高 い 免 疫 賦 活 能 を 有 するパン 酵 母 の 開 発 と その 活 性 化 因 子 の 解 析 2014 年 3 月 大 阪 市 立 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 たかだ ゆうき 髙 田 裕 紀

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1 高 い 免 疫 賦 活 能 を 有 するパン 酵 母 の 開 発 と その 活 性 化 因 子 の 解 析 2014 年 3 月 髙 田 裕 紀

2 高 い 免 疫 賦 活 能 を 有 するパン 酵 母 の 開 発 と その 活 性 化 因 子 の 解 析 2014 年 3 月 大 阪 市 立 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 たかだ ゆうき 髙 田 裕 紀

3 目 次 第 1 章 緒 論 1.1 はじめに 1.2 S. cerevisiae の 細 胞 壁 構 造 1.3 β-グルカンの 構 造 と 機 能 1.4 酵 母 細 胞 と 免 疫 細 胞 の 接 触 による 影 響 1.5 本 研 究 の 目 的 参 考 文 献 第 2 章 実 験 室 酵 母 mcd4δ の in vivo での 免 疫 賦 活 能 2.1 はじめに 2.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 増 殖 の 測 定 マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 酵 母 のマウスへの 腹 腔 内 投 与 2.3 結 果 と 考 察 mcd4δ の 増 殖 能 の 評 価 mcd4δ のマクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 in vivo での mcd4δ の 免 疫 賦 活 能 2.4 まとめ 参 考 文 献 i

4 第 3 章 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 取 得 とその 性 状 解 析 3.1 はじめに 3.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 細 胞 壁 変 異 株 の 選 抜 マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 増 殖 と CO 2 発 生 量 の 測 定 細 胞 壁 解 析 3.3 結 果 と 考 察 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 選 抜 増 殖 能 と 発 酵 能 の 評 価 細 胞 壁 解 析 3.4 まとめ 参 考 文 献 第 4 章 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 変 異 部 位 の 同 定 4.1 はじめに 4.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 ゲノムライブラリーを 用 いた 形 質 転 換 相 補 プラスミドを 持 つ 株 の 選 抜 酵 母 からのプラスミド 回 収 相 補 プラスミドの 配 列 解 析 プラスミドの 構 築 変 異 を 相 補 する 遺 伝 子 の 決 定 ii

5 4.2.8 変 異 株 の 表 現 型 相 補 に 関 する 実 験 細 胞 壁 解 析 増 殖 の 測 定 高 温 感 受 性 と CFW 感 受 性 マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 配 列 解 析 と 変 異 部 位 の 同 定 4.3 結 果 と 考 察 ゲノムライブラリーを 用 いた 形 質 転 換 から 相 補 プラスミドの 取 得 変 異 遺 伝 子 の 同 定 NDD1 遺 伝 子 による 表 現 型 の 相 補 AQ-37 株 の NDD1 遺 伝 子 変 異 部 位 の 同 定 4.4 まとめ 参 考 文 献 第 5 章 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 二 倍 体 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 取 得 とそ の 性 状 解 析 5.1 はじめに 5.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 二 倍 体 変 異 株 の 選 抜 マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 増 殖 と CO 2 発 生 量 の 測 定 NDD1 遺 伝 子 による 表 現 型 の 相 補 ヒト 免 疫 細 胞 の 活 性 化 能 の 評 価 細 胞 壁 解 析 5.3 結 果 と 考 察 iii

6 5.3.1 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 二 倍 体 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 選 抜 増 殖 能 と 発 酵 能 の 評 価 NDD1 遺 伝 子 による 表 現 型 の 相 補 ヒト 免 疫 細 胞 の 活 性 化 能 の 評 価 細 胞 壁 解 析 5.4 まとめ 参 考 文 献 第 6 章 総 括 97 論 文 目 録 101 謝 辞 103 iv

7 第 1 章 緒 論 1.1 はじめに 酵 母 は 古 くから 醸 造 やパン 製 造 などに 用 いられている 我 々の 日 常 に 馴 染 みの 深 い 微 生 物 である その 一 方 で 生 化 学 細 胞 生 物 学 遺 伝 学 などの 分 野 で 長 年 研 究 材 料 とし て 用 いられてきた 自 然 界 における 酵 母 は 果 実 や 穀 物 樹 液 など 様 々な 場 所 に 存 在 し ている 形 態 や 出 芽 や 分 裂 などの 増 殖 様 式 の 違 いから 様 々な 種 に 分 類 され 現 在 では 500 種 以 上 約 60 属 の 酵 母 が 知 られている[1] モデル 生 物 として 頻 繁 に 使 用 される 出 芽 酵 母 Saccharomyces cerevisiae や 分 裂 酵 母 Schizosaccharomyces pombe では 無 性 的 に 一 倍 体 のみで 細 胞 分 裂 を 行 う 一 方 で 有 性 的 に 接 合 し 二 倍 体 も 形 成 する さらに 二 倍 体 は 栄 養 飢 餓 状 態 におかれると 減 数 分 裂 により 細 胞 内 に 胞 子 (S. cerevisiae では 接 合 型 a と 接 合 型 α)を 2 個 ずつ 形 成 する( 図 1.1) この 胞 子 を 顕 微 鏡 下 でマニュピュレータ ーを 用 いて 分 離 し 各 胞 子 の 性 状 を 解 析 することができる( 四 分 子 分 析 ) また この 一 連 の 生 活 環 を 利 用 して 変 異 を 掛 け 合 わせ 多 重 変 異 株 が 構 築 されている 酵 母 の 培 養 は 安 価 な 培 養 成 分 で 行 うことができ 倍 加 時 間 が 数 時 間 程 度 と 他 の 真 核 細 胞 に 比 べて 非 常 に 短 い S. cerevisiae や S. pombe に 代 表 される 酵 母 は 真 核 生 物 としての 基 本 的 な 細 胞 構 造 と 機 能 を 備 えており 培 養 や 遺 伝 子 操 作 が 容 易 であることから 優 れた 研 究 材 料 と 言 え る 特 に 本 研 究 で 用 いる S. cerevisiae は 全 ゲノムの 塩 基 配 列 が 決 定 されて 約 6,000 個 の 遺 伝 子 が 知 られており[2] 種 々の 遺 伝 子 破 壊 株 や 組 換 え 用 のベクターが 構 築 され ている また S. cerevisiae はその 使 用 目 的 に 応 じ パン 酵 母 ワイン 酵 母 清 酒 酵 母 などと 呼 ばれている 近 年 その 利 用 は 発 酵 醸 造 産 業 のみならず 医 療 や 環 境 エネル ギー 分 野 にまで 幅 広 く 利 用 されている このように S. cerevisiae は 実 用 面 においても 基 礎 研 究 においても 有 用 な 生 物 である 1

8 出 芽 一 倍 体 a 発 芽 胞 子 接 合 減 数 分 裂 二 倍 体 一 倍 体 α a/α 出 芽 発 芽 出 芽 図 1.1 出 芽 酵 母 S. cerevisiae の 生 活 環 S. cerevisiae は 無 性 的 に 一 倍 体 のみで 細 胞 分 裂 を 行 う 一 方 で 有 性 的 に 接 合 し 二 倍 体 を 形 成 する さらに 二 倍 体 は 栄 養 飢 餓 状 態 におかれると 減 数 分 裂 により 細 胞 内 に 接 合 型 a と 接 合 型 α の 胞 子 を 2 個 ずつ 形 成 する 1.2 S. cerevisiae の 細 胞 壁 構 造 酵 母 は ヒトと 同 じ 真 核 生 物 であるが 最 外 層 に 細 胞 壁 構 造 を 有 する 点 で 動 物 細 胞 と は 異 なる 細 胞 壁 は 外 界 の 物 質 が 細 胞 内 に 入 る 際 の 最 初 の 関 門 であり 細 胞 の 物 理 的 強 度 を 保 つ 上 でも 重 要 な 構 造 体 である[3] S. cerevisiae の 細 胞 壁 は 細 胞 乾 燥 重 量 の 10 30%を 占 め その 組 成 は 最 外 層 のマンナンタンパク 質 とその 内 側 の β-1,3-グルカン と β-1,6-グルカンから 構 成 される β-グルカン キチンから 成 る( 図 1.2 表 1.1)[3 4] それらが 互 いに 結 合 し 複 雑 な 構 造 を 取 ることで 柔 軟 性 と 強 度 を 生 み 出 している 細 胞 2

9 壁 タンパク 質 に 付 加 されるマンナンは 重 合 度 が 約 200 でその 合 成 に 関 わる 遺 伝 子 が 約 20 種 知 られている[2] また β-1,3-グルカンは 重 合 度 が 約 1500 で FKS1 遺 伝 子 や GSC2 遺 伝 子 が 合 成 酵 素 の 触 媒 サブユニットをコードすることが 報 告 されている[2 3] 一 方 文 献 により 異 なるが β-1,6-グルカンの 重 合 度 は であることが 報 告 されて おり その 合 成 に 関 わる 遺 伝 子 については 多 数 報 告 があるが 合 成 酵 素 は 明 らかになっ ていない[ ] キチンは 重 合 度 が 約 120 で 合 成 酵 素 の 遺 伝 子 として CHS1 CHS2 CHS3 と 報 告 されている[2 3] これらの 多 糖 成 分 は 動 物 細 胞 には 存 在 しない ため Candida albicans などの 病 原 真 菌 に 対 する 抗 真 菌 剤 の 標 的 として 注 目 されている 例 えば β-1,3-グルカン 合 成 を 阻 害 する 薬 剤 ミカファンギン[7 8]が 抗 真 菌 剤 として 上 市 されている 細 胞 壁 成 分 の 合 成 は 細 胞 内 部 や 細 胞 膜 上 の 合 成 酵 素 によって 行 われ それら 酵 素 の 活 性 や 遺 伝 子 発 現 は 細 胞 周 期 や 浸 透 圧 変 化 に 伴 うシグナル 伝 達 によって 制 御 されている[3] また 細 胞 壁 成 分 の 一 つが 急 激 に 減 少 すると 他 の 成 分 の 増 加 により 細 胞 壁 の 欠 陥 を 補 う 働 きも 知 られており 多 くの 場 合 キチン 量 が 増 大 し 細 胞 の 強 度 を 守 っている[9] 酵 母 の 細 胞 壁 タンパク 質 の 多 くは 糖 脂 質 であるグリコシルフォスファチジルイノシ トール(GPI)によって 細 胞 壁 や 細 胞 膜 に 固 定 されている GPI があたかも 錨 のように 作 用 することから このタイプのタンパク 質 は GPI アンカー 型 タンパク 質 と 呼 ばれ 60 種 類 以 上 同 定 されており 小 胞 体 を 経 由 して 細 胞 膜 や 細 胞 壁 に 局 在 する[ ] ( 図 1.3) その 他 に β-1,3-グルカンに 直 接 結 合 する PIR 型 タンパク 質 や 非 共 有 結 合 型 タンパク 質 が 報 告 されている[2] これらタンパク 質 の 細 胞 表 層 への 固 定 メカニズムを 応 用 して 外 来 タンパク 質 を 酵 母 細 胞 表 層 に 固 定 する 技 術 が 開 発 され[12] この 技 術 によって 酵 母 の 新 たな 利 用 方 法 が 開 拓 されつつある また 細 胞 壁 強 度 の 保 持 に 重 要 な 役 割 を 果 たしている β-1,3-グルカンは 免 疫 賦 活 能 を 持 つ 物 質 として 注 目 されており 次 節 でその 詳 細 を 述 べる 3

10 図 1.2 S. cerevisiae 細 胞 壁 の 模 式 図 組 成 は 細 胞 壁 乾 燥 重 量 当 たりの 各 成 分 の 重 量 を%で 表 示 している 4

11 図 1.3 GPI アンカー 型 タンパク 質 の 局 在 と 構 造 A: 局 在 GPI アンカー 型 タンパク 質 は 小 胞 体 ゴルジ 体 を 経 由 して 細 胞 膜 に 輸 送 される その 後 ホスホリパーゼ C によって 切 断 され 細 胞 膜 から 遊 離 し β-1,6-グルカンに 結 合 し 細 胞 壁 に 固 定 される B: 構 造 Man(マンノース) GlcN(グルコサミン) Asn(アスパラギン) EtN(エタノールアミン) Ins(イノシトール) P(リン 酸 ) DG(ジアシルグリセロール) を 示 す 5

12 1.3 β-グルカンの 構 造 と 機 能 β-グルカンは パン 酵 母 の 細 胞 壁 に 含 まれるグルコースポリマーである これまでに 次 のような 報 告 がある 1941 年 に 米 国 のルイス ピレマーらがパン 酵 母 抽 出 物 に 抗 癌 作 用 を 見 いだし その 抽 出 物 をザイモサンと 名 付 けた [13] その 後 1960 年 代 に 米 国 の 研 究 チームがパン 酵 母 の 細 胞 壁 から 高 分 子 多 糖 を 抽 出 し β-1,3-グルカンであるこ とを 明 らかにした[14] パン 酵 母 由 来 の β-グルカンの 経 口 摂 取 によりアレルギーなど の 改 善 効 果 が 報 告 されている[15 17] その 他 整 腸 作 用 やコレステロール 低 下 作 用 も 報 告 されている[18 20] また 米 国 では 食 品 医 薬 品 局 が 安 全 性 を 認 定 し 食 品 としての 利 用 が 検 討 されている β-グルカンは パン 酵 母 細 胞 壁 を 抽 出 した 後 マンナンなど 他 の 成 分 を 除 去 して 精 製 されるが 多 段 階 のステップを 要 するため 産 業 的 に 有 用 な β- グルカンの 生 産 法 が 求 められている β-グルカンは 免 疫 担 当 細 胞 の 一 つであるマクロファージの 活 性 化 を 介 して 免 疫 力 を 賦 活 化 すると 考 えられている( 図 1.4)[21 22] β-グルカンはマウスマクロファージ を 活 性 化 しサイトカインの 一 種 である Tumor necrosis factor-α(tnf-α)の 分 泌 を 促 進 す ることや[23] ヒト 単 球 を 活 性 化 しインターロイキン-1β(IL-1β)の 分 泌 を 促 進 するこ とが 知 られている[24] この 活 性 化 機 構 には β-1,3-グルカンとそれに 対 する 特 異 的 受 容 体 Dectin-1 の 結 合 が 関 与 している( 図 1.4)[25] この Dectin-1 と 他 の 受 容 体 Toll like receptor 2 の 活 性 化 を 介 したシグナル 経 路 が 転 写 因 子 nuclear factor-kappa B(NF-κB)を 活 性 化 し 活 性 化 NF-κB がサイトカインの 転 写 を 促 進 することが 知 られている[26] Dectin-1 は 樹 状 細 胞 や 好 中 球 などにも 発 現 している[27 28] そのため β-1,3-グルカ ンはそれら 免 疫 細 胞 の 活 性 化 にも 関 わると 考 えられる また β-グルカンと Dectin-1 の 結 合 には Dectin-1 の 3 つのアミノ 酸 (W221-I222-H223) が 必 要 とされている[29] さらに β-グルカンの 分 岐 構 造 や 立 体 構 造 などが Dectin-1 との 結 合 に 影 響 すると 考 えら れており[21 22] 例 えば 10 個 分 のグルコースがその 結 合 に 必 要 であると 報 告 されて いる[30] しかし β-グルカンの 種 類 によってそれらは 異 なるので 活 性 化 との 関 係 は 明 らかではない 近 年 になり マクロファージ 表 面 の 受 容 体 である NLRP3 や SIGNR も 6

13 β-グルカンを 認 識 し その 活 性 化 に 関 与 していると 報 告 されており[24 31] 活 性 化 機 構 の 詳 細 について 分 子 レベルでの 理 解 が 進 みつつある また 腸 管 免 疫 に 関 する 研 究 から β-グルカンとの 接 触 が 腸 管 上 皮 細 胞 である Caco-2 を 活 性 化 し IL-8 の 分 泌 を 促 進 することが in vitro 実 験 で 明 らかにされている[32] そ の 他 シイタケなどのキノコから 抽 出 された β-グルカンは 医 薬 品 として 利 用 されている また 黒 酵 母 Aureobasidium pullulans は β-グルカンを 細 胞 外 に 大 量 に 分 泌 生 産 すること が 知 られており その 培 養 液 は 厚 生 労 働 省 から 認 可 され 食 品 への 応 用 が 検 討 されている しかし それらの 構 造 は β-1,6 結 合 の 分 岐 が 多 く パン 酵 母 の β-グルカンとは 大 きく 異 なっている[33 35] 図 1.4 β-グルカンの 免 疫 賦 活 能 β-グルカンは 接 触 により 免 疫 担 当 細 胞 であるマクロファージの 細 胞 表 面 受 容 体 Dectin-1 と 結 合 し マクロファージは 活 性 化 される 活 性 化 されたマクロファージはサイトカインを 分 泌 する このサイトカインが 他 の 免 疫 細 胞 を 活 性 化 することで 免 疫 力 を 賦 活 化 すると 考 えられている 1.4 酵 母 細 胞 と 免 疫 細 胞 の 接 触 による 影 響 酵 母 細 胞 と 免 疫 細 胞 の 接 触 による 影 響 については GPI アンカーの 合 成 に 必 須 とされ ている MCD4 遺 伝 子 の 破 壊 株 (mcd4δ)[36]を 用 いて 先 行 研 究 で 示 された[37] この 7

14 株 は 細 胞 表 面 のマンナンタンパク 質 が 減 少 し β-グルカンの 露 出 が 強 く 示 唆 されている そのため 接 触 によりマクロファージを 強 く 活 性 化 し 野 生 株 より 高 濃 度 のサイトカイ ン TNF-α を 分 泌 した 詳 細 は 第 2 章 で 述 べる この 機 能 と 同 様 の 効 果 については 真 菌 の 感 染 機 構 解 明 を 目 的 に 真 菌 細 胞 との 接 触 が マクロファージなどの 免 疫 細 胞 に 与 える 影 響 について 研 究 されている S. cerevisiae や C. albicans の 真 菌 細 胞 との 接 触 により マクロファージは TNF-α を 分 泌 し その 分 泌 量 は C. albicans より S. cerevisiae の 方 が 高 かったことが 報 告 されている[38] さらに C. albicans では 細 胞 壁 構 造 が 異 なる 2 種 の 細 胞 形 態 ( 酵 母 形 態 あるいは 菌 糸 形 態 )によ って 接 触 によりマクロファージや 単 球 から 分 泌 されたサイトカイン(マクロファージ 炎 症 性 タンパク 質 など)の 量 が 異 なることが 報 告 されている[39] また C.albicans 細 胞 壁 の GPI アンカー 合 成 に 関 わる GWT1 タンパク 質 の 活 性 を 阻 害 することによって TNF-α 分 泌 量 が 増 加 したことも 報 告 されている[40] これらの 文 献 情 報 から mcd4δ の 結 果 と 同 様 に 細 胞 表 面 の 構 造 が 活 性 化 に 関 与 していると 強 く 示 唆 される また S. cerevisiae の SSD1 遺 伝 子 破 壊 株 でも TNF-α などのサイトカイン 分 泌 量 が 野 生 株 よりも 増 加 することが 報 告 されている[41] 以 上 のことから パン 酵 母 S. cerevisiae の 細 胞 表 面 を 改 変 することで 細 胞 自 身 の 免 疫 賦 活 能 を 高 めることができると 考 えられた mcd4δ と 同 様 に 細 胞 表 面 のマンナンタンパク 質 が 減 少 し β-グルカンを 露 出 した 酵 母 はマク ロファージなどの 免 疫 細 胞 を 活 性 化 する 能 力 がより 高 くなると 考 えられる( 図 1.5) 8

