1 つの抗原決定基が本論文の内容は第 53 回日本臨床化学会年次学術反応しなくてももう 1 つの抗原決定基がこれを補集会 213 年 8 月徳島にて報告したうことができ偽陰性となることを回避することが可能と考えられる IV 結語今回検討に用いたルミパルスは他の第 4 世代に比べ同等かそれ以上の感度を有しており 348 文献 1) 白坂琢磨他平成 23 年エイズ発生動向年報厚生労働省エイズ動向委員会 ) 平成 25 年度厚生労働科学研究費補助金エイズ対策研究事業抗 HIV 治療の開始時期成人慢性期抗 HIV 治療ガイドライン HIV 感染症及びその合併症の課題を克服する研究班編 ) Stekler J et al.: Screening for acute HIV infection: Lessons 医学検査 Vol.64 No.3 215

7 learned, Clin Infect Dis, 27; 44: ) 桜庭尚哉他ルミパルス Presto II を用いた同時検出試薬の基礎性能評価医学と薬学 211; 65: ) 山本直樹他診療における HIV-1/2 感染症の診断ガイドライン 28 日本エイズ学会日本臨床検査医学会標準推奨法日本エイズ学会誌 29; 11: ) 井本真由美他マイクロチップ電気泳動法を利用した AFP AFP-L3%および PIVKA-II 測定の評価基礎検討検体安定性およびマイクロフィブリンの影響について医学と薬学 211; 66: ) 松田親史他 S 領域の変異株による HBs 抗原 EIA 法偽陰性の 1 例と HBs 抗原関連試薬の反応性感染症学雑誌 211; 85: ) 出口松夫他 HBs 抗原検出感度と変異株検出能における 7 種類の免疫学的測定試薬の評価感染症学雑誌 25; 79: Technical Article Evaluation of fourth-generation measurement of HIV antigen antibody with f Takuya ISHIGAKI 1) Kanako HATTORI 1) Motoko YAMANAKA 1) Taeko HOTTA 1) Dongchong KANG 2) 1) Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Kyushu University Hospital (3-1-1, Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka , Japan) 2) Department of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University Summary We evaluated a new fourth-generation HIV test, assay, for the measurement of the HIV antigen and antibody. Good results were obtained for the within-run precision, between-day precision and prozone phenomenon of high titers. In the detection of HIV infection using four HIV seroconversion panels, HIV Ag/Ab assay detected more quickly than a comparison assay using two samples. In the comparison of the sensitivities to the HIV-1 p24 antigen using WHO International Standard NIBSC, assay was observed to have a higher sensitivity than Architect. However, we observed negative interference in the chyle test and a positive interference in the rheumatoid factor test. In a correlation test, two samples were unmatched between the assay and the comparison assay. In this study, although assay was good for screening HIV infection, it was necessary to judge a positive result carefully. Key words: f, HIV, HIV-1 p24, window period, RF (Received: February 23, 215; Accepted: March 19, 215) 医学検査 Vol.64 No

6) 井本真由美他マイクロチップ電気泳動法を利用した AFP AFP-L3%および PIVKA-II 測定の評価基礎検討検体安定性およびマイクロフィブリンの影響について医学と薬学 211; 66: 535 54. 7) 松田親史他 S 領域の変異株による HBs 抗原 EIA 法偽陰性の 1 例と HBs 抗原関連試薬の反応性感染症学雑誌 211; 85: 21 25.

2 参考検体投入部遠心機開栓機感染症検査装置感染症検査装置 (CL4800)

2 参考検体投入部遠心機開栓機感染症検査装置感染症検査装置 (CL4800) 1 平成 19 年 11 月 14 日血液事業部会運営委員会配布資料資料 1 検査法の変更について (CLEIA 法の導入について ) 1. 対象検査項目現在の検査項目 HBs 抗原 HBc 抗体 HBs 抗体 HTLV-1 抗体 HIV1/2 抗体 HCV 抗体梅毒 TP 抗体パルボウイルス B19 抗原のすべての検査項目について検査方法を凝集法から化学発光酵素免疫法 (CLEIA 法 )