15 図 1.5 細 胞 壁 変 異 株 によるマクロファージ 活 性 化 A: 野 生 株 B 細 胞 壁 変 異 株 細 胞 表 面 のマンナンタンパク 質 が 減 少 し β-グルカンが 露 出 した 酵 母 は 接 触 によりマクロファージを 強 く 活 性 化 し 高 濃 度 のサイトカインを 分 泌 すると 考 えられ る 1.5 本 研 究 の 目 的 本 研 究 では 酵 母 細 胞 自 身 に β-グルカンと 同 様 の 免 疫 賦 活 能 を 賦 与 するために 実 用 パン 酵 母 を 変 異 処 理 により 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 酵 母 の 取 得 を 目 指 し た さらに 取 得 変 異 株 の 遺 伝 子 解 析 や 細 胞 表 層 構 造 の 解 析 を 進 め 活 性 化 機 構 につい て 詳 細 に 解 析 した 第 2 章 では 先 行 研 究 で 取 得 された 実 験 室 酵 母 の MCD4 遺 伝 子 破 壊 株 (mcd4δ)の in vivo での 免 疫 賦 活 能 についてマウスを 用 いて 評 価 した 9

16 第 3 章 では 一 倍 体 実 用 パン 酵 母 を 用 いて 変 異 処 理 を 行 った 取 得 変 異 株 の 中 からマ クロファージ 活 性 化 能 が 高 く 増 殖 能 が 低 下 しない 酵 母 を 選 抜 した 第 4 章 では 取 得 酵 母 の 中 から AQ-37 株 について ゲノムライブラリーを 用 いて 変 異 遺 伝 子 を 同 定 した さらに その 塩 基 配 列 解 析 により 変 異 部 位 を 明 らかにした 第 5 章 では 実 用 化 に 向 け 取 得 一 倍 体 株 をもとに 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 二 倍 体 実 用 パン 酵 母 を 構 築 した さらに その 細 胞 壁 構 造 を 解 析 した 最 後 に 以 上 の 内 容 を 第 6 章 で 総 括 した なお ここでは 遺 伝 的 な 解 析 に 必 要 な 各 種 栄 養 要 求 性 マーカーを 持 ち 多 くの 研 究 者 が 基 礎 研 究 に 使 用 している 酵 母 を 実 験 室 酵 母 と 表 記 した 第 3 章 以 降 では 実 際 にパン 酵 母 として 使 用 されるあるいはその 親 株 となった 株 を 実 用 パン 酵 母 と 表 記 した 10

17 参 考 文 献 1. 大 隅 良 典, 下 田 親 (2007) 酵 母 のすべて 系 統 細 胞 から 分 子 まで. シュプリンガ ー ジャパン. 2. Goffeau A, Barrell BG, Bussey H, Davis RW, Dujon B, Feldmann H, Galibert F, Hoheisel JD, Jacq C, Johnston M et al. (1996) Life with 6000 genes. Science 274: 546, Klis FM, Boorsma A, De Groot PW (2006) Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 23: Lesage G, Bussey H (2006) Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 70: Manners DJ, Masson AJ, Patterson JC (1973) The structure of a β- (1 3)-D-glucan from yeast cell walls. Biochem J 135: Shahinian S, Bussey H (2000) β-1,6-glucan synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol 35: Tomishima M, Ohki H, Yamada A, Takasugi H, Maki K, Tawara S, Tanaka H (1999) FK463, a novel water-soluble echinocandin lipopeptide: synthesis and antifungal activity. J Antibiot (Tokyo) 52: 山 口 英 世, 西 山 彌 生, 内 田 勝 久, 波 多 野 和 男, 森 下 佳 彦, 中 井 徹, 池 田 文 昭, 武 藤 誠 太 郎 (2002) Micafungin の Candida albicans および Aspergillus fumigatus に 対 する 作 用 機 序 の 生 化 学 的 および 形 態 学 的 研 究 日 本 化 学 療 法 学 会 雑 誌 50: Tomishige N, Noda Y, Adachi H, Shimoi H, Takatsuki A, Yoda K (2003) Mutations that are synthetically lethal with a gas1δ allele cause defects in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. Mol Genet Genomics 269: Pittet M, Conzelmann A (2007) Biosynthesis and function of GPI proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1771: 地 神 芳 文 (2008) GPI アンカー 型 タンパク 質 の 生 合 成 経 路 抗 真 菌 剤 および 制 ガン 剤 の 潜 在 的 作 用 標 的 部 位 Jpn J Med Mycol 49:

18 12. Kondo A, Ueda M (2004) Yeast cell-surface display--applications of molecular display. Appl Microbiol Biotechnol 64: Pillemer L, Ecker EE (1941) Anticomplementry factor in fresh yeast. J Biol Chem 137: Riggi SJ, Di Luzio NR (1961) Identification of a reticuloendothelial stimulating agent in zymosan. Am J Physiol 200: 平 澤 康 史, 川 崎 由 紀 子, 豊 吉 亨, 久 木 浩 平, 渡 辺 洋, 岡 治, 鈴 木 康 生, 藤 田 剛 (2005) パン 酵 母 由 来 β-1,3-/1,6-グルカンのアレルギー 反 応 に 対 する 作 用. 応 用 薬 理 69 : Shawn M. Talbott, Julie A. Talbott, Tracy L. Talbott, Elaine Dingler (2013) β-glucan supplementation, allergy symptoms, and quality of life in self-described ragweed allergy sufferers Food Sci Nutr 1: Medeiros SD, Cordeiro SL, Cavalcanti JE, Melchuna KM, Lima AM, Filho IA, Medeiros AC, Rocha KB, Oliveira EM, Faria ED, Sassaki GL, Rocha HA, Sales VS (2012) Effects of Purified Saccharomyces cerevisiae (1 3)-β-glucan on Venous Ulcer Healing. Int J Mol 13: 福 田 伊 津 子, 小 土 井 理 恵, 久 保 麻 友 子, 藤 嶽 暢 英, 藤 田 剛, 芦 田 均 (2009) パン 酵 母 β-グルカン 摂 取 によるラットの 盲 腸 内 容 物 および 糞 便 排 泄 に 及 ぼす 影 響. 生 物 工 学 会 誌 87: Nicolosi R, Bell SJ, Bistrian BR, Greenberg I, Forse RA, Blackburn GL (1999) Plasma lipid changes after supplementation with β-glucan fiber from yeast. Am J Clin Nutr. 70: 福 田 伊 津 子, 小 土 井 理 恵, 久 保 麻 友 子, 岡 本 隆 志, 藤 田 剛, 芦 田 均 (2009) パン 酵 母 β-グルカンのラットにおける 脂 質 異 常 症 予 防 効 果. 生 物 工 学 会 誌 87: Tsoni SV, Brown GD (2008) β-glucans and dectin-1. Ann NY Acad Sci 1143: Chan GC, Chan WK, Sze DM (2009) The effects of β--glucan on human immune and cancer cells. J Hematol Oncol. 2: Young SH, Ye J, Frazer DG, Shi X, Castranova V (2001) Molecular mechanism of tumor 12

19 necrosis factor-α production in 1 3-β-glucan (zymosan)-activated macrophages. J Biol Chem 276: Kankkunen P, Teirila L, Rintahaka J, Alenius H, Wolff H, Matikainen S (2010) (1,3)- β-glucans activate both dectin-1 and NLRP3 inflammasome in human macrophages. J Immunol 184: Brown GD, Taylor PR, Reid DM, Willment JA, Williams DL, Martinez-Pomares L, Wong SY, Gordon S (2002) Dectin-1 is a major β-glucan receptor on macrophages. J Exp Med 196: Ikeda Y, Adachi Y, Ishii T, Miura N, Tamura H, Ohno N (2008) Dissociation of Toll-like receptor 2-mediated innate immune response to Zymosan by organic solvent-treatment without loss of Dectin-1 reactivity. Biol Pharm Bull 31: Taylor PR, Brown GD, Reid DM, Willment JA, Martinez-Pomares L, Gordon S, Wong SY (2002) The β-glucan receptor, dectin-1, is predominantly expressed on the surface of cells of the monocyte/macrophage and neutrophil lineages. J Immunol 169: Willment JA, Marshall AS, Reid DM, Williams DL, Wong SY, Gordon S, Brown GD (2005) The human β-glucan receptor is widely expressed and functionally equivalent to murine Dectin-1 on primary cells. Eur J Immunol 35: Adachi Y, Ishii T, Ikeda Y, Hoshino A, Tamura H, Aketagawa J, Tanaka S, Ohno N (2004) Characterization of β-glucan recognition site on C-type lectin, dectin-1. Infect Immun 72: Palma AS, Feizi T, Zhang Y, Stoll MS, Lawson AM, Díaz-Rodríguez E, Campanero-Rhodes MA, Costa J, Gordon S, Brown GD, Chai W (2006) Ligands for the β-glucan receptor, Dectin-1, assigned using designer microarrays of oligosaccharide probes (neoglycolipids) generated from glucan polysaccharides. J Biol Chem 281: Takahara K, Tokieda S, Nagaoka K, Inaba K (2012) Efficient capture of Candida albicans and zymosan by SIGNR1 augments TLR2-dependent TNF-α production. Int Immunol 24: 13

20 Saegusa S, Totsuka M, Kaminogawa S, Hosoi T (2004) Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae induce interleukin-8 production from intestinal epithelial-like Caco-2 cells in the presence of butyric acid. FEMS Immunol Med Microbial 41: 大 野 尚 仁 (2000) グルカンの 生 体 防 御 系 修 飾 作 用. 日 本 細 菌 学 雑 誌 55: Hamada N, Tsujisaka Y (1983) The structure of the carbohydrate moiety of an acidic polysaccharide produced by Aureobasidium sp. K-1. Agric Biol Chem 47: Kim YT, Kim EH, Cheong C, Williams DL, Kim CW, Lim ST (2000) Structural characterization of β-d-(1 3, 1 6)-linked glucans using NMR spectroscopy. Carbohydr Res 328: Maneesri J, Azuma M, Sakai Y, Igarashi K, Matsumoto T, Fukuda H, Kondo A, Ooshima H (2005) Deletion of MCD4 involved in glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor synthesis leads to an increase in β-1,6-glucan level and a decrease in GPI-anchored protein and mannan levels in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng 99: 酒 井 裕 美 子 (2005) 免 疫 賦 活 作 用 を 有 する β-グルカン 露 出 酵 母 の 開 発. 大 阪 市 立 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 修 士 論 文. 38. Brown GD, Herre J, Williams DL, Willment JA, Marshall AS, Gordon S (2003) Dectin-1 mediates the biological effects of β-glucans. J Exp Med 197: Torosantucci A, Chiani P, Cassone A (2000) Differential chemokine response of human monocytes to yeast and hyphal forms of Candida albicans and its relation to the β-1,6 glucan of the fungal cell wall. J Leukoc Biol 68: McLellan CA, Whitesell L, King OD, Lancaster AK, Mazitschek R, Lindquist S (2012) Inhibiting GPI anchor biosynthesis in fungi stresses the endoplasmic reticulum and enhances immunogenicity. ACS Chem Biol 7: Wheeler RT, Kupiec M, Magnelli P, Abeijon C, Fink GR (2003) A Saccharomyces cerevisiae mutant with increased virulence. Proc Natl Acad Sci USA 100:

21 第 2 章 実 験 室 酵 母 mcd4δ の in vivo での 免 疫 賦 活 能 2.1 はじめに 本 研 究 の 先 行 研 究 において 得 られた 知 見 を 以 下 にまとめる 細 胞 壁 蛋 白 質 の 固 定 に 関 わる GPI アンカーの 合 成 に 必 須 とされている MCD4 遺 伝 子 の 破 壊 株 (mcd4δ)が 取 得 された[1] MCD4 遺 伝 子 がコードするタンパク 質 は GPI アンカーコア 構 造 のうち グルコサミンに 結 合 する 1 番 目 のマンノースにエタノールア ミンホスフェートを 付 加 する 反 応 を 触 媒 する( 図 2.1) この 反 応 が 進 まなければ 3 番 目 のマンノースへの 付 加 反 応 が 起 こらず 結 果 として 不 完 全 な GPI アンカーとなり タ ンパク 質 が 付 加 されないと 考 えられている[2 3] この 株 では 細 胞 表 層 構 造 および 免 疫 賦 活 能 について 以 下 のように 解 析 された[4] 細 胞 表 面 のマンナンを 構 成 するマン ノース 量 が 野 生 型 の 36%にまで 減 少 し 逆 に β-グルカンを 構 成 するグルコース 量 は 2.6 倍 に 増 加 していた グルコース 量 当 たりのマンノース 量 を 計 算 すると およそ 14%にま で 減 少 し これらの 値 は 細 胞 表 層 の β-グルカンが 表 面 に 露 出 しやすい 状 況 にあることが 示 唆 された 次 に mcd4δ のマウスマクロファージ 活 性 化 能 が in vitro で 評 価 された 免 疫 担 当 細 胞 としてマウスマクロファージ RAW264.7 が 用 いられ 活 性 化 の 指 標 として 接 触 刺 激 により 分 泌 された TNF-α 量 が 測 定 された その 結 果 mcd4δ との 接 触 により 野 生 型 の 約 7 倍 量 の TNF-α が 分 泌 された さらに mcd4δ の 腹 腔 内 投 与 がマウスの 免 疫 力 に 与 える 影 響 についても 検 討 された 酵 母 の 投 与 により 病 原 真 菌 である C. albicans に 対 して 抵 抗 性 が 増 し その 抵 抗 性 は 野 生 株 よりも mcd4δ の 方 が 強 い 傾 向 が 観 察 され た しかし 統 計 的 な 有 意 差 を 得 るまでには 至 っていなかった そのため 第 2 章 では 実 用 パン 酵 母 での 検 討 を 行 う 前 に 先 行 研 究 で 得 られた 実 験 室 酵 母 mcd4δ が in vivo でマウスの 免 疫 力 に 与 える 影 響 について 詳 細 に 検 討 した 15

22 図 2.1 GPI アンカーのコア 構 造 と MCD4 タンパク 質 の 作 用 点 Man(マンノース) GlcN(グルコサミン) Asn(アスパラギン) EtN(エタノールアミン) Ins(イノシトール) P(リン 酸 ) DG(ジアシルグリセロール)を 示 す 2.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 実 験 室 酵 母 の 野 生 型 (WT)として S. cerevisiae BY4741(MATa met15 1 leu2 0 lys2 0 16

23 ura3 0)[ 5]を 用 いた また 先 行 研 究 で BY4741 株 をもとに 遺 伝 子 破 壊 された mcd4δ (BY4741, mcd4 :: kanmx4)[ 2]を 免 疫 賦 活 能 の 評 価 に 使 用 した 培 地 には YPD (1% 酵 母 エキス 2%ポリペプトン 2%グルコース)を 用 い 浸 透 圧 保 護 が 必 要 な 時 は 0.6 M のソルビトールを YPD に 添 加 した(YPDS) 固 体 培 地 には 2%の 寒 天 を 添 加 した 増 殖 の 測 定 mcd4δ を in vivo 試 験 に 供 する 前 にその 増 殖 能 を 調 べた 酵 母 の 初 期 濃 度 を OD 600 で 0.05 に 調 製 し 100 ml の YPDS を 含 む 500 ml の 坂 口 フラスコで 30 の 条 件 で 培 養 した 24 時 間 および 48 時 間 後 に 回 収 し 1 M ソルビトールで 2 度 洗 浄 後 凍 結 乾 燥 し た 乾 燥 菌 体 重 量 から 評 価 した マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 活 性 評 価 は 先 行 研 究 [2]を 参 考 に 次 のように 行 った 酵 母 は 4 ml の YPD 液 体 培 地 を 含 む 試 験 管 を 用 い 30 で 対 数 増 殖 期 (WT は 12 時 間 mcd4δ は 36 時 間 )まで 培 養 した 遠 心 分 離 により 回 収 し 1 M ソルビトール 溶 液 で 2 度 洗 浄 後 70%エタノール で 1 時 間 以 上 固 定 した その 溶 液 1 ml をサンプルチューブに 移 し 酵 母 を 遠 心 分 離 に より 回 収 し 滅 菌 水 で 洗 浄 した さらに マクロファージの 培 養 に 用 いる 10%のウシ 胎 仔 血 清 FBS と 100 U/mL ペニシリンおよび 100 μg/ml ストレプトマイシンを 含 む RPMI-1640 培 地 ( 和 光 純 薬 工 業 )で 洗 浄 し 同 培 地 で 再 懸 濁 し 細 胞 濃 度 を cells/ml に 調 製 した なお 細 胞 数 は 血 球 計 算 盤 でカウントした また マウスマクロファージ RAW264.7(ATCC TIB-71)は RPMI-1640 培 地 を 用 い CO 2 インキュベーター 内 で 培 養 し 培 養 後 の 細 胞 を 2 回 洗 浄 した 後 同 培 地 を 用 いて 細 胞 濃 度 を 血 球 計 算 盤 で cells/ml に 調 製 した その 細 胞 懸 濁 液 250 μl を 24 穴 プレートに 移 し そこに 等 量 の 酵 母 懸 濁 液 を 加 えた 最 終 細 胞 濃 度 を 酵 母 が cells/ml マクロファージが cells/ml とした マクロファージ 活 性 化 のコントロールとして Escherichia coli O55:B5 17

24 由 来 のリポポリサッカライド(LPS;シグマアルドリッチ)を 使 用 した 酵 母 とマクロ ファージを 混 合 後 37 で 5%の CO 2 条 件 下 で 6 時 間 インキュベートした 遠 心 分 離 に より 細 胞 を 除 去 し その 上 清 に 含 まれる TNF-α 濃 度 を Quantikine Mouse TNF-α ELISA kit (R&D システムズ)によって 測 定 した 測 定 方 法 はそのキットのマニュアルに 従 った 酵 母 のマウスへの 腹 腔 内 投 与 マウスは CD-1(ICR)の 雄 3 週 齢 を 使 用 し 実 験 は 先 行 研 究 を 参 考 に 次 のように 行 っ た[2] マウスに 投 与 する 酵 母 は 100 ml の YPDS を 含 む 坂 口 フラスコで 対 数 増 殖 期 まで 培 養 し 1 M ソルビトールで 2 度 洗 浄 後 10 ml の 70%エタノールで 1 時 間 以 上 固 定 した 0.5 ml を 凍 結 乾 燥 し 乾 燥 重 量 を 測 定 した 70%エタノールで 10 mg/ml に 調 製 し 保 存 した 使 用 前 にリン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (PBS)で 洗 浄 後 PBS に 懸 濁 しマウスの 腹 腔 内 へ 投 与 した 1 回 の 酵 母 投 与 量 を 0.25 mg 1 mg 4 mg とし コントロールは PBS 溶 液 のみを 同 じ 液 量 投 与 した 1サンプル 当 たりの 試 験 マウスの 数 を6または7 匹 とした 1 日 に 1 回 で 10 日 間 投 与 し 11 日 目 に PBS に 懸 濁 した 病 原 真 菌 C. albicans TUA6 株 ( 10 6 CFU)[ 6] を 静 脈 注 射 した その 後 マウスの 生 存 をカプランマイヤー 法 で 表 し 生 存 日 数 を 比 較 した さらに 統 計 解 析 はログランクテストを 用 いて 行 い 有 意 水 準 5%の 条 件 で 差 を 比 較 した 2.3 結 果 と 考 察 mcd4δ の 増 殖 能 の 評 価 先 行 研 究 で 取 得 された mcd4δ は 細 胞 壁 に 欠 損 を 持 ち 物 理 的 に 弱 い 細 胞 であるため 免 疫 試 験 に 供 する 前 にその 乾 燥 菌 体 重 量 から 増 殖 能 の 確 認 を 行 った( 図 2.1) その 結 果 mcd4δ は 24 時 間 では WT の 約 半 分 の 菌 体 量 を 示 し 48 時 間 後 には WT とほぼ 同 等 だっ た WT は 24 時 間 でも 48 時 間 でもほぼ 同 等 だった 従 って 以 前 に 増 殖 曲 線 で 検 討 し た 通 り[4] mcd4δ では 培 養 36 時 間 程 度 が 対 数 増 殖 期 に WT では 培 養 12 時 間 程 度 が 18

25 対 数 増 殖 期 に 相 当 すると 考 え 以 降 の 試 験 ではこれらを 各 酵 母 の 培 養 時 間 とした 図 2.2 mcd4 の 増 殖 能 24 時 間 および 48 時 間 培 養 後 菌 体 を 回 収 し 凍 結 乾 燥 後 の 乾 燥 重 量 を 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す mcd4δ のマクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 in vivo での 試 験 を 行 う 前 に mcd4δ の in vitro でのマクロファージ 活 性 化 能 を TNF-α 分 泌 量 を 指 標 として 再 評 価 した 結 果 を 図 2.3 に 示 す WT に 比 べ mcd4δの 活 性 化 能 は 高 く 培 地 のバックグラウンドを 差 し 引 いた 値 で 評 価 すると WT の 約 6 倍 の 活 性 化 能 を 示 した これは 以 前 の 先 行 研 究 での 結 果 とほぼ 同 等 であった[4] そのため in vivo での 評 価 に 使 用 できる 状 態 にあると 判 断 し in vivo の 実 験 を 進 めた 19

26 図 2.3 mcd4δ のマクロファージ 活 性 化 能 酵 母 とマクロファージを 6 時 間 接 触 させ 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した 最 終 濃 度 で 酵 母 ( cells/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 接 触 させた LPS(100 ng/ml) と 培 地 (RPMI-1640)はコントロールとして 使 用 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す in vivo での mcd4δ の 免 疫 賦 活 能 マウス 腹 腔 内 への 1 回 の 投 与 量 を 0.25 mg 1 mg 4 mg に 設 定 し 評 価 を 行 った その 結 果 を 図 2.4 に 示 す PBS のみの 投 与 では 9 日 目 にマウスの 半 分 11 日 目 に 全 てが 致 死 に 至 った 次 に 酵 母 の 投 与 による 効 果 を 調 べた WT の 0.25 mg 投 与 では 半 分 致 死 が 9 日 目 で 全 て 致 死 が 17 日 目 mcd4δ の 0.25 mg 投 与 では 半 分 が 11 日 目 で 全 てが 17 日 目 WT の 1 mg 投 与 では 半 分 が 11 日 目 で 全 てが 17 日 目 mcd4δ の 1 mg 投 与 では 半 分 が 17 日 目 で 全 てが 31 日 目 WT の 4 mg 投 与 では 半 分 が 11 日 目 で 全 てが 28 日 20

27 目 mcd4δ の 4 mg 投 与 では 半 分 が 17 日 目 で 全 てが 26 日 目 だった いずれの 条 件 で も PBS のみよりも 生 存 日 数 が 長 くなった WT では 投 与 量 が 0.25 mg 投 与 より 1 mg 1 mg より 4 mg の 方 で 生 存 日 数 が 長 くなった また mcd4δ でも 0.25 mg 投 与 より 1 mg や 4 mg の 方 で 生 存 日 数 が 長 くなり 酵 母 の 投 与 量 が 多 いほどその 生 存 日 数 が 長 くなる 傾 向 も 見 られた WT と mcd4δ の 比 較 では いずれの 投 与 量 でも mcd4δの 方 が 生 存 日 数 が 長 くなる 傾 向 が 見 られた ログランクテストを 用 いた 統 計 解 析 (p < 0.05)では mcd4δ の 4 mg 投 与 のみ PBS と 有 意 差 が 見 られ WT ではそれに 相 当 する 差 は 見 られなかった 従 って mcd4δ の 投 与 によってマウスの 免 疫 力 が 賦 活 化 したことが 示 唆 された 図 2.4 酵 母 を 投 与 したマウスの 生 存 率 の 評 価 マウス 6 または 7 匹 に 酵 母 を 10 日 間 腹 腔 内 投 与 し その 後 C. albicans を 静 脈 から 感 染 させ 生 存 日 数 を 計 測 した 各 シンボルは mcd4δ 4 mg( ) mcd4δ 1 mg( ) mcd4δ 0.25 mg( ) WT 4 mg( ) WT 1 mg( ) WT 0.25 mg( ) PBS( )を 示 す 21

28 2.4 まとめ 第 2 章 では 実 験 室 酵 母 mcd4δ の in vitro および in vivo での 免 疫 賦 活 能 について 評 価 した in vitro の 試 験 では mcd4δ は 以 前 と 同 様 に 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 示 し た また in vivo での 免 疫 賦 活 能 の 評 価 を 行 うために ここでは 病 原 真 菌 C. albicans への 抵 抗 性 を 指 標 とした 具 体 的 には 病 原 真 菌 の 感 染 前 に 酵 母 を 投 与 し 感 染 後 の 生 存 日 数 から 免 疫 賦 活 能 を 評 価 した その 結 果 in vitro で 見 られた 極 端 な WT と mcd4δ との 違 いは 見 られなかったが mcd4δの 方 がより 免 疫 力 を 高 める 傾 向 が 観 察 された 従 って これまで 指 標 として 用 いてきた in vitro での 評 価 系 に 問 題 はないと 判 断 し 第 3 章 以 降 も 同 様 の 評 価 系 でスクリーニングを 進 めた 22

29 参 考 文 献 1. Maneesri J, Azuma M, Sakai Y, Igarashi K, Matsumoto T, Fukuda H, Kondo A, Ooshima H (2005) Deletion of MCD4 involved in glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor synthesis leads to an increase in β-1,6-glucan level and a decrease in GPI-anchored protein and mannan levels in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng 99: Hong Y, Maeda Y, Watanabe R, Ohishi K, Mishkind M, Riezman H, Kinoshita T (1999) Pig-n, a mammalian homologue of the yeast Mcd4p, is involved in transferring phosphoethanolamine to the first mannose of the glycosylphosphatidylinositol. J Biol Chem 274: Richard M, De Groot P, Countin O, Poulain D, Klis F, Gaillardin C (2002) GPI7 affects call-wall protein anchorage in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Microbiology 148: 酒 井 裕 美 子 (2005) 免 疫 賦 活 作 用 を 有 する β-グルカン 露 出 酵 母 の 開 発. 大 阪 市 立 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 修 士 論 文. 5. Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li J, Hieter P, Boeke JD (1998) Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast 14: Hanaoka N, Umeyama T, Ueno K, Ueda K, Beppu T, Fugo H, Uehara Y, Niimi M (2005) A putative dual-specific protein phosphatase encoded by YVH1 controls growth, filamentation and virulence in Candida albicans. Microbiology 151:

30 第 3 章 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 取 得 とその 性 状 解 析 3.1 はじめに 第 2 章 では 先 行 研 究 で 取 得 されていた 実 験 室 酵 母 の 変 異 株 mcd4δ について in vitro でのマクロファージ 活 性 化 能 と in vivo での 免 疫 賦 活 能 について 評 価 した 両 実 験 にお いて mcd4δ は WT に 比 べて 高 い 効 果 を 示 した MCD4 遺 伝 子 の 欠 損 により 細 胞 壁 のマ ンナンタンパク 質 が 極 端 に 減 少 し[1] 結 果 として 細 胞 表 面 に β-グルカンが 露 出 し そ れにより 高 い 免 疫 賦 活 能 が 付 与 されたことが 示 唆 された パン 酵 母 に 新 たな 機 能 を 付 与 できることが 示 唆 され その 応 用 が 期 待 された しかし mcd4δ は 抗 生 物 質 耐 性 遺 伝 子 を 用 いた 遺 伝 子 組 換 え 株 で 生 育 にはソルビトールの 添 加 など 浸 透 圧 保 護 を 必 要 とし 添 加 してもその 増 殖 能 が 低 かった これらは 実 用 上 の 大 きな 問 題 となる そこで 第 3 章 では 企 業 よりパン 酵 母 の 実 用 株 を 入 手 し それを 遺 伝 子 組 換 えではな くエタンスルホン 酸 メチル(EMS)で 変 異 処 理 することで mcd4δ と 同 様 に 高 いマクロ ファージ 活 性 化 能 を 持 ち mcd4δ ほど 増 殖 能 が 極 端 に 低 下 しない 株 の 取 得 を 試 みた 変 異 処 理 操 作 は 2 回 行 い 有 望 株 として 1 回 目 に 2 株 (AP-57 と AQ-37) 2 回 目 に 1 株 (BD-40)を 取 得 した さらに これら 取 得 株 の 各 種 性 状 についても 解 析 した 3.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 オリエンタル 酵 母 工 業 ( 株 )から 提 供 されたパン 酵 母 S. cerevisiae y-21(mata ura3δ0) を 使 用 しこれを 親 株 とした また 第 2 章 で 用 いた 実 験 室 酵 母 変 異 株 mcd4δ(mata met15δ1 leu2δ0 lys2δ0 ura3δ0)を 比 較 に 使 用 した 酵 母 の 培 養 には YPD と YPDS を 培 地 に 用 い 固 体 培 地 には 2%の 寒 天 を 添 加 した 実 験 には 30 で 対 数 増 殖 期 (12 時 間 mcd4δ は YPDS で 36 時 間 )まで 培 養 した 酵 母 を 用 いた 細 胞 壁 の 変 異 により SDS に 対 24

31 する 感 受 性 が 高 まる 傾 向 が 知 られていた[1 4] そのため 細 胞 壁 変 異 株 の 選 抜 には 0.02%の SDS を 含 む 1/5YPD 培 地 (YPD の 培 地 成 分 の 1/5 量 )を 用 いた 細 胞 壁 変 異 株 の 選 抜 y-21 株 を 用 い 次 のように 変 異 処 理 した[5] 4 ml の YPD 液 体 培 地 を 含 む 試 験 管 を 用 い 30 で 一 晩 培 養 し 菌 体 を 遠 心 分 離 により 回 収 し PBS(0.8% 塩 化 ナトリウム 0.02% 塩 化 カリウム 0.29%リン 酸 水 素 二 ナトリウム 十 二 水 和 物 0.02%リン 酸 二 水 素 カリ ウム;pH 7.4)で 2 度 洗 浄 した 0.1 M リン 酸 緩 衝 液 (ph 7.0)に 懸 濁 した EMS を 酵 母 の 生 存 率 が 10% 程 度 になる 条 件 で 添 加 し 30 で 1 時 間 ゆっくり 振 とうした 細 胞 は 遠 心 分 離 により 回 収 し 5%のチオ 硫 酸 ナトリウム 溶 液 で 2 度 洗 浄 し 滅 菌 水 に 懸 濁 後 YPDS 寒 天 培 地 に 塗 布 した 生 じたコロニーを 滅 菌 した 爪 楊 枝 で YPD 固 体 培 地 に 移 し 培 養 し そこで 生 育 した 株 について 1/5YPD 固 体 培 地 と 0.02%の SDS を 含 む 1/5YPD 固 体 培 地 上 での 生 育 を 調 べた 浸 透 圧 が 低 い 条 件 で 親 株 より 生 育 が 悪 くなるもしくは SDS に 感 受 性 となる 株 を 選 抜 し これらを 細 胞 壁 変 異 株 とした 次 に 細 胞 壁 マンナン 量 を 蛍 光 染 色 により 評 価 した[6] マンナンに 特 異 的 に 結 合 する 蛍 光 試 薬 フルオレセインイソチオシアネート 標 識 コンカナバリン A(ConA-FITC; シグ マアルドリッチ)を 使 用 して 染 色 した 細 胞 を YPD 固 体 培 地 で 2 日 間 培 養 し 爪 楊 枝 でかきとり PBS に 懸 濁 した ConA-FITC を 0.1 mg/ml になるように 添 加 し 室 温 で 30 分 間 静 置 した さらに PBS で 洗 浄 し 蛍 光 顕 微 鏡 を 用 いて 観 察 した 同 じ 露 出 時 間 で 写 真 を 撮 影 し 比 較 した 親 株 y-21 と 比 較 して FITC の 蛍 光 が 弱 い 変 異 株 を 選 抜 した マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 マクロファージ 活 性 化 能 は 一 定 細 胞 数 または 一 定 乾 燥 細 胞 重 量 の 酵 母 とマクロファ ージを 接 触 させたときにマクロファージから 分 泌 される TNF-α 量 で 評 価 した 一 定 細 胞 数 での 接 触 では 3 ml の YPD 液 体 培 地 を 含 む 試 験 管 で 対 数 増 殖 期 まで 培 養 した 酵 母 を 使 用 し 第 2 章 に 記 載 したように TNF-α 量 を 活 性 化 の 指 標 として 測 定 した 一 定 重 25

32 量 の 条 件 では 次 のように 測 定 した 50 ml の YPD 液 体 培 地 で 対 数 増 殖 期 まで 培 養 し た 酵 母 を 遠 心 分 離 で 回 収 し PBS で 洗 浄 した 後 70%エタノールで 1 時 間 以 上 固 定 した その 後 凍 結 乾 燥 し 乾 燥 重 量 を 測 定 した RPMI-1640 培 地 に 100 μg/ml もしくは 600 μg/ml になるように 乾 燥 酵 母 を 懸 濁 し マクロファージ( cells/ml)と 1:1 で 混 合 した 酵 母 の 最 終 濃 度 は 50 μg/ml もしくは 300 μg/ml マクロファージは cells/ml で 行 った 6 時 間 接 触 させた 後 ELISA により TNF-α 量 を 測 定 した 増 殖 と CO 2 発 生 量 の 測 定 増 殖 能 は 次 のように 評 価 した OD 600 が 0.05 になるように 3 ml の YPD あるいは YPDS 液 体 培 地 に 酵 母 を 植 菌 し 30 で 試 験 管 培 養 を 行 い OD 600 の 値 の 経 時 変 化 から 評 価 した また 第 2 章 と 同 様 に 100 ml の YPD 培 地 で 培 養 し 培 養 後 の 菌 体 の 乾 燥 重 量 から 評 価 した 発 酵 能 は 酵 母 から 発 生 した CO 2 量 から 評 価 した 細 胞 を OD 600 が 0.1になるように YPD 液 体 培 地 を 用 い 調 製 した 酵 母 懸 濁 液 20 ml を 含 むシャーレを CO 2 センサー(CO 2 recorder MCH-383-SD;Lutron Electronic Enterprise)を 搭 載 した 5 L デシケーター( 密 閉 系 )の 中 で 30 6 時 間 静 置 した その 測 定 値 から 発 酵 能 を 評 価 した 細 胞 壁 解 析 酵 母 細 胞 壁 の 主 成 分 である β-グルカンを 構 成 するグルコースの 量 とマンナンを 構 成 するマンノース 量 は 次 のように 測 定 した [7] 50 ml の YPD 液 体 培 地 で 対 数 増 殖 期 ま で 培 養 した 酵 母 を 遠 心 分 離 で 回 収 し PBS で 2 度 洗 浄 した 細 胞 は 10 mm トリス 塩 酸 緩 衝 液 (ph 8.0)に 懸 濁 し 適 宜 氷 上 で 冷 やしながら ガラスビーズを 用 いて 破 砕 し 3,800 g で 5 分 の 遠 心 で 細 胞 壁 画 分 を 回 収 し 凍 結 乾 燥 した 細 胞 壁 1 mg に 18.5 M 硫 酸 を 75 μl 加 え 3 時 間 室 温 で 静 置 した 懸 濁 液 を 蒸 留 水 で 1 ml に 希 釈 し 100 で 4 時 間 加 熱 した 氷 冷 し 飽 和 水 酸 化 バリウムで 中 和 した 上 清 を 遠 心 分 離 により 回 収 し 4 で 一 晩 静 置 した さらに 沈 澱 を 遠 心 分 離 で 除 去 し 上 清 を 凍 結 乾 燥 した 水 に 溶 解 26

33 し グ ル コ ー ス と マ ン ノ ー ス の 量 を HPLC で 測 定 し た カ ラ ム は Rezex RPM-Monosaccharide(300 7 mm;フェノメネクス) 検 出 器 は RID-6A detector( 島 津 製 作 所 )を 使 用 した 溶 出 には 超 純 水 を 用 い 流 速 は 1.0 ml/min カラム 温 度 は 78 で 行 った 細 胞 壁 キチンは キチンに 結 合 する 蛍 光 試 薬 カルコフロールホワイト M2R(CFW; シグマアルドリッチ)を 使 用 して 染 色 した[6] 3 ml の YPD 培 地 で 対 数 増 殖 期 まで 培 養 した 酵 母 を PBS で OD 600 が 1.0 になるように 調 製 し 染 色 に 使 用 した CFW は 0.1 mg/ml になるように 添 加 し 室 温 で 10 分 間 静 置 した PBS で 2 度 洗 浄 し 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 した 同 じ 露 出 時 間 で 写 真 を 撮 影 し キチン 量 を 評 価 した 3.3 結 果 と 考 察 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 選 抜 変 異 処 理 操 作 は 2 回 行 った まず 1 回 目 のスクリーニング 結 果 を 以 下 に 記 す 目 的 とする 変 異 株 を 得 るために y-21 株 を EMS で 処 理 し 以 下 の 選 抜 を 行 った 変 異 処 理 後 に YPDS 固 体 培 地 上 で 生 育 したコロニー3120 個 からスクリーニングを 行 った mcd4δ とは 異 なり 浸 透 圧 保 護 を 必 要 とせず YPD で 生 育 できる 株 を 得 た ここで 細 胞 壁 変 異 株 は 低 浸 透 圧 や SDS に 対 して 感 受 性 が 高 まる 傾 向 が 見 られる[1 4] そのため 低 浸 透 圧 下 や SDS を 含 む 条 件 下 で 生 育 が 遅 れる 株 を 選 抜 した 1/5YPD 培 地 と 0.02%の SDS を 含 む 1/5YPD 培 地 上 での 生 育 を 目 視 で 比 較 し 親 株 y-21 と 比 較 して 生 育 が 遅 い 197 の 変 異 株 を 取 得 した 次 に 細 胞 壁 のマンナン 量 を 評 価 するため マンナンに 特 異 的 に 結 合 する 蛍 光 試 薬 ConA-FITC でマンナン 染 色 を 行 った( 図 3.1) その 結 果 mcd4δ と 同 様 に y-21 株 と 比 較 して 弱 い 蛍 光 つまりマンナンの 減 少 を 示 す 株 を 4 種 取 得 した(I-24 AC-12 AP-57 AQ-37) 目 視 による 観 察 では 判 断 が 難 しかったため 少 なくとも 3 回 染 色 を 行 い マ ンナンの 減 少 に 関 して 再 現 性 が 得 られた 株 のみを 選 抜 した 27

34 図 3.1 ConA-FITC によるマンナンの 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した 次 に 得 られた 4 種 の 変 異 株 について 酵 母 細 胞 の 接 触 によるマクロファージ 活 性 化 を TNF-α 分 泌 量 を 指 標 として 調 べた( 図 3.2 A) 酵 母 の 細 胞 数 を 一 定 にして 分 泌 量 を 評 価 した 結 果 親 株 に 用 いた y-21 株 自 身 でも TNF-α の 分 泌 を 促 進 させる 活 性 化 能 を 有 していた 変 異 株 については TNF-α 分 泌 量 が I-24 株 と AC-12 株 では y-21 株 とほぼ 同 じだった 一 方 AP-57 株 と AQ-37 株 ではその 分 泌 量 は y-21 株 に 比 べ 顕 著 に 高 く 培 地 の 値 を 引 いて 活 性 化 能 を 評 価 すると 2 倍 以 上 高 かった また AQ-37 株 の 分 泌 量 は 実 験 室 酵 母 の 変 異 株 mcd4δ よりも 高 かった 上 記 では 細 胞 数 で 評 価 したが AQ-37 株 は 細 胞 が 大 きく 偽 菌 糸 状 の 形 態 を 示 していた 上 記 の 条 件 では 細 胞 の 大 きさも 影 響 すると 考 えられた また 偽 菌 糸 状 の 形 態 を 取 ると 細 胞 数 がカウントしにくく 誤 差 が 生 じやすいと 考 えられた そのため 酵 母 の 乾 燥 重 量 を 一 定 にした 接 触 により 活 性 化 能 を 評 価 した その 結 果 を 図 3.2 B に 示 す AP-57 株 と AQ-37 株 は y-21 株 よりも 高 い TNF-α 量 を 示 したが AQ-37 株 は mcd4δ よりもその 分 泌 量 は 低 かった 一 定 細 胞 数 及 び 一 定 乾 燥 重 量 との 接 触 によるマクロファージ 活 性 化 能 の 結 果 を 総 合 して AP-57 株 と AQ-37 株 は 高 いマウスマクロファージ 活 性 化 能 を 有 すると 判 断 した 28

35 図 3.2 マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 (スクリーニング 1 回 目 ) 酵 母 とマクロファージを 6 時 間 接 触 させ 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A: 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 ( cells/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 接 触 させた LPS(100 ng/ml)と 培 地 (RPMI-1640)はコントロールとして 使 用 した B: 一 定 乾 燥 重 量 の 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 (50 μg/ml)とマクロフ ァージ( cells/ml)を 接 触 させた LPS(50 ng/ml)と 培 地 (RPMI-1640)はコントロー ルとして 使 用 した 29

36 さらに 多 くの 候 補 株 を 得 るために 上 記 と 同 様 のスクリーニングをもう 一 度 行 った その 結 果 を 以 下 にまとめる y-21 株 を EMS で 処 理 した 後 YPDS 固 体 培 地 上 で 培 養 した 生 育 したコロニー500 個 を YPD 培 地 に 移 し y-21 株 と 同 等 に 生 育 した 株 を 選 抜 した これらについて さら に 1/5YPD 培 地 と 0.02%の SDS を 含 む 1/5YPD 培 地 上 での 生 育 を 調 べた 結 果 として 40 個 の 細 胞 壁 変 異 株 を 選 抜 した 次 に マンナン 量 が 減 少 した 株 を 選 抜 するため ConA-FITC を 用 いマンナン 染 色 を 行 った 前 回 と 同 様 に 再 現 性 を 確 認 するために 3 度 染 色 実 験 を 行 った 結 果 AP-57 株 や AQ-37 株 と 同 様 に 弱 い 蛍 光 を 示 す 1 株 (BD-40)を 選 抜 した( 図 3.3) 図 3.3 ConA-FITC によるマンナンの 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した 30

37 さらに 得 られた BD-40 株 について TNF-α 量 を 活 性 化 の 指 標 として 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 によるマクロファージ 活 性 化 能 を 調 べた( 図 3.4 A) BD-40 株 では 図 3.2 の AP-57 株 や AQ-37 株 の 結 果 と 同 様 に y-21 株 より 分 泌 量 が 高 く 培 地 の 値 を 引 いて 活 性 化 能 を 評 価 すると 2 倍 以 上 高 かった BD-40 株 も AQ-37 株 と 同 様 に 細 胞 が 大 きく 偽 菌 糸 状 の 形 態 を 示 したので 一 定 乾 燥 重 量 の 酵 母 との 接 触 による 活 性 化 能 も 測 定 した ( 図 3.4 B) その 結 果 BD-40 株 は y-21 株 よりも 高 い TNF-α 量 を 示 し 高 いマクロフ ァージ 活 性 化 能 を 有 すると 判 断 した 以 上 の 結 果 から y-21 株 を 変 異 処 理 することにより 有 望 株 として 3 株 ( AP-57 AQ-37 BD-40)が 取 得 された これらの 菌 株 の 性 状 を 以 降 で 検 討 した 31

38 図 3.4 マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 (スクリーニング 2 回 目 ) 酵 母 とマクロファージを 6 時 間 接 触 させ 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した LPS (50 ng/ml)と 培 地 (RPMI-1640)はコントロールとして 使 用 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A: 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 ( cells/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 接 触 させた B: 一 定 乾 燥 重 量 の 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 (300 μg/ml)とマクロ ファージ( cells/ml)を 接 触 させた 32

39 3.3.2 増 殖 能 と 発 酵 能 の 評 価 細 胞 壁 変 異 株 の 中 には 極 端 に 増 殖 能 が 低 下 する 株 があるため[1 8 9] 選 抜 株 の 液 体 培 地 での 増 殖 能 を 評 価 した 濁 度 による 測 定 では BD-40 株 の 増 殖 速 度 は y-21 株 よ り 遅 く AP-57 株 は BD-40 株 より 遅 いが 48 時 間 後 の AP-57 株 と BD-40 株 の 濁 度 は y-21 株 とほぼ 同 等 だった( 図 3.5 A) AQ-37 株 の 増 殖 速 度 は BD-40 株 よりも 遅 く 48 時 間 後 の 濁 度 は AP-57 株 と BD-40 株 より 低 かった 図 3.5 B に 示 す 浸 透 圧 保 護 下 (YPDS 培 地 )での 培 養 でもほぼ 同 様 の 傾 向 が 見 られた( 図 3.5 B) AP-57 株 と AQ-37 株 と BD-40 株 はともに 浸 透 圧 保 護 剤 の 有 無 に 関 わらず 増 殖 したが y-21 株 よりも 増 殖 速 度 は 遅 かっ た しかし 先 行 研 究 で 取 得 した mcd4δ よりも 明 らかに 増 殖 能 は 高 かった AQ-37 株 の 増 殖 速 度 が y-21 株 に 比 べ 遅 かったため 坂 口 フラスコ(100 ml YPD 培 地 ) で 培 養 を 行 い 得 られた 菌 体 重 量 でその 増 殖 能 を 評 価 した( 図 3.6) AQ-37 株 の 24 時 間 培 養 後 の 乾 燥 重 量 は y-21 株 の 90% 程 度 だった 従 って 試 験 管 培 養 で 濁 度 を 用 いて 評 価 した 時 ほど 増 殖 能 の 低 下 は 見 られなかった 実 験 結 果 の 違 いが 出 たのは 培 養 方 法 が 異 な るためかもしれない 実 用 上 はスケールアップし 培 養 するため 100 ml 培 養 の 方 が 実 際 に 近 いと 考 えられ る ここでは AQ-37 株 の 増 殖 能 は 実 用 上 それほど 問 題 ではないと 判 断 した 33

40 図 3.5 増 殖 能 の 評 価 ( 濁 度 による 測 定 ) A:YPD 培 地 における 各 菌 株 の 増 殖 曲 線 B:YPDS 培 地 における 各 菌 株 の 増 殖 曲 線 各 シン ボルは y-21( ) AP-57( ) AQ-37( ) BD-40( ) mcd4δ( )を 示 す 結 果 は 異 な る 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 34

41 図 3.6 増 殖 能 の 評 価 ( 菌 体 重 量 ) 24 時 間 培 養 後 の 菌 体 を 回 収 し 凍 結 乾 燥 後 の 乾 燥 重 量 を 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーはその 標 準 偏 差 を 示 す 次 に 取 得 変 異 株 の 発 酵 能 を CO 2 発 生 量 から 調 べた 図 3.7 に 示 す 結 果 から AQ-37 株 は y-21 株 と 同 等 の CO 2 発 生 量 を 示 し 同 程 度 の 発 酵 能 を 持 つことが 示 唆 された しか し AP-57 株 は y-21 株 よりも CO 2 発 生 量 が 低 く 発 酵 能 の 低 下 が 示 唆 された そのた め AP-57 株 は 発 酵 食 品 以 外 への 応 用 に 適 しているかもしれない また BD-40 株 は 反 対 に y-21 株 よりも CO 2 発 生 量 が 高 く 変 異 により 発 酵 能 が 上 昇 した 可 能 性 が 示 唆 され た 従 って 発 酵 食 品 への 応 用 には AQ-37 株 や BD-40 株 が 有 望 であると 考 えられる 35

42 図 3.7 CO 2 発 生 量 初 期 OD 600 を 0.1 とし YPD 培 地 中 で CO 2 発 生 量 を 測 定 した 各 シンボルは y-21( ) AP-57 ( ) AQ-37( ) BD-40( )を 示 す 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 細 胞 壁 解 析 変 異 株 をスクリーニングする 過 程 において 行 った ConA-FITC 染 色 では 細 胞 壁 マン ナンの 減 少 が 示 唆 された そのため ここでは 定 量 的 な 解 析 を 行 った 細 胞 壁 β-グルカ ンを 構 成 するグルコース 量 と 細 胞 壁 マンナンを 構 成 するマンノース 量 は HPLC を 用 い て 定 量 した マンナンは 細 胞 壁 最 外 層 に 位 置 し β-グルカンを 覆 っている それゆえ マ ンノース 量 に 対 するグルコース 量 の 比 は 細 胞 表 面 の β-グルカンの 露 出 の 程 度 を 表 すと 考 えられる 各 変 異 株 から 常 法 に 従 って 細 胞 壁 画 分 を 調 製 した 硫 酸 で 細 胞 壁 成 分 を 処 理 ( 加 水 分 解 )し 得 られたグルコースとマンノースの 量 を HPLC で 測 定 した 各 変 異 株 の 細 胞 壁 36

43 乾 燥 重 量 当 たりのグルコース 量 は y-21 株 と 大 きく 変 動 していなかったが 予 想 された 通 りマンノース 量 は 低 下 していた( 図 3.8) 取 得 した 変 異 株 (AP-57 AQ-37 BD-40) のいずれにおいても グルコース 量 に 対 するマンノース 量 の 比 は 減 少 していた 従 って β-グルカンの 表 面 への 露 出 度 が 増 加 したことが 示 唆 され これが 高 いマクロファージ 活 性 化 能 の 一 因 であると 考 えられる しかし この 低 下 量 は 先 行 研 究 で 得 られた mcd4δ に 比 べるとそれほど 極 端 ではなかった[10] この 考 察 とマクロファージ 活 性 化 の 要 因 に 関 する 検 討 については 第 5 章 で 述 べる 37

44 図 3.8 細 胞 壁 のグルコース 量 とマンノース 量 細 胞 壁 を 硫 酸 加 水 分 解 しグルコース 量 とマンノース 量 を HPLC で 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A:グルコ ース(β-グルカン) 量 B:マンノース(マンナン) 量 38

45 次 に 細 胞 壁 成 分 の 一 つであるキチン 量 について キチンに 結 合 する 蛍 光 試 薬 CFW を 用 いて 解 析 した( 図 3.9) AP-57 株 と AQ-37 株 では CFW の 蛍 光 は y-21 株 より 強 くな り BD-40 株 では CFW の 蛍 光 は y-21 株 よりわずかに 強 かった これらの 結 果 から 変 異 による 細 胞 壁 強 度 の 減 少 をキチン 量 の 増 加 によって 補 っていることが 示 唆 された こ の 蛍 光 強 度 の 増 加 は 細 胞 壁 構 造 の 変 化 により CFW がキチンに 結 合 しやすくなったとも 考 えられるが CFW は 分 子 量 と 小 さく 細 胞 壁 [11]を 透 過 でき 今 回 の 実 験 で は 過 剰 量 の CFW を 加 えているため ここではキチン 量 が 増 加 していると 考 えた 実 際 に どの 程 度 キチン 量 が 増 加 したかモルガン ネルソン 法 [12]を 用 いて 今 後 定 量 する 必 要 がある パン 酵 母 で 報 告 されている 細 胞 壁 モデル( 図 1.2)では キチンは β-グルカン 層 より も 内 側 すなわち 細 胞 質 側 に 位 置 する そのため キチン 量 が 増 加 しても β-グルカンの 露 出 には 大 きな 影 響 は 与 えないと 考 えられた 図 3.9 CFW によるキチン 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した 39

46 3.4 まとめ 企 業 から 入 手 した 実 用 パン 酵 母 を 材 料 に マクロファージ 活 性 化 能 の 高 い 酵 母 の 取 得 を 目 指 した 将 来 的 な 利 用 も 考 慮 し 遺 伝 子 組 換 え 操 作 ではなくアルキル 化 剤 EMS を 用 いた 変 異 処 理 により 目 的 株 の 取 得 に 取 り 組 んだ スクリーニングでは 浸 透 圧 感 受 性 SDS 感 受 性 マンナン 染 色 の 結 果 を 選 抜 基 準 に 取 り 入 れた 最 終 的 には TNF-α 分 泌 量 を 指 標 としたマクロファージ 活 性 化 能 で 評 価 し EMS 処 理 後 の 合 計 3620 株 のコロ ニーから 有 望 株 として 3 株 (AP-57 AQ-37 BD-40)を 取 得 した 従 って 異 なる 変 異 処 理 を 用 いて 他 にも 性 質 が 異 なる 変 異 株 が 取 得 できる 可 能 性 は 十 分 あると 考 えられる 取 得 株 の 細 胞 壁 成 分 について 解 析 すると いずれの 株 も y-21 株 と 比 較 して β-グルカ ン 量 ( 分 解 後 のグルコース 量 )に 大 きな 変 化 は 無 かったが マンナン 量 ( 分 解 後 のマン ノース) 量 は 減 少 する 傾 向 が 見 られた またキチン 量 について 蛍 光 染 色 を 用 い 解 析 し た 結 果 いずれの 取 得 変 異 株 も 増 加 する 傾 向 が 見 られ 細 胞 壁 強 度 の 低 下 をキチンの 増 加 で 補 っていることが 示 唆 された 取 得 変 異 株 の 高 い 活 性 化 能 の 理 由 の 一 つは マンナンの 減 少 による β-グルカンの 露 出 の 増 加 と 考 えられるが この 減 少 量 は mcd4δ ほど 極 端 ではなかった 他 の 理 由 として β- グルカンの 構 造 が 変 化 し 活 性 化 能 に 影 響 を 与 えている 可 能 性 があり これについては 第 5 章 で 述 べる 取 得 した 変 異 株 の 増 殖 能 や 発 酵 能 は 菌 株 によって 異 なった AP-57 株 と BD-40 株 は 増 殖 能 が 低 下 し AQ-37 株 はさらに 低 かった しかし 100 ml の 培 養 で 得 られる 菌 体 量 は 極 端 には 減 少 しなかった 発 酵 能 については AP-57 株 で 低 下 が 見 られ パンの 発 酵 に 利 用 する 場 合 は 不 利 な 性 質 となる 総 合 すると BD-40 株 が 優 れているが 他 の 株 も 十 分 に 応 用 可 能 な 有 望 株 と 判 断 した 取 得 株 における 高 い 活 性 化 能 や 細 胞 壁 成 分 の 変 化 などに 関 与 する 変 異 部 位 の 同 定 に ついては 第 4 章 で 述 べる また 本 章 で 得 られた 変 異 株 は 一 倍 体 株 で 実 用 的 には 遺 伝 的 に 安 定 な 二 倍 体 株 の 構 築 が 必 要 である 取 得 株 をもとにした 二 倍 体 の 構 築 については 第 5 章 で 述 べる 40

47 参 考 文 献 1. Maneesri J, Azuma M, Sakai Y, Igarashi K, Matsumoto T, Fukuda H, Kondo A, Ooshima H (2005) Deletion of MCD4 involved in glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor synthesis leads to an increase in β-1,6-glucan level and a decrease in GPI-anchored protein and mannan levels in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng 99: Azuma M, Levinson JN, Pagé N, Bussey H (2002) Saccharomyces cerevisiae Big1p, a putative endoplasmic reticulum membrane protein required for normal levels of cell wall β-1,6-glucan. Yeast 19: Machi K, Azuma M, Igarashi K, Matsumoto T, Fukuda H, Kondo A, Ooshima H (2004) Rot1p of Saccharomyces cerevisiae is a putative membrane protein required for normal levels of the cell wall β-1,6-glucan. Microbiology 150: López-García B, Gandía M, Muñoz A, Carmona L, Marcos JF (2010) A genomic approach highlights common and diverse effects and determinants of susceptibility on the yeast Saccharomyces cerevisiae exposed to distinct antimicrobial peptides. BMC Microbiol 10: Burke D, Dawson D, Stearns T, 大 矢 禎 一, 川 向 誠, 仁 川 純 一, 板 垣 正, 河 野 享 子 (2002) 酵 母 遺 伝 子 実 験 マニュアル Methods in yeast genetics A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. 丸 善. 6. 山 本 正 幸, 大 矢 禎 一 (1998) 酵 母 ラ ボ マ ニ ュ ア ル 酵 母 分 子 細 胞 生 物 学 実 験 法 (Springer lab manual). シュプリンガー フェアラーク 東 京. 7. Dallies N, Francqois J, Paquet V (1998) A new method for quantitative determination of polysaccharides in the yeast cell wall. Application to the cell wall defective mutants of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14: Lesage G, Bussey H (2006) Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 70: Yoshikawa K, Tanaka T, Ida Y, Furusawa C, Hirasawa T, Shimizu H (2011) Comprehensive 41

48 phenotypic analysis of single-gene deletion and overexpression strains of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 28: 酒 井 裕 美 子 (2005) 免 疫 賦 活 作 用 を 有 する β-グルカン 露 出 酵 母 の 開 発. 大 阪 市 立 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 修 士 論 文. 11. Klis FM, Boorsma A, De Groot PW (2006) Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 23: Bulawa CE (1992) CSD2 CSD3 and CSD4 genes required for chitin synthesis in Saccharomyces cerevisiae: the CSD2 gene product is related to chitin synthases and to developmentally regulated proteins in Rhizobium species and Xenopus laevis. Mol Cell Boil 12:

49 第 4 章 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 変 異 部 位 の 同 定 4.1 はじめに 第 3 章 では 実 用 パン 酵 母 の 一 倍 体 株 を 変 異 処 理 し 得 られたコロニーから 浸 透 圧 や SDS に 対 する 感 受 性 やマンナン 染 色 の 結 果 を 指 標 とし 選 抜 を 行 い 最 終 的 に 高 いマクロ ファージ 活 性 化 能 を 持 つ 3 株 (AP-57 AQ-37 BD-40)を 取 得 した これらの 株 は 細 胞 表 面 のマンナン 量 が 減 少 し β-グルカンが 露 出 する 傾 向 が 示 唆 された また 細 胞 壁 キチンの 蛍 光 染 色 からキチン 量 が 増 加 する 傾 向 も 見 られた 先 行 研 究 および 第 2 章 では 高 いマクロファージ 活 性 化 能 と 遺 伝 子 変 異 の 関 係 につい て GPI アンカー 合 成 に 関 わる MCD4 遺 伝 子 の 欠 損 が 高 い 活 性 化 能 を 導 くことを 明 らか にしている しかし それ 以 外 の 情 報 はなく 酵 母 によるマクロファージ 活 性 化 の 機 構 を 理 解 するためには さらに 詳 しく 遺 伝 的 な 影 響 を 調 べる 必 要 がある MCD4 遺 伝 子 欠 損 株 と 第 3 章 で 得 られた 変 異 株 では 増 殖 能 や 細 胞 壁 マンナン 量 の 変 化 の 割 合 が 異 なっ ていた そこで 第 4 章 では 第 3 章 で 取 得 した 変 異 株 の 変 異 遺 伝 子 の 同 定 を 酵 母 のゲノ ムライブラリーを 用 いて 試 みた また DNA 塩 基 配 列 解 析 により 変 異 部 位 の 同 定 も 試 みた 4.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 第 3 章 で 獲 得 した 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する AP-57 株 (MATa ura3δ0) AQ-37 株 ( MATa ura3δ0) BD-40 株 ( MATa ura3δ0)を 変 異 部 位 の 同 定 のために 用 いた 比 較 のために 実 用 パン 酵 母 の 親 株 y-21(mata ura3δ0)を 使 用 した 培 地 には 第 3 章 と 同 じ YPD に 加 え YNB(0.17%イーストニトロゲンベース 0.5% 硫 酸 アンモニウム 2%グルコース)を 用 い 必 要 に 応 じて 栄 養 素 (60 μg/ml ロイシン 20 μg/ml ヒスチジ 43

50 ン 20 μg/ml メチオニン 30 μg/ml リシン 20 μg/ml ウラシル)を 加 えた また 浸 透 圧 保 護 が 必 要 な 時 は 0.6 M のソルビトールを 添 加 した(YNBS) 固 体 培 地 には 2%の 寒 天 を 添 加 した プラスミドの 増 幅 は E. coli JM109 株 (ニッポンジーンまたは RBC Bioscience)に 形 質 転 換 し 50 μg/ml のアンピシリンを 含 む LB 培 地 (1%トリプトン 0.5% 酵 母 エキス 1% 塩 化 ナトリウム)で 培 養 後 Wizard plus SV minipreps DNA purification system(プロメガ)または HiYield TM plasmid mini kit(rbc Bioscience)で 菌 体 からプラ スミドを 抽 出 した ゲノムライブラリーを 用 いた 形 質 転 換 ゲノムライブラリーとして S. cerevisiae Library YCp50 CEN BANK CenBank A (ATCC 37415) と CenBank B (ATCC 37415B)を 使 用 した このライブラリーには 選 択 マーカーとしての URA3 遺 伝 子 を 持 つ YCP50( 低 コピープラスミド)に S. cerevisiae のゲノムが 挿 入 されている[1] 酵 母 の 形 質 転 換 には Fast-Yeast transformation kit(geno Technology)を 使 用 した 酵 母 は 4 ml の YPD 液 体 培 地 を 含 む 試 験 管 を 用 い 30 で 16 時 間 培 養 した 遠 心 分 離 に より 回 収 し Wash solution 4 ml で 洗 浄 し Competent solution 400 μl に 懸 濁 した 懸 濁 液 50 μl を 5 μl のプラスミド 溶 液 と 混 合 し Transformation solution 500 μl に 添 加 した 懸 濁 後 30 で 45 分 インキュベートし YNB 固 体 培 地 を 用 いて 30 で 3 日 間 培 養 した ウラシルの 選 択 性 から 生 育 したコロニーを 形 質 転 換 株 とし 変 異 遺 伝 子 の 同 定 に 使 用 した 相 補 プラスミドをもつ 株 の 選 抜 取 得 した 形 質 転 換 株 から 変 異 を 相 補 した 株 の 選 抜 は 次 のように 行 った まず ソルビ トールを 用 い 浸 透 圧 への 影 響 を 調 べた YNB および YNBS の 固 体 培 地 を 使 用 して 30 で 3 日 間 培 養 した 両 培 地 で 形 質 転 換 株 の 生 育 を 比 較 し ともに 親 株 y-21 と 同 程 度 の 生 育 を 示 す 株 を 選 抜 した 次 に 細 胞 壁 マンナン 量 を 第 3 章 で 示 した ConA-FITC 染 色 44

51 によって 比 較 した 変 異 株 の 弱 い 蛍 光 が y-21 株 と 同 程 度 に 回 復 した 株 を 選 抜 した こ の 時 同 時 に 細 胞 形 態 についての 観 察 を 行 い y-21 株 と 同 様 の 形 態 に 戻 った 株 を 選 抜 し た 酵 母 からのプラスミド 回 収 選 抜 株 からのプラスミド 抽 出 は 次 のように 行 った[2] YNB 液 体 培 地 4 ml を 含 む 試 験 管 を 用 い 30 で 16 時 間 培 養 し 遠 心 回 収 した 滅 菌 水 で 菌 体 を 洗 浄 し 300 μl の Disruption buffer (ph 8.0 の 10 mm トリス 塩 酸 緩 衝 液 1 mm エチレンジアミン 四 酢 酸 100 mm 塩 化 ナトリウム 1%ドデシル 硫 酸 ナトリウム 2%トリトン X-100)に 懸 濁 した ガラスビーズと 300 μl のフェノール クロロホルム イソアミルアルコール(25:24:1) 溶 液 を 加 え 2 分 間 撹 拌 した 遠 心 分 離 により 上 清 を 回 収 し 300 μl のフェノール クロ ロホルム イソアミルアルコール 溶 液 を 加 え 撹 拌 した 遠 心 分 離 により 上 清 を 回 収 し 30 μl の 3 M 酢 酸 ナトリウムと 300 μl のイソプロパノールを 加 え 混 合 した 遠 心 分 離 で 上 清 を 除 去 し 70%エタノールでリンスした 遠 心 後 の 上 清 を 除 去 し 減 圧 乾 燥 した さらに 30 μl の 17%ポリエチレングリコール 6,000 と 8 μl の 4 M 塩 化 ナトリウムを 加 えて 温 和 に 混 合 し 1 時 間 氷 冷 した 遠 心 分 離 により 沈 澱 を 回 収 し 70%エタノールで リンスし 滅 菌 水 20 μl に 懸 濁 しプラスミド 溶 液 を 得 た これを 用 いて E. coli を 形 質 転 換 し 増 幅 した 後 酵 母 を 再 度 形 質 転 換 し 形 質 転 換 株 の 形 態 と 細 胞 壁 マンナン 量 を 確 認 した 相 補 プラスミドの 配 列 解 析 形 態 や 細 胞 壁 マンナンなどの 形 質 を 相 補 したプラスミドについてその 挿 入 断 片 の 塩 基 配 列 を 解 析 した 塩 基 配 列 の 決 定 はタカラバイオ( 株 )に 委 託 し アプライドバイオ システムズ 3730xl DNA analyzer(ライフテクノロジーズジャパン)を 用 いて 行 われた 挿 入 断 片 の S. cerevisiae のゲノム 上 の 位 置 は データベース[3]を 用 い BLAST 検 索 に より 決 定 した 45

52 4.2.6 プラスミドの 構 築 変 異 を 相 補 する 遺 伝 子 を 同 定 するために 得 られたプラスミド(YCP50-AQ37)をも とに 3 種 のプラスミドを 構 築 した( 図 4.1) 使 用 する 制 限 酵 素 はニッポンジーンから 購 入 した 酵 素 反 応 後 の DNA の 回 収 は 電 気 泳 動 後 のゲルから 目 的 のサイズのバンド を 切 り 出 し HiYield TM gel/pcr DNA fragment extraction kit (RBC Bioscience)で 抽 出 精 製 した ライゲーションは Ligation-convenience kit(ニッポンジーン)を 用 い 16 1 時 間 行 った 以 下 に 3 種 のプラスミド 構 築 について 記 す なお 目 的 とするプラスミド か 否 かは 適 宜 制 限 酵 素 処 理 を 行 い 反 応 後 に 生 じた 断 片 のサイズから 判 断 した 1 YCP50-G N:YCP50-AQ37(18,140 bp)を BamHI で 37 一 晩 処 理 し 生 じた 3 種 の DNA 断 片 のうち 最 も 大 きな 断 片 (12,549 bp)を 回 収 した これをセルフライ ゲーションし 構 築 した 2 prs426-m G:まず prs426[4]を BamHI で 37 一 晩 処 理 し セルフライゲ ーションを 防 ぐために 仔 牛 小 腸 由 来 アルカリホスファターゼ(ニッポンジーン) を 用 い 60 で 1 時 間 脱 リン 酸 化 処 理 した さらに YCP50-AQ37 を BglII で 37 一 晩 処 理 し 生 じた 5,390 bp の 断 片 を prs426 の BamHI サイトに 挿 入 し 構 築 した 3 YCP50-NDD1:YCP50-G N を HindIII で 37 一 晩 処 理 し 生 じた 2 種 の DNA 断 片 のうち 最 も 大 きな 断 片 (10,571 bp)を 回 収 した これをセルフライゲーショ ンし 構 築 した 46

53 図 4.1 構 築 したプラスミドに 挿 入 されている S. cerevisiae の DNA 断 片 太 線 はベクター(YCP50) 由 来 の DNA を 示 す 変 異 を 相 補 する 遺 伝 子 の 決 定 構 築 したプラスミドを 酢 酸 リチウム 法 で 導 入 し 酵 母 を 形 質 転 換 した[2] 酵 母 を 50 μl の Transformation buffer (20%ポリエチレングリコール 6, mm 酢 酸 リチ ウム 100 mm ジチオスレイトール)に 懸 濁 し 遠 心 分 離 により 菌 体 を 回 収 した 50 μl の Transformation buffer 5 μl のキャリアーDNA(クロンテック)と 5 μl のプラスミド を 加 え 混 合 後 42 で 1 時 間 インキュベートした YNBS 固 体 培 地 に 塗 布 して 30 で 3 日 間 培 養 した 生 育 したコロニーの 細 胞 形 態 を 調 べ 形 態 が y-21 株 と 同 様 に 回 復 した 株 を 選 抜 した 変 異 を 相 補 する 株 から 抽 出 したプラスミドを 用 い 相 補 遺 伝 子 を 決 定 し た 47

54 4.2.8 変 異 株 の 表 現 型 相 補 に 関 する 実 験 細 胞 壁 解 析 ConA-FITC によるマンナン 染 色 からマンナン 量 の 変 化 を 観 察 した また CFW によ るキチン 染 色 を 第 3 章 のように 行 い キチン 量 の 変 化 を 観 察 した 細 胞 壁 タンパク 量 は 次 のように 測 定 した 50 ml の YNB 液 体 培 地 で 培 養 した 酵 母 を 用 い ビーズクラッシ ャーµT-01(Taitec)を 用 いてガラスビーズで 破 砕 し 第 3 章 に 記 載 したように 細 胞 壁 画 分 を 回 収 した この 細 胞 壁 を 2 mg/ml になるように 滅 菌 水 に 懸 濁 した タンパク 質 濃 度 の 測 定 はバイオ ラッドプロテインアッセイ(バイオ ラッド)を 用 いてブラッドフ ォード 法 で 行 った[5] ウシ 血 清 アルブミン(ニュー イングランド バイオラボ)を 標 準 タンパク 質 としタンパク 質 濃 度 を 決 定 した 増 殖 の 測 定 第 3 章 に 記 載 したように 3 ml の YNB 液 体 培 地 を 含 む 試 験 管 で 培 養 し OD 600 の 経 時 変 化 からその 増 殖 能 を 評 価 した 高 温 感 受 性 と CFW 感 受 性 感 受 性 試 験 は 次 のように 行 った[6] YNB 液 体 培 地 3 ml を 含 む 試 験 管 を 用 い 酵 母 を 30 で 一 晩 培 養 した YNB で OD 600 を 0.5 に 調 製 し 菌 液 を 1 倍 10 倍 100 倍 1000 倍 に 希 釈 した それぞれの 菌 液 を 5 μl ずつ 以 下 の 固 体 培 地 にスポットし 培 養 した 高 温 に 対 する 感 受 性 試 験 は YNB 培 地 を 用 い 37 で 培 養 し キチン 合 成 阻 害 を 介 して 生 育 を 阻 害 する CFW[7 9]に 対 する 感 受 性 試 験 は 150 μg/ml の CFW を 含 む YNB 培 地 を 用 い 30 で 培 養 した これらのコントロールとして YNB 培 地 を 用 い 30 で 培 養 し その 生 育 を 比 較 した マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 YNB 培 地 で 培 養 した 酵 母 を 用 い 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 によるマクロファージ 48

55 活 性 化 能 を 第 2 章 や 第 3 章 に 記 載 したように 評 価 した 配 列 解 析 と 変 異 部 位 の 同 定 塩 基 配 列 決 定 に 使 用 する DNA は 次 のように 抽 出 した[2] YPD 固 体 培 地 で 2 日 間 培 養 した 酵 母 を 爪 楊 枝 でかきとり 100 μl の Lysis buffer (1 %トリトン X mm 塩 化 ナトリウム 1 mm エチレンジアミン 四 酢 酸 ph 8.0 の 10 mm トリス 塩 酸 緩 衝 液 ) に 懸 濁 し 100 mg のガラスビーズを 加 えた 次 に フェノール クロロホルム イソア ミルアルコール(ニッポンジーン)を 100 μl 加 え ボルテックスで 10 分 攪 拌 後 遠 心 分 離 した 得 られた 上 清 15 μl を 100 μl の 滅 菌 水 に 加 え DNA 溶 液 とした 変 異 株 と 親 株 y-21 の NDD1 遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 2 種 の プ ラ イ マ ー ( 5 - ACCTAGTCGGCAATTTTTTCACCTG-3 と 5 - CTTCGTGCCATAAATTTGTGATCGTTC -3 )と TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ)を 使 用 し PCR(94 で 2 分 保 温 し 94 で 30 秒 55 で 45 秒 72 で 3 分 を 30 サイクル 行 い 72 で 4 分 反 応 )により 増 幅 した に 記 載 したように DNA を 抽 出 し 電 気 泳 動 後 バンドの 濃 さを DNA マーカ ー(ニッポンジーン)と 比 較 しその 濃 度 を 推 定 した 50 ng/μl に 濃 度 を 調 製 し DNA 配 列 の 決 定 をライフテクノロジーズジャパン( 株 )に 委 託 した 解 析 結 果 から ゲノム データベース( 実 験 室 酵 母 S288C 株 )の DNA 配 列 と 比 較 した 4.3 結 果 と 考 察 ゲノムライブラリーを 用 いた 形 質 転 換 株 から 相 補 プラスミドの 取 得 取 得 したマクロファージ 活 性 化 変 異 株 の 全 て(AP-57 AQ-37 BD-40)について 変 異 を 相 補 するプラスミドを S. cerevisiae のゲノムライブラリーから 探 索 した しかし AP-57 株 と BD-40 株 ではそれらの 形 質 を 相 補 した 株 は ゲノムライブラリーを 用 いた 形 質 転 換 株 から 得 られなかった その 理 由 として AP-57 株 と BD-40 株 では 複 数 の 変 異 遺 伝 子 がその 形 質 に 関 与 し 一 つの 遺 伝 子 だけでは 相 補 できないことも 考 えられる これ 以 降 では 相 補 株 が 得 られた AQ-37 株 の 結 果 について 説 明 する 49

56 ゲノムライブラリーを 使 用 して AQ-37 株 を 形 質 転 換 した 形 質 転 換 株 はウラシルの 栄 養 要 求 性 相 補 から 選 抜 し 703 コロニーを 得 た ここで YPD 固 体 培 地 より 栄 養 源 の 少 ない YNB 固 体 培 地 では 培 地 成 分 による 浸 透 圧 保 護 効 果 が 低 い そのため AQ-37 株 の 生 育 は YNB 培 地 を 用 いた 方 が 浸 透 圧 の 影 響 を 受 けやすく その 遅 延 の 様 子 が 明 確 になる 従 って YNB 培 地 を 用 い 形 質 転 換 株 の 生 育 に 対 するソルビトールの 添 加 の 影 響 を 調 べた 添 加 の 有 無 に 関 わらず y-21 株 と 同 様 に 生 育 できる 株 を 231 株 選 抜 した 次 に 231 株 すべてについてその 細 胞 形 態 観 察 や ConA-FITC を 用 いた 細 胞 壁 マンナン 量 の 解 析 を 行 った その 結 果 両 方 の 解 析 で y-21 株 と 同 様 の 表 現 型 を 示 す 1 株 を 取 得 し た( 図 4.2) この 形 質 転 換 株 からプラスミドを 抽 出 し YCP50-AQ37 と 命 名 した AQ-37 株 に 近 い 細 胞 形 態 を 示 す BD-40 株 では この YCP50-AQ37 を 使 用 して 形 質 転 換 しても 形 態 が y-21 株 のように 戻 らなかった( 図 4.3) そのため BD-40 株 は AQ-37 株 とは 異 なった 変 異 を 持 つと 判 断 した 図 4.2 ConA-FITC による 形 態 を 相 補 した 形 質 転 換 株 のマンナン 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した 50

57 図 4.3 YCP50-AQ37 を 使 用 して 形 質 転 換 した BD-40 株 の 細 胞 形 態 YCP50 はコントロールプラスミドとして 用 いた スケールバーは 5 μm を 示 す YCP50-AQ37 の YCP50 に 挿 入 されたゲノム 断 片 の 染 色 体 上 の 位 置 を 明 らかにするた め YCP50[1]の DNA 塩 基 配 列 情 報 を 利 用 し 断 片 両 端 付 近 の 塩 基 配 列 を 解 析 した 酵 母 のゲノムの 断 片 の 染 色 体 上 の 位 置 は 公 表 されているゲノムデータベースを 使 用 し て 決 定 した[3] その 結 果 この 断 片 は 15 番 染 色 体 の 1,026,367 1,036,556 bp に 位 置 し ていた この 領 域 には 不 完 全 な 1 つの 遺 伝 子 ( 開 始 コドンを 含 まない SCP1)と 完 全 な 5 種 の 遺 伝 子 (RAD17 RPS12 MRS6 GPB1 NDD1)を 含 んでいた( 図 4.1) 変 異 遺 伝 子 の 同 定 AQ-37 株 は 偽 菌 糸 形 態 を 持 つ 傾 向 があった( 図 3.1) 形 態 相 補 の 確 認 が 最 も 簡 単 で 評 価 しやすいため 主 として 形 態 相 補 から 遺 伝 子 の 同 定 を 進 めた 前 述 の 6 つの 遺 伝 子 の うち GPB1 遺 伝 子 と NDD1 遺 伝 子 の 変 異 株 は 偽 菌 糸 形 態 を 示 すと 報 告 されている[10 11] そのため まず GPB1(2,694 bp)と NDD1(1,665 bp)について AQ-37 株 の 特 徴 的 な 偽 菌 糸 形 態 を 相 補 するか 調 べた 不 完 全 な GPB1( 開 始 コドンを 含 む 2,521bp)と 完 全 な NDD1 を 含 む YCP50-G N を 構 築 し 形 質 転 換 株 の 細 胞 形 態 を 観 察 した その 結 果 AQ-37 株 の 形 態 は 偽 菌 糸 状 から y-21 株 と 同 様 の 酵 母 状 にもどった( 図 4.4) 従 っ て GPB1 遺 伝 子 あるいは NDD1 遺 伝 子 が AQ-37 株 の 変 異 を 相 補 することが 示 唆 された 51

58 次 に どちらの 遺 伝 子 が AQ-37 株 の 形 態 を 相 補 するかを 解 明 するために prs-426m G と YCP50-NDD1 を 構 築 した prs426m G は 不 完 全 な MRS6( 開 始 コドンを 含 む 881 bp) と 完 全 な GPB1 と 不 完 全 な NDD1( 開 始 コドンを 含 まない 697 bp)を 持 つ 一 方 で YCP50-NDD1 は 不 完 全 な GPB1( 開 始 コドンを 含 む 593 bp)と 完 全 な NDD1 を 持 つ AQ-37 株 にそれら 2 つのプラスミドを 用 いて 形 質 転 換 した 図 4.4 に 示 すように prs-426m G の 形 質 変 換 株 では 細 胞 形 態 の 復 帰 は 観 察 されなかった 一 方 YCP50-NDD1 では AQ-37 株 の 細 胞 形 態 を 相 補 し y-21 株 と 同 様 の 酵 母 形 態 に 戻 った 以 上 の 結 果 から NDD1 遺 伝 子 が AQ-37 株 の 変 異 を 相 補 すると 示 唆 された 図 4.4 構 築 したプラスミドを 形 質 転 換 した AQ-37 株 の 細 胞 形 態 YCP50 はコントロールプラスミドとして 用 いた スケールバーは 5 μm を 示 す NDD1 遺 伝 子 による 表 現 型 の 相 補 NDD1 遺 伝 子 が AQ-37 株 の 形 態 以 外 の 表 現 型 を 相 補 するか 確 認 した まず 第 3 章 52

59 で 観 察 した 細 胞 壁 成 分 変 化 (マンナン キチン)を 相 補 するかを 蛍 光 染 色 から 確 認 した マンナン 染 色 における AQ-37 株 の ConA-FITC の 弱 い 蛍 光 は 図 4.2 で 観 察 されたよう に YCP50-NDD1 によって 相 補 された( 図 4.5 A) また AQ-37 株 の 強 いキチンの 蛍 光 も YCP50-NDD1 によって 相 補 された( 図 4.5 B) 次 に AQ-37 株 の 細 胞 壁 タンパク 質 量 は y-21 株 より 減 少 する 傾 向 が 見 られた( 図 4.5 C)が その 減 少 を NDD1 遺 伝 子 が 相 補 するかについて 調 べた その 結 果 図 4.5 C に 見 られるように YCP50-NDD1 はこの 減 少 も 相 補 した 従 って 細 胞 壁 成 分 の 変 化 は NDD1 遺 伝 子 で 相 補 されることが 分 かっ た AQ-37 株 の 変 異 による 液 体 培 地 での 増 殖 遅 延 についてもその 相 補 性 を 調 べた 図 4.6 に 示 すように AQ-37 株 の 液 体 培 地 での 増 殖 遅 延 は YCP50-NDD1 によって 明 確 に 相 補 された 文 献 情 報 から NDD1 遺 伝 子 の 変 異 株 は 温 度 (37 など)や 薬 剤 (CFW など) に 対 して 感 受 性 になり それら 条 件 下 では 生 育 が 低 下 すると 報 告 されている[12] そ こで AQ-37 株 もこれらと 同 様 の 性 質 を 示 し さらに NDD1 遺 伝 子 はそれらの 性 質 を 相 補 するかについて 寒 天 培 地 上 で 生 育 を 調 べた( 図 4.7) まず AQ-37 株 では 37 の 生 育 が 30 より 低 下 し CFW の 添 加 によっても 同 様 に 低 下 した 次 に それら YCP50-NDD1 導 入 による 影 響 を 調 べた 結 果 温 度 感 受 性 の CFW 感 受 性 も NDD1 導 入 に より 相 補 された 53

60 図 4.5 YCP50-NDD1 による AQ-37 株 の 細 胞 壁 成 分 の 相 補 A:ConA-FITC によるマンナン 染 色 B:CFW によるキチン 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した C: 乾 燥 細 胞 壁 当 たりタンパク 質 量 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す YCP50 はコン トロールプラスミドとして 用 いた 54

61 図 4.6 YCP50-NDD1 導 入 が AQ-37 株 の 増 殖 に 与 える 影 響 各 シンボルは y-21+ycp50 ( ) y-21+ycp50-ndd1 ( ) AQ-37+YCP50 ( ) AQ-37+YCP50-NDD1( )を 示 す YCP50 はコントロールプラスミドとして 用 いた 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 図 4.7 YCP50-NDD1 による 高 温 や CFW に 対 する 感 受 性 の 相 補 一 定 濃 度 に 調 製 した 酵 母 懸 濁 液 を 1 倍 10 倍 100 倍 1000 倍 に 希 釈 し 左 から 順 にスポットし 30 または 37 で 3 日 間 培 養 した YCP50 はコントロールプラスミドとして 用 いた 55

62 最 後 に NDD1 遺 伝 子 が AQ-37 株 の 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 相 補 するか 調 べ た 図 4.8 に 示 すように YCP50-NDD1 を AQ-37 株 に 導 入 すると AQ-37 株 の 高 い 活 性 化 能 は y-21 株 程 度 まで 減 少 した 従 って NDD1 遺 伝 子 が 活 性 化 能 を 相 補 すること が 分 かった 図 4.8 YCP50-NDD1 導 入 によるマクロファージ 活 性 化 能 の 相 補 酵 母 とマクロファージを 6 時 間 接 触 させ 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 ( cells/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 接 触 させた LPS(100 ng/ml) と 培 地 (RPMI-1640)はコントロールとして YCP50 はコントロールプラスミドとして 使 用 し た 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 または 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバー は 標 準 偏 差 を 示 す 56

63 4.3.4 AQ-37 株 の NDD1 遺 伝 子 変 異 部 位 の 同 定 y-21 株 と AQ-37 株 から 抽 出 したゲノム DNA をテンプレートとして 用 い NDD1 遺 伝 子 の 開 始 コドンから 上 流 の 領 域 (340 bp)と 終 止 コドンより 下 流 の 領 域 (164 bp)を 含 む 約 2,000 bp の 断 片 を PCR によって 増 幅 した AQ-37 株 の NDD1 遺 伝 子 の 変 異 部 位 を 同 定 するために 回 収 した DNA 断 片 の 配 列 を 解 析 した また 図 4.9 に 示 すアミノ 酸 配 列 は DNA 塩 基 配 列 の 結 果 に 基 づき 推 定 した 57

64 図 4.9 DNA 塩 基 配 列 の 解 析 結 果 から 推 定 される NDD1 タンパク 質 のアミノ 酸 配 列 S288C 株 のアミノ 酸 配 列 は 公 表 されているデータベースから 得 た[3] 数 字 はそれぞれの 株 の NDD1 タンパク 質 のアミノ 酸 番 号 を 示 す 下 線 部 は S288C 株 との 相 違 点 を 示 す は NDD1 タ ンパク 質 のカルボキシル 末 端 を 示 す 58

65 親 株 として 用 いた 実 用 パン 酵 母 y-21 株 では 実 験 室 酵 母 として 用 いられている S288C 株 の DNA 塩 基 配 列 [3]と 比 較 すると NDD1 遺 伝 子 の DNA 塩 基 配 列 は 部 分 的 に 異 な っていた まず y-21 株 では S288C 株 の NDD1 遺 伝 子 (1,665bp)の 300 番 目 の 塩 基 の 後 に 5 -CAACAACAGCAA-3 の 配 列 が 挿 入 されており 結 果 として 4 アミノ 酸 (QQQQ) が 加 わっていた また 7 箇 所 で 1 塩 基 置 換 (129T C 390A G 481T G 774G A 816G A 864C T 1343C T)があり これらの 変 化 によって 2 箇 所 で 1 アミノ 酸 置 換 が 生 じた(161F V と 448S L) 5 箇 所 の 1 塩 基 置 換 はアミノ 酸 配 列 に 影 響 しなか った 実 験 室 酵 母 と 実 用 パン 酵 母 では DNA 塩 基 配 列 はかなりの 頻 度 で 異 なっているこ とが 示 唆 された 次 に y-21 株 と AQ-37 株 で NDD1 遺 伝 子 の DNA 塩 基 配 列 を 比 較 した 結 果 として 2 箇 所 で 1 塩 基 置 換 が 起 きていた(339A G と 349C T) 前 者 の 変 化 ではアミノ 酸 配 列 に 影 響 しなかったが 後 者 の 変 化 によって 終 止 コドンが 生 じた このナンセンス 変 異 によって AQ-37 株 では 116 番 目 の Q でアミノ 酸 合 成 が 止 まっており y-21 株 の NDD1 タンパク 質 は 558 アミノ 酸 からなるのに 対 し AQ-37 株 では 116 アミノ 酸 になっていた S288C 株 (554 アミノ 酸 )と 比 べても 極 端 に 短 くなっていた 文 献 情 報 では 実 験 室 酵 母 の NDD1 遺 伝 子 欠 損 株 は 生 育 できず NDD1 タンパク 質 は N 末 端 から 216 アミノ 酸 より 短 くなると 融 合 タンパク 質 が 活 性 を 持 たず 機 能 しないと 報 告 されている[12] 従 って 116 アミノ 酸 で 構 成 される AQ-37 株 の NDD1 タンパク 質 は 細 胞 内 で 機 能 して いないことが 示 唆 される 以 上 の 結 果 から AQ-37 株 では NDD1 タンパク 質 の 機 能 の 欠 失 が 細 胞 壁 構 造 等 に 影 響 し 結 果 として 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 得 たことが 強 く 示 唆 される これまでに NDD1 遺 伝 子 の 変 異 株 の 解 析 はあまり 行 われていないが NDD1 タンパ ク 質 に 関 連 する 情 報 と 上 記 の 結 果 との 関 係 について 以 下 にまとめる 1 NDD1 タンパク 質 は FKH2 タンパク 質 および MCM1 タンパク 質 と 複 合 体 を 形 成 し CLB2 遺 伝 子 や CDC5 遺 伝 子 の 転 写 を 活 性 化 し この NDD1 タンパク 質 の 機 能 は CLB2 遺 伝 子 では 319T CDC5 遺 伝 子 では 85S のリン 酸 化 により 調 節 されている [11 59

66 12] CLB2 タンパク 質 と CDC5 タンパク 質 は G2 期 から M 期 の 移 行 を 制 御 する CDC28 タンパク 質 を 活 性 化 させるので[12]NDD1 遺 伝 子 の 変 異 による 細 胞 周 期 の 異 常 が AQ-37 株 の 増 殖 能 の 低 下 に 影 響 したかもしれない 2 実 験 室 酵 母 (S288C 株 と W303 株 )では NDD1 遺 伝 子 は 生 育 に 必 須 であるが[12 13] AQ-37 株 ではタンパク 質 が 機 能 しない 程 のナンセンス 変 異 にも 関 わらず 増 殖 することが 観 察 された 遺 伝 子 欠 損 の 影 響 は 酵 母 の 株 によっても 異 なることがあ る y-21 株 と S288C 株 で NDD1 遺 伝 子 の DNA 塩 基 配 列 が 異 なっていたことからも 実 用 パン 酵 母 と 実 験 室 酵 母 で 遺 伝 子 欠 損 の 影 響 はかなり 異 なることが 考 えられる 3 これまで NDD1 タンパク 質 が 細 胞 壁 成 分 に 直 接 影 響 することを 示 した 報 告 はない しかし 以 下 の 3 つの 情 報 から AQ-37 株 の 変 異 が 細 胞 壁 成 分 の 変 化 と 関 係 している かもしれない 1 つ 目 は 細 胞 周 期 の 異 常 が 細 胞 壁 合 成 に 影 響 したことが 考 えられ る CDC28 遺 伝 子 は サイクリン 依 存 性 プロテインキナーゼをコードし 細 胞 周 期 の 重 要 な 制 御 因 子 である この 酵 素 活 性 には CDC28 タンパク 質 とサイクリンの 結 合 が 必 要 である[14] 加 えて 先 にも 述 べたがサイクリンをコードする CLB2 遺 伝 子 の 発 現 は NDD1 タンパク 質 によって 制 御 されている [12] 従 って NDD1 遺 伝 子 の 変 異 は 細 胞 周 期 へ 大 きく 影 響 する 細 胞 壁 成 分 の 合 成 には 基 質 と 合 成 酵 素 が 合 成 部 位 に 正 確 に 輸 送 され 正 確 なタイミングで 正 確 な 量 が 合 成 されることが 必 要 である そのため 細 胞 周 期 の 間 に 多 くの 細 胞 壁 関 連 遺 伝 子 の 転 写 は 変 動 する[14] 細 胞 周 期 の 異 常 が 細 胞 壁 形 成 に 関 わる 因 子 に 影 響 する 可 能 性 は 高 く NDD1 遺 伝 子 の 異 常 は 細 胞 壁 組 成 の 変 化 を 導 くかもしれない 2 つ 目 は 細 胞 壁 関 連 遺 伝 子 の 転 写 に 異 常 が 起 きたかもしれない 転 写 因 子 のゲノム 結 合 領 域 について 種 々の 網 羅 的 解 析 による 結 果 が 報 告 されており[15 16] NDD1 タンパク 質 が 細 胞 壁 関 連 遺 伝 子 の 転 写 制 御 因 子 である 可 能 性 も 考 えられる それゆえ NDD1 遺 伝 子 の 変 異 がそれ らの 遺 伝 子 発 現 を 変 化 させ 細 胞 壁 組 成 に 変 化 を 与 えたかもしれない 3 つ 目 は 細 胞 壁 の 異 常 が PKC1 タンパク 質 を 介 して 生 じていることも 考 えられる PKC1 タ ンパク 質 は 細 胞 壁 成 分 の 合 成 におけるシグナル 伝 達 経 路 系 で 重 要 な 役 割 を 果 たし 60

67 エピスタシス 解 析 によって PKC1 タンパク 質 の 上 流 に ACK1 タンパク 質 が 位 置 する [17 18]と 報 告 されている また ACK1 タンパク 質 と NDD1 タンパク 質 の 相 互 作 用 が S.cerevisiae のツーハイブリッド 法 によって 示 されている[19] それゆえ NDD1 遺 伝 子 の 変 異 が PKC1 タンパク 質 に 関 与 するシグナル 伝 達 経 路 に 影 響 し 細 胞 壁 組 成 の 変 化 を 導 いたかもしれない いずれも 推 定 でしかないが NDD1 タンパ ク 質 の 変 異 が 細 胞 表 面 の 構 造 に 重 要 な 変 化 を 引 き 起 こす 可 能 性 が 十 分 に 考 えられる 4.4 まとめ 第 3 章 で 取 得 した 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 酵 母 の 変 異 部 位 の 同 定 を 試 みた S.crevisiae のゲノムライブラリーを 使 用 して 形 質 転 換 し 浸 透 圧 やマンナン 量 を 判 断 基 準 に 候 補 株 を 選 抜 した その 結 果 AQ-37 株 でその 形 質 が 相 補 された 株 を1 株 取 得 した その 株 からプラスミド(YCP50-AQ37)を 抽 出 し YCP50 に 挿 入 されたゲノム 断 片 の 両 端 付 近 を 配 列 解 析 した このゲノム 断 片 には 6 種 の 遺 伝 子 を 含 み まず AQ-37 株 で 観 察 された 偽 菌 糸 形 態 に 関 与 する GPB1 遺 伝 子 と NDD1 遺 伝 子 について 解 析 した 3 種 のプラスミド(YCP50-G N prs-426m G YCP50-NDD1)を 構 築 し 細 胞 形 態 を 観 察 した 結 果 最 終 的 に NDD1 遺 伝 子 が AQ-37 株 の 細 胞 形 態 を 相 補 する 遺 伝 子 であるこ とが 分 かった また NDD1 遺 伝 子 はマクロファージ 活 性 化 能 も 相 補 した それに 加 え て マンナンの 減 少 キチンの 増 加 細 胞 壁 タンパク 量 の 低 下 増 殖 能 の 低 下 高 温 や CFW に 対 する 感 受 性 も 相 補 した NDD1 遺 伝 子 の 変 異 が 活 性 化 能 や 細 胞 壁 成 分 などに 影 響 することが 強 く 示 唆 された さらに NDD1 遺 伝 子 の 変 異 部 位 を 同 定 するために DNA 塩 基 配 列 を 解 析 しアミノ 酸 配 列 を 推 定 した まず ゲノムデータベースの S288C 株 の 配 列 と 比 較 すると y-21 株 では 12 塩 基 の 挿 入 と 7 箇 所 の 1 塩 基 置 換 があり これ が 4 アミノ 酸 の 挿 入 と 2 箇 所 の 1 アミノ 酸 の 置 換 に 影 響 していた 次 に y-21 株 と AQ-37 株 の NDD1 遺 伝 子 を 比 較 すると 2 箇 所 で 1 塩 基 置 換 があり 結 果 として 終 止 コドンに 変 化 していた AQ-37 株 では NDD1 タンパク 質 の 機 能 の 欠 失 が 細 胞 壁 構 造 等 に 影 響 し 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 得 たことが 強 く 示 唆 された しかし AQ-37 株 の 細 胞 壁 61

68 の 異 常 が NDD1 遺 伝 子 の 変 異 によってのみ 影 響 しているという 直 接 の 証 拠 はまだ 得 ら れていない これを 明 らかにするためには y-21 株 の NDD1 遺 伝 子 を 組 換 えにより 欠 損 させる あるいは AQ-37 株 の NDD1 遺 伝 子 に 置 換 し 同 様 の 表 現 型 を 示 すかどうか を 調 べる 必 要 があり まだ 課 題 は 残 されている 実 験 室 酵 母 を 用 いて 解 析 する 場 合 NDD1 遺 伝 子 が 生 育 に 必 須 なので 温 度 感 受 性 変 異 株 を 作 製 し 解 析 などの 工 夫 が 必 要 と なる そのような 系 では 様 々な NDD1 遺 伝 子 を 挿 入 したプラスミドを 利 用 すること で NDD1 タンパク 質 の 大 きさの 影 響 などを 明 らかにできる 可 能 性 がある また 関 連 する 遺 伝 子 の 欠 損 株 を 用 いて 細 胞 壁 解 析 を 行 うことで NDD1 遺 伝 子 と 細 胞 壁 形 成 と の 関 係 をより 詳 細 に 理 解 できる 可 能 性 がある さらに マクロファージ 活 性 化 機 構 の 理 解 のために AQ-37 株 以 外 の 2 株 (AP-57 と BD-40)について 変 異 部 位 を 同 定 することも 必 要 と 考 えられる 62

69 参 考 文 献 1. Rose MD, Novick P, Thomas JH, Botstein D, Fink GR (1987) A Saccharomyces cerevisiae genomic plasmid bank based on a centromere-containing shuttle vector. Gene 60: Burke D, Dawson D, Stearns T, 大 矢 禎 一, 川 向 誠, 仁 川 純 一, 板 垣 正, 河 野 享 子 (2002) 酵 母 遺 伝 子 実 験 マニュアル Methods in yeast genetics A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. 丸 善. 3. Benson DA, Cavanaugh M, Clark K, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Sayers EW (2013) GenBank. Nucleic Acids Res 41: D36 D Christianson TW, Sikorski RS, Dante M, Shero JH, Hieter P (1992) Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene 110: Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: Maneesri J, Azuma M, Sakai Y, Igarashi K, Matsumoto T, Fukuda H, Kondo A, Ooshima H (2005) Deletion of MCD4 involved in glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor synthesis leads to an increase in β-1,6-glucan level and a decrease in GPI-anchored protein and mannan levels in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng 99: Elorza MV, Rico H, Sentandreu R (1983) Calcofluor white alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. J Gen Microbiol. 129: Roncero C, Valdivieso MH, Ribas JC, Durán A (1988) Effect of calcofluor white on chitin synthases from Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 170: Valdivieso MH, Mol PC, Shaw JA, Cabib E, Durán A (1991) CAL1, a gene required for activity of chitin synthase 3 in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol 114: Harashima T, Heitman J (2002) The Gα protein Gpa2 controls yeast differentiation by interacting with kelch repeat proteins that mimic Gβ subunits. Mol Cell 10: Darieva Z, Bulmer R, Pic-Taylor A, Doris KS, Geymonat M, Sedgwick SG, Morgan BA, 63

70 Sharrocks AD (2006) Polo kinase controls cell-cycle-dependent transcription by targeting a coactivator protein. Nature 444: Loy CJ, Lydall D, Surana U (1999) NDD1, a high-dosage suppressor of cdc28-1n, is essential for expression of a subset of late-s-phase-specific genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 19: Giaever G, Chu AM, Ni L, Connelly C, Riles L, Véronneau S, Dow S, Lucau-Danila A, Anderson K, André B et al. (2002) Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature 418 : Lesage G, Bussey H (2006) Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 70: Harbison CT, Gordon DB, Lee TI, Rinaldi NJ, Macisaac KD, Danford TW, Hannett NM, Tagne JB, Reynolds DB, Yoo J et al. (2004) Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome. Nature 431: Lee HJ, Manke T, Bringas R, Vingron M (2008) Prioritization of gene regulatory interactions from large-scale modules in yeast. BMC Bioinformatics 9: Krause SA, Xu H, Gray JV (2008) The synthetic genetic network around PKC1 identifies novel modulators and components of protein kinase C signaling in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell 7: Krause SA, Gray JV (2009) The functional relationships underlying a synthetic genetic network. Commun Integr Biol 2: Uetz P, Giot L, Cagney G, Mansfield TA, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart P et al. (2000) A comprehensive analysis of protein protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature 403:

71 第 5 章 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 二 倍 体 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 取 得 とその 性 状 解 析 5.1 はじめに 第 3 章 では 実 用 パン 酵 母 の 変 異 処 理 により 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 変 異 株 を 3 種 取 得 した 取 得 変 異 株 の 高 い 活 性 化 能 の 理 由 の 一 つは マンナンの 減 少 によ る β-グルカンの 露 出 の 増 加 と 考 えられたが この 減 少 量 は mcd4δ ほど 極 端 ではなかっ た そのため 高 いマクロファージ 活 性 化 能 には 異 なる 因 子 も 関 与 している 可 能 性 が 考 えられた 第 4 章 では 取 得 株 の1つ AQ-37 株 の 変 異 遺 伝 子 および 変 異 部 位 を 同 定 した 結 果 として AQ-37 株 は NDD1 遺 伝 子 にナンセンス 変 異 が 生 じており NDD1 タンパク 質 の 機 能 の 欠 失 が 強 く 示 唆 された 第 3 章 で 得 られた 変 異 株 は 一 倍 体 株 で 実 用 的 には 遺 伝 的 に 安 定 な 二 倍 体 株 の 構 築 が 必 要 である そこで 第 5 章 では 変 異 部 位 が 明 らかになった AQ-37 株 をもとにして 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 持 つ 二 倍 体 実 用 パン 酵 母 の 取 得 を 試 みた また 取 得 株 がヒトの 免 疫 力 を 賦 活 化 するかを 検 討 するために ヒトの 免 疫 細 胞 である 末 梢 血 単 核 球 を 用 い それらの 活 性 化 能 を 調 べた さらに 酵 母 によるマクロファージ 活 性 化 機 構 に ついて 第 4 章 で 述 べた 細 胞 壁 マンナン 量 の 減 少 以 外 の 要 因 を 明 らかにするために 細 胞 壁 β-グルカンの 構 造 を 詳 細 に 解 析 した 5.2 材 料 と 方 法 菌 株 と 培 地 二 倍 体 株 の 作 製 のために 第 3 章 や 第 4 章 で 使 用 した 実 用 パン 酵 母 一 倍 体 株 AQ-37 株 (MATa ura3δ0)と y-21 株 に 加 えて オリエンタル 酵 母 工 業 ( 株 )から 提 供 された 栄 養 要 求 性 のない 一 倍 体 株 T-19(MATα)および T-21(MATa)を 使 用 した 二 倍 体 の 親 株 として オリエンタル 酵 母 工 業 ( 株 )から 提 供 された 実 用 パン 酵 母 二 倍 体 株 T-128 を 使 65

72 用 した この 株 は T-19 株 と T-21 株 の 接 合 によって 得 られたものである 酵 母 の 培 養 に は 第 3 章 と 第 4 章 で 用 いた YPD と YNB を 培 地 に 用 いた 固 体 培 地 には 2%の 寒 天 を 添 加 した 実 験 には 30 で 対 数 増 殖 期 (12 時 間 )まで 培 養 した 酵 母 を 用 いた 第 3 章 と 同 様 に 細 胞 壁 変 異 株 の 選 抜 には 0.02%の SDS を 含 む 1/5YPD 培 地 (YPD の 培 地 成 分 の 1/5 量 )を 用 いた プラスミドの 増 幅 は E. coli DH5α 株 (RBC Bioscience)を 用 いて 第 4 章 に 記 載 したように 行 った 二 倍 体 変 異 株 の 選 抜 目 的 とする 二 倍 体 株 は 次 のように 構 築 した まず AQ-37 株 の 変 異 を 持 つ 接 合 型 が α の 株 を 取 得 した[1] AQ-37 株 (MATa)と T-19 株 (MATα)を YPD 液 体 培 地 で 30 1 日 間 培 養 した 両 株 の 菌 数 を 同 程 度 にそろえ 新 たな YPD 培 地 中 で 混 合 し 30 で 12 時 間 接 触 させた 接 合 によって 生 じた 二 倍 体 酵 母 を 含 む 懸 濁 液 を 胞 子 形 成 培 地 (1% 酢 酸 カリウム 0.1% 酵 母 エキス 0.05%グルコース)を 用 いて 25 で 培 養 することに より 胞 子 を 形 成 させた 細 胞 を 遠 心 回 収 し 0.05 mg/ml の Zymolyase 100T 溶 液 に 懸 濁 させた 30 で 10 分 間 培 養 後 YPD 寒 天 培 地 上 に 広 げた 顕 微 鏡 とマニピュレータ を 用 いて 四 分 子 を 分 離 し 30 で 培 養 した 得 られたコロニーをウラシルのない YNB 培 地 で 培 養 した 生 育 した 株 について SDS 感 受 性 を 調 べた 1/5YPD 固 体 培 地 と 0.02% の SDS を 含 む 1/5YPD 固 体 培 地 上 で 培 養 し 一 倍 体 親 株 と 比 較 して SDS の 添 加 によっ て 生 育 が 遅 くなった 株 を 選 抜 した 選 抜 株 の 接 合 型 は 次 のように 判 断 した 選 抜 株 と 接 合 型 が 既 知 である X-2180A 株 (ATCC MATa)と X-2180B 株 (ATCC MATα)は YPD 液 体 培 地 を 用 い 30 で 一 晩 培 養 した 次 に YPD 培 地 を 含 む 24 穴 プレ ート 中 で 選 抜 株 と X-2180A または X-2180B を 混 合 し 30 で 4 時 間 静 置 培 養 した その 後 細 胞 の 性 的 凝 集 を 顕 微 鏡 下 で 観 察 し 接 合 型 が 既 知 のどちらの 株 で 凝 集 が 見 ら れるかによって 接 合 型 を 判 断 した 上 記 で 得 られた 株 と AQ-37 株 (MATa)を 用 い 再 度 接 合 を 行 った 接 合 操 作 を 行 った 後 細 胞 は YPD 固 体 培 地 上 に 塗 布 し 30 で 2 日 間 培 養 した 比 較 的 大 きなコロニー 66

73 を 選 抜 し 次 に 各 コロニーの 細 胞 を 顕 微 鏡 で 観 察 し 細 胞 のサイズが 一 倍 体 の 親 株 より 大 きい 株 を 二 倍 体 株 として 選 抜 した 最 終 的 には 接 合 型 が a と α の 一 倍 体 株 との 接 合 を 調 べ 接 合 現 象 が 観 察 されなかった 株 を 二 倍 体 株 として 選 んだ 選 んだ 二 倍 体 株 については 細 胞 壁 マンナンを 第 3 章 と 同 様 に ConA-FITC を 使 用 し 染 色 し 親 株 T-128 と 比 較 して 弱 い 蛍 光 を 示 す 株 すなわちマンナン 量 が 減 少 している 株 を 選 抜 した マクロファージ 活 性 化 能 の 評 価 マクロファージ 活 性 化 能 は 一 定 細 胞 数 または 一 定 乾 燥 重 量 の 酵 母 を 用 いた 活 性 化 能 の 両 方 で 評 価 した 一 定 細 胞 数 の 条 件 では 3 ml の YPD 液 体 培 地 を 含 む 試 験 管 で 対 数 増 殖 期 まで 培 養 した 酵 母 を 使 用 し 第 2 章 に 記 載 したように 測 定 した 一 定 重 量 の 条 件 では 第 3 章 に 記 載 したように 測 定 した 接 触 は 酵 母 の 最 終 濃 度 が 300 μg/ml マ クロファージが cells/ml で 行 った 増 殖 と CO 2 発 生 量 の 測 定 増 殖 能 は 第 3 章 に 記 載 したように 3 ml の YPD を 含 む 試 験 管 で 酵 母 を 培 養 し 濁 度 (OD 600 )の 経 時 変 化 から 評 価 した また 100 ml の YPD 培 地 を 含 む 坂 口 フラスコで 培 養 し 培 養 後 の 菌 体 の 乾 燥 重 量 からも 評 価 した 発 酵 能 は 第 3 章 と 同 様 に 評 価 した 20 ml の YPD を 用 い 酵 母 を 30 で 培 養 し 発 生 した CO 2 量 の 経 時 変 化 を 測 定 した NDD1 遺 伝 子 による 表 現 型 の 相 補 取 得 した 二 倍 体 変 異 株 は 酢 酸 リチウム 法 を 用 い YCP50-NDD1 で 形 質 転 換 した プラ スミド 導 入 にあたり 選 択 マーカーがなかったため 形 質 転 換 後 の 細 胞 全 てを 37 2 日 間 YNB 液 体 培 地 で 培 養 し その 一 部 を YNB 固 体 培 地 上 に 塗 布 した 37 2 日 間 培 養 し 得 られたコロニーのうち 比 較 的 大 きいものを 選 抜 した 次 に 顕 微 鏡 下 で AQ-37 67

74 株 のような 凝 集 が 観 察 されなかった 株 を 選 抜 した 最 終 的 には 5 -ATGGTAGTCGGTGAAGAGCCGTAT-3 (NDD1 遺 伝 子 の DNA 配 列 の 1 部 )と 5 -GCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAG-3 (YCP50 プラスミドの DNA 配 列 の 1 部 ) を 使 用 して YCP50-NDD1 上 の DNA 断 片 (1,421 bp)の 増 幅 によって 形 質 転 換 を 確 認 した 第 4 章 に 記 載 したように PCR(94 で 2 分 保 温 し 94 で 30 秒 58 で 45 秒 72 で 90 秒 を 30 サイクル)により 増 幅 した NDD1 遺 伝 子 の 導 入 が 細 胞 の 形 質 に 与 える 影 響 を 調 べるために 第 4 章 のように 様 々 な 表 現 型 (マンナンの 減 少 増 殖 能 の 低 下 高 温 や CFW に 対 する 感 受 性 マクロファ ージ 活 性 化 能 )を 調 べた マンナン 量 は ConA-FITC による 染 色 から 評 価 し 増 殖 能 は OD 600 の 値 の 経 時 変 化 から 評 価 した 温 度 感 受 性 は 37 での 生 育 から 評 価 し マクロフ ァージ 活 性 化 能 は 一 定 乾 燥 細 胞 重 量 の 酵 母 との 接 触 による 活 性 化 能 で 評 価 した 接 触 は 酵 母 の 最 終 濃 度 が 100 μg/ml マクロファージが cells/ml で 行 った パン 酵 母 か ら 抽 出 された β-グルカンである BB-Glucan(BBG;オリエンタル 酵 母 工 業 )[2 4]をコ ントロールとして 使 用 した ヒト 免 疫 細 胞 の 活 性 化 能 の 評 価 健 常 な 成 人 ドナーから 末 梢 血 を 採 取 した コンレイ(マリンクロット) フィコール(ア マシャム ファルマシア バイオテク)を 使 用 した 比 重 遠 心 法 により 末 梢 血 単 核 球 を 回 収 した[5] 得 られた 細 胞 は RPMI-1640 に 懸 濁 した 乾 燥 酵 母 は RPMI-1640 に 懸 濁 し 末 梢 血 単 核 球 の 懸 濁 液 と 混 合 した 接 触 は 酵 母 の 最 終 濃 度 を 100 μg/ml 末 梢 血 単 核 球 を cells/ml とした 4 時 間 静 置 後 遠 心 上 清 に 含 まれる TNF-α 量 を ELISA によって 測 定 した 細 胞 壁 解 析 酵 母 細 胞 壁 の 主 成 分 である β-グルカンを 構 成 するグルコースの 量 とマンナンを 構 成 するマンノース 量 は 第 3 章 で 記 載 したように 測 定 した 50 ml の YPD 液 体 培 地 で 培 養 68

75 した 酵 母 を 用 い 細 胞 壁 画 分 を 第 3 章 や 第 4 章 で 記 載 したように 回 収 し 得 られた 沈 澱 を 硫 酸 で 加 水 分 解 した グルコース 量 とマンノース 量 は RI 検 出 器 (RI704; ジーエル サイエンス)と UltronPS-80N カラム(300 8 mm; 信 和 化 工 )を 使 用 して HPLC で 測 定 した 溶 出 には 超 純 水 を 用 い 流 速 は 0.5 ml/min カラム 温 度 は 80 で 行 った β-グルカンの 活 性 化 能 は 次 のように 測 定 した まず アルカリ 不 溶 β-グルカンを 抽 出 した[6] 20 mg の 細 胞 壁 画 分 ( 乾 燥 重 量 )に 対 して 750 mm 水 酸 化 ナトリウムを 1 ml 加 えた 75 で 1 時 間 インキュベートし 遠 心 分 離 により 上 清 を 除 いた このアルカリ 処 理 を 合 計 3 回 行 った 水 酸 化 ナトリウムを 除 去 するため 得 られた 沈 澱 を 100 mm ト リス 塩 酸 緩 衝 液 (ph 7.5) 1 ml で 1 回 10 mm トリス 塩 酸 緩 衝 液 (ph 7.5)1 ml で 2 回 洗 浄 を 行 った 得 られた 沈 澱 をアルカリ 不 溶 β-グルカンとした マクロファージ 活 性 化 能 を 測 定 するために アルカリ 不 溶 β-グルカンを 凍 結 乾 燥 し 超 純 水 に 懸 濁 し 超 音 波 で 分 散 させた 抽 出 した β-グルカンは マウスマクロファージ RAW264.7 細 胞 と 混 合 し 活 性 化 能 の 評 価 に 用 いた 接 触 は β-グルカンの 最 終 濃 度 を 25 μg/ml マクロファージ を cells/ml とした 6 時 間 静 置 後 遠 心 上 清 を 得 そこに 含 まれる TNF-α 量 を 測 定 した β-グルカンの 糖 量 はフェノール 硫 酸 法 [7]で 次 のように 測 定 した 糖 溶 液 500 µl を 試 験 管 に 移 し そこに 5%フェノール 溶 液 500 µl を 加 えて 混 合 した 濃 硫 酸 2.5 ml を 加 え 10 分 放 置 後 に 27 の 水 浴 中 で 20 分 冷 却 した 490 nm における 吸 光 度 を 測 定 し グルコースの 標 準 溶 液 の 値 から 糖 量 を 計 算 した アルカリ 不 溶 β-グルカンの β-1,3-グルカン 量 と β-1,6-グルカン 量 は 次 のように 測 定 し た アルカリ 不 溶 β-グルカンに 900 μl の 10 mm トリス 塩 酸 緩 衝 液 (ph 7.5)を 加 えて 懸 濁 した この 懸 濁 液 を β-1,3-グルカナーゼ(zymolyase 100T; 生 化 学 工 業 )を 含 む 100 μl の 10 mm トリス 塩 酸 緩 衝 液 と 混 合 し 37 で 20 時 間 反 応 させた 遠 心 分 離 により 上 清 を 回 収 し 分 画 分 子 量 6,000 8,000 の 透 析 チューブ Spectra/Por DialysisMembrane (Spectrum Laboratories)を 使 用 して 透 析 外 液 に 蒸 留 水 を 用 い 24 時 間 透 析 した β-1,6- グルカンは 分 子 量 10,000 以 上 と 報 告 されているので[8 10] この 操 作 で β-1,3-グルカ ナーゼによる 分 解 物 と 分 けることができる 全 β-グルカン 量 は 透 析 前 の 糖 量 を 測 定 して 69

76 求 めた β-1,6-グルカン 量 は 透 析 後 の 透 析 内 液 の 糖 量 を 測 定 して 求 めた β-1,3-グルカン 量 は 全 β-グルカン 量 と β-1,6-グルカン 量 の 差 から 計 算 した 糖 量 はフェノール 硫 酸 法 で 測 定 した β-グルカンの 分 岐 構 造 について β-1,6-グルカンの 還 元 糖 量 は β-1,6-グルカンの 分 岐 の 数 を 反 映 すると 仮 定 した この 仮 定 のもとで β-1,3-グルカン 量 当 たりの 還 元 糖 量 は 分 岐 度 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカン 量 は β-1,6-グルカンの 長 さ( 重 合 度 )を 反 映 す ると 考 えた 還 元 糖 量 はソモギ ネルソン 法 [11]で 次 のように 測 定 した 糖 溶 液 500 µl を 試 験 管 に 移 し そこに 500 µl の 銅 試 薬 (2.4% 無 水 炭 酸 ナトリウム 1.2% 酒 石 酸 カ リウムナトリウム 0.4% 硫 酸 銅 1.6% 炭 酸 水 素 ナトリウム 18% 無 水 硫 酸 ナトリウム) を 加 えた 沸 騰 液 中 で 20 分 加 熱 し 水 浴 中 で 5 分 冷 却 した 500 µl のネルソン 試 薬 (5% モリブデン 酸 アンモニウム 8.4% 硫 酸 0.6%ヒ 酸 二 ナトリウム)を 加 えて 混 合 した さらに 水 2 ml を 加 えて 混 合 し 660 nm における 吸 光 度 を 測 定 した グルコース 標 準 溶 液 の 値 から 還 元 糖 量 を 計 算 した 5.3 結 果 と 考 察 高 いマクロファージ 活 性 化 能 を 有 する 二 倍 体 実 用 パン 酵 母 変 異 株 の 選 抜 目 的 とする 株 を 得 るために AQ-37 株 を T-19 株 と 接 合 させ 生 じた 二 倍 体 株 から 胞 子 を 分 離 した 実 用 には 栄 養 要 求 性 のない 株 が 適 しているので ウラシルのない YNB で 生 育 する 株 を 選 抜 した 選 抜 株 について AQ-37 株 と 同 様 の SDS 感 受 性 について 調 べた 1/5YPD 固 体 培 地 と 0.02%の SDS を 含 む 1/5YPD 固 体 培 地 上 で 生 育 が 遅 くなっ た 20 種 の 変 異 株 ( 小 さいコロニー)を 取 得 した これらの 接 合 型 を 調 べた 結 果 MATa が 6 株 で MATα が 14 株 だった さらに AQ-37 株 (MATa)を 含 めた 一 倍 体 株 間 で 再 度 接 合 を 行 い 一 倍 体 株 との 接 合 が 起 こらない 70 種 の 二 倍 体 株 を 獲 得 した これら 二 倍 体 株 からさらに 選 抜 を 進 めるために 細 胞 壁 マンナンを ConA-FITC を 用 いて 染 色 した( 図 5.1) その 結 果 二 倍 体 の 親 株 T-128 と 比 較 して 弱 い 蛍 光 すなわちマ 70

77 ンナンの 減 少 を 示 す 二 倍 体 を 3 株 取 得 した(BQ-10 BQ-48 BQ-55) ただし 極 端 な マンナンの 減 少 は 観 察 されず 目 視 による 観 察 ではその 判 断 は 難 しかった そのため こ こでは 少 なくとも 3 回 染 色 を 行 いマンナンの 減 少 に 関 して 再 現 性 が 得 られた 株 である これら 3 株 のみを 選 抜 した 次 に 細 胞 形 態 を 比 較 した 元 の 一 倍 体 AQ-37 株 では 細 胞 サイズは 親 株 y-21 より 大 きく 明 らかな 偽 菌 糸 形 態 をとる 傾 向 が 観 察 された( 図 3.1) しかし 得 られた 3 種 の 二 倍 体 変 異 株 では そのような 偽 菌 糸 形 態 は 観 察 されなかった ただし BQ-55 株 で はわずかに 細 胞 が 連 なる 傾 向 が 見 られた 形 態 的 特 徴 は 細 胞 の 倍 数 性 によって 変 化 する かもしれない 実 際 に 細 胞 が 窒 素 源 の 枯 渇 条 件 で 培 養 されたとき それら 形 態 は 倍 数 性 によって 異 なることが 報 告 されている[12] 従 って 一 倍 体 の AQ-37 株 と 同 じ 変 異 を 持 った 二 倍 体 変 異 株 で AQ-37 株 と 形 態 的 特 徴 が 異 なることは 十 分 に 考 えられる 図 5.1 取 得 した 二 倍 体 変 異 株 の ConA-FITC によるマンナン 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した 71

78 次 に 得 られた 3 種 の 変 異 株 (BQ-10 BQ-48 BQ-55)について 細 胞 接 触 による マクロファージ 活 性 化 を TNF-α 分 泌 量 を 指 標 として 調 べた( 図 5.2 A) まず 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 による TNF-α 分 泌 量 で 評 価 した コントロールとして 用 いた T-128 株 自 身 でも TNF-α の 分 泌 が 見 られたが 3 株 の 変 異 株 (BQ-10 BQ-48 BQ-55)では 全 てで T-128 株 に 比 べ TNF-α 分 泌 量 が 高 く 培 地 を 引 いた 値 で 活 性 化 能 を 評 価 すると いずれも 2 倍 以 上 高 かった また BQ-55 株 の 分 泌 量 は 3 種 の 変 異 株 の 中 で 最 も 高 く 約 7 倍 の 活 性 化 能 だった 一 定 乾 燥 重 量 の 酵 母 の 活 性 化 能 についても 同 様 に 測 定 した その 結 果 を 図 5.2 B に 示 す 一 定 細 胞 数 の 結 果 と 同 様 に 3 種 の 変 異 株 では T-128 株 よ りも 2 倍 以 上 高 い 活 性 化 能 を 示 し BQ-55 株 では 取 得 株 の 中 で 最 も 高 く 約 6 倍 の 活 性 化 能 だった 細 胞 数 と 乾 燥 重 量 の 条 件 での 結 果 を 総 合 して 取 得 した BQ-10 株 BQ-48 株 BQ-55 株 は 高 いマウスマクロファージ 活 性 化 能 を 有 すると 判 断 した 72

79 図 5.2 取 得 した 二 倍 体 変 異 株 のマクロファージ 活 性 化 能 酵 母 とマクロファージを 6 時 間 接 触 させ 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した LPS (50 ng/ml)と 培 地 (RPMI-1640)はコントロールとして 使 用 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 または 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A: 一 定 細 胞 数 の 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 ( cells/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 接 触 させた B: 一 定 乾 燥 重 量 の 73

80 酵 母 との 接 触 によりマクロファージが 分 泌 した TNF-α 量 を 示 す 最 終 濃 度 で 酵 母 (300 μg/ml) とマクロファージ( cells/ml)を 接 触 させた 増 殖 能 と 発 酵 能 の 評 価 AQ-37 株 は 一 倍 体 の 親 株 y-21 よりも 増 殖 能 が 低 い( 図 3.5 図 3.6)ため 選 抜 した 二 倍 体 変 異 株 についても 液 体 培 地 での 増 殖 能 を 調 べた 濁 度 による 測 定 では BQ-10 株 と BQ-48 株 の 増 殖 能 は T-128 株 より 少 し 低 く BQ-55 株 では BQ-10 株 と BQ-48 株 より も 低 いことが 分 かった( 図 5.3 A) 100 ml の YPD 培 地 で 24 時 間 培 養 後 の 乾 燥 菌 体 重 量 を 測 定 した 結 果 BQ-55 株 の 重 量 は T-128 株 の 85% 程 度 で BQ-10 株 と BQ-48 株 の 重 量 は T-128 株 の 90% 程 度 だった( 図 5.3 B) これら 3 株 で 得 られる 菌 体 量 は AQ-37 株 を 同 じ 条 件 で 培 養 した 時 に 得 られた 菌 体 量 の 2 倍 以 上 で 二 倍 体 にすることで 多 くの 菌 体 が 得 られることが 分 かった 濁 度 と 乾 燥 重 量 の 測 定 で 結 果 が 異 なったのは 培 養 方 法 の 違 いによると 考 えられた 74

81 図 5.3 取 得 変 異 株 の 増 殖 能 の 評 価 A: 濁 度 による 評 価 各 シンボルは T-128( ) BQ-10( ) BQ-48( ) BQ-55( )を 示 す B: 菌 体 重 量 による 評 価 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す ま 75

82 た エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 次 に 取 得 変 異 株 の 発 酵 能 を CO 2 発 生 量 から 調 べた 図 5.4 に 示 す 結 果 から BQ-10 株 BQ-48 株 BQ-55 株 は T-128 株 とほぼ 同 等 の CO 2 発 生 量 を 示 し 十 分 な 発 酵 能 を 持 つことが 示 唆 された これら 取 得 3 株 の 6 時 間 後 の CO 2 発 生 量 は AQ-37 株 ( 図 3.7)の 1.5 倍 以 上 だった 以 上 の 結 果 から 最 もマクロファージ 活 性 化 能 の 高 い BQ-55 株 は 増 殖 能 や 発 酵 能 に 大 きな 問 題 となる 点 は 無 く 免 疫 細 胞 を 活 性 化 できるパン 酵 母 として 有 望 だと 判 断 し た これ 以 降 の 実 験 は BQ-55 株 について 解 析 を 進 めた 図 5.4 取 得 変 異 株 の CO 2 発 生 量 初 期 OD 600 を 0.1 とし YPD 培 地 中 で CO 2 発 生 量 を 測 定 した 各 シンボルは T-128( ) BQ-10 ( ) BQ-48( ) BQ-55( )を 示 す 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 76

83 5.3.3 NDD1 遺 伝 子 による 表 現 型 の 相 補 BQ-55 株 は AQ-37 株 をもとに 構 築 された 第 4 章 で 示 したように AQ-37 株 は NDD1 遺 伝 子 によって 様 々な 表 現 型 が 相 補 された そのため YCP50-NDD1 を 用 いた 形 質 転 換 によって BQ-55 株 の 表 現 型 が NDD1 遺 伝 子 により 相 補 されるかについて 調 べた こ のプラスミドは YCP50 にゲノム 断 片 が 挿 入 されており YCP50 自 身 はプラスミドの 脱 落 が 少 ないタイプの 1 コピープラスミドである BQ-55 株 には 栄 養 要 求 性 がなく 遺 伝 子 導 入 に 使 用 する 選 択 マーカーがない そのため 形 質 転 換 株 の 取 得 は AQ-37 株 と BQ-55 株 の 共 通 の 性 質 である 高 温 感 受 性 と 細 胞 形 態 を 指 標 に 行 った BQ-55 株 は 高 温 感 受 性 を 持 ち( 図 5.5 A) 細 胞 がわずかに 連 なる 傾 向 が 観 察 された AQ-37 株 も 高 温 感 受 性 や 細 胞 形 態 の 変 化 が 見 られ これらは NDD1 遺 伝 子 によって 相 補 された( 図 ) そのため BQ-55 株 の 高 温 感 受 性 や 細 胞 形 態 も NDD1 遺 伝 子 によって 相 補 されると 考 えられた YCP50-NDD1 で BQ-55 株 を 形 質 転 換 後 YNB 培 地 を 用 い 高 温 (37 ) 条 件 で 培 養 し た 比 較 的 速 く 増 殖 したと 考 えられる 大 きいコロニーを 選 抜 した 次 に 選 抜 株 の 細 胞 形 態 を 顕 微 鏡 下 で 観 察 した BQ-55 株 で 見 られた 細 胞 がわずかに 連 なる 傾 向 が 親 株 T-128 のように 見 られなくなった 株 を 選 抜 した 最 終 的 な 形 質 転 換 の 確 認 は PCR によ るプラスミドの 一 部 配 列 の 増 幅 から 行 った 増 幅 を 確 認 した 株 を 形 質 転 換 株 として 表 現 型 ( 感 受 性 増 殖 マンナン マクロファージ 活 性 化 能 )を 相 補 するかを 確 認 した その 結 果 高 温 や CFW に 対 する 感 受 性 は 寒 天 培 地 上 での 生 育 結 果 から NDD1 遺 伝 子 により 相 補 されることが 明 らかになった( 図 5.5 A) また 増 殖 能 の 低 下 も 部 分 的 に 回 復 していた( 図 5.5 B) さらに BQ-55 株 のマンナンの 減 少 についても 遺 伝 子 導 入 に より 相 補 された( 図 5.5 C) 結 果 は 示 さないが 形 態 についても 相 補 されることを 確 認 した NDD1 遺 伝 子 による 細 胞 壁 成 分 の 相 補 を 確 認 したため マクロファージ 活 性 化 能 についても 調 べた その 結 果 BQ-55 株 の 高 いマクロファージ 活 性 化 能 についても NDD1 遺 伝 子 により 相 補 された( 図 5.6) 77

84 以 上 より BQ-55 株 の 形 質 に 対 する NDD1 遺 伝 子 導 入 による 影 響 は AQ-37 株 で 検 討 された 結 果 と 同 様 の 傾 向 を 示 すことが 明 らかとなった ただし NDD1 遺 伝 子 導 入 で は 完 全 には 表 現 型 が 相 補 されていないため NDD1 遺 伝 子 以 外 に 変 異 遺 伝 子 が 存 在 し 影 響 している 可 能 性 も 考 えられる 78

85 図 5.5 YCP50-NDD1 による 様 々な 表 現 型 の 相 補 A: 温 度 や CFW に 対 する 感 受 性 試 験 一 定 濃 度 に 調 製 した 酵 母 懸 濁 液 を 1 倍 10 倍 100 倍 1000 倍 に 希 釈 し 左 から 順 にスポットした YPD 固 体 培 地 で 30 または 37 2 日 培 養 した B: 濁 度 による 増 殖 能 の 評 価 各 シンボルは T-128( ) BQ-55( ) BQ-55+YCP50-NDD1( ) を 示 す 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す C:ConA-FITC によるマンナン 染 色 スケールバーは 10 μm を 示 す 写 真 は 79

86 同 じ 露 出 時 間 で 撮 影 した 図 5.6 YCP50-NDD1 によるマクロファージ 活 性 化 能 の 相 補 酵 母 (100 μg/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 6 時 間 接 触 させ マクロファージが 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した LPS(100 ng/ml)と BBG(100 μg/ml)と 培 地 (RPMI-1640)はコントロールとして 使 用 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 また は 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 酵 母 によるヒト 免 疫 細 胞 の 活 性 化 これまでの 実 験 では マウスのマクロファージの 活 性 化 について 調 べてきた 文 献 か ら S. cerevisiae から 抽 出 された β-グルカンは ヒト 末 梢 血 から 分 離 した 末 梢 血 単 核 球 を 活 性 化 することが 報 告 されている[13] そこで ここではヒトの 免 疫 細 胞 に 対 する BQ-55 株 の 活 性 化 能 について 調 べた 酵 母 細 胞 の 接 触 による 末 梢 血 単 核 球 の 活 性 化 を 評 価 するために これまでと 同 様 に 免 疫 担 当 細 胞 から 分 泌 された TNF-α 量 を 調 べた 図 5.7 に 示 すように BQ-55 株 との 接 触 では T-128 株 より TNF-α の 分 泌 量 が 高 く 2 倍 以 上 80

87 だった それゆえ BQ-55 株 はヒトの 免 疫 力 をより 強 く 賦 活 化 できる 材 料 であることが 期 待 された また この 変 異 により 上 昇 した 活 性 化 能 は マウスのマクロファージで 観 察 された 場 合 と 同 様 に NDD1 遺 伝 子 導 入 によって 相 補 された( 図 5.7) 図 5.7 BQ-55 株 のヒト 免 疫 細 胞 活 性 化 能 酵 母 (100 μg/ml)とヒト 末 梢 血 から 分 離 した 単 核 球 ( cells/ml)を 4 時 間 接 触 させ 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した LPS(1 μg/ml)と 培 地 (RPMI-1640)はコン トロールとして 使 用 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 4 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す ま た エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 細 胞 壁 解 析 免 疫 担 当 細 胞 を 高 く 活 性 化 する 要 因 を 明 らかにするために β-グルカンを 構 成 するグ ルコースの 量 に 対 するマンナンを 構 成 するマンノースの 量 の 比 を 調 べた 細 胞 壁 画 分 を 81

88 硫 酸 で 加 水 分 解 し グルコース 量 とマンノース 量 を HPLC で 測 定 した BQ-55 株 の 細 胞 壁 重 量 当 たりのグルコース 量 は T-128 株 とほぼ 同 等 だったが BQ-55 株 の 細 胞 壁 重 量 当 たりのマンノース 量 は T-128 株 と 比 較 して 低 かった( 図 5.8) この 傾 向 はマンナン 染 色 の 結 果 に 一 致 した それゆえ グルコース 量 に 対 するマンノース 量 の 比 は 減 少 した BQ-55 株 では β-グルカンの 表 面 への 露 出 度 が 増 加 したことが 示 唆 される 次 に BQ-10 株 や BQ-48 株 でも 同 様 の 結 果 が 得 られるかを 調 べた それらの 株 でもグルコース 量 は T-128 株 とほぼ 同 等 で マンノース 量 は T-128 株 と 比 較 して 低 いためグルコース 量 に 対 するマンノース 量 の 比 は 減 少 した また これらの 結 果 は AQ-37 株 と 同 様 だった( 図 3.6) BQ-10 株 のグルコース 量 に 対 するマンノース 量 は BQ-48 株 や BQ-55 株 ほど 減 少 していなかった これが BQ-48 株 や BQ-55 株 より BQ-10 株 の 方 が 活 性 化 能 の 低 い 理 由 であると 考 えられる 82

89 図 5.8 細 胞 壁 のグルコース 量 とマンノース 量 細 胞 壁 を 硫 酸 加 水 分 解 しグルコース 量 とマンノース 量 を HPLC で 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A:グルコー ス(β-グルカン) 量 B:マンノース(マンナン) 量 83

90 BQ-55 株 や AQ-37 株 では グルコースに 対 するマンノースの 比 は 減 少 したが それ ら 減 少 量 は 先 行 研 究 で 観 察 された mcd4δ での 減 少 に 比 べると 極 端 ではなかった[14] そのため 免 疫 担 当 細 胞 の 活 性 化 要 因 は 他 にも 存 在 する 可 能 性 もあると 考 えた ここで は 免 疫 細 胞 を 活 性 化 する β-グルカンに 注 目 し アルカリ 不 溶 β-グルカンを BQ-55 株 から 抽 出 し マウスマクロファージ 活 性 化 能 を 評 価 した その 結 果 BQ-55 株 から 抽 出 された β-グルカンでは 分 泌 された TNF-α 量 が T-128 株 の β-グルカンより 高 かった( 図 5.9) 加 えて この 高 いマクロファージ 活 性 化 能 は NDD1 遺 伝 子 によって 相 補 された 上 記 の 結 果 から BQ-55 株 の β-グルカンの 構 造 が T-128 株 と 異 なっていることが 強 く 示 唆 された 図 5.9 BQ-55 株 から 抽 出 した β-グルカンのマクロファージ 活 性 化 能 抽 出 した β-グルカン( 糖 濃 度 25 μg/ml)とマクロファージ( cells/ml)を 6 時 間 接 触 さ せ 培 地 中 に 分 泌 した TNF-α 量 を ELISA で 測 定 した LPS(100 ng/ml)と 培 地 (RPMI-1640) はコントロールとして 使 用 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 2 または 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す 84

91 次 に β-グルカンの 構 造 を 詳 細 に 調 べるために 抽 出 したアルカリ 不 溶 β-グルカンの β-1,3-グルカン 量 と β-1,6-グルカン 量 を 測 定 した BQ-55 株 では 細 胞 壁 重 量 当 たりの β-1,3-グルカン 量 は T-128 株 より 高 かったが T-128 株 との 間 に 有 意 な 差 は 観 察 されな かった( 図 5.10 A) 一 方 BQ-55 株 の 細 胞 壁 重 量 当 たりの β-1,6-グルカン 量 は T-128 株 と 比 較 して 高 かった( 図 5.10 B) BQ-55 株 の β-1,3-グルカン 量 と β-1,6-グルカン 量 の 比 は T-128 株 と 変 わらずおよそ 10:3 であった この 値 は 文 献 情 報 [9]と 同 様 であっ た 次 に BQ-10 株 や BQ-48 株 についても 調 べた BQ-10 株 や BQ-48 株 において β-1,3- グルカン 量 と β-1,6-グルカン 量 及 びその 比 は 全 て T-128 株 とほぼ 同 等 で 有 意 差 は 見 られ なかった マクロファージ 活 性 能 の 高 い BQ-10 株 と BQ-48 株 で BQ-55 株 と 共 通 の 結 果 が 観 察 されなかったため β-グルカンを 構 成 する β-1,3-グルカンと β-1,6-グルカンの 量 や 比 は 直 接 的 には 今 回 の 高 いマクロファージ 活 性 能 とは 関 係 ないことが 示 唆 された 85

92 図 5.10 細 胞 壁 の β-1,3-グルカン 量 と β-1,6-グルカン 量 に 示 した 方 法 により アルカリ 不 溶 β-グルカンに 含 まれる β-1,3-グルカン 量 と β-1,6-グル カン 量 を 定 量 した 糖 量 はフェノール 硫 酸 法 で 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A:β-1,3-グルカン 量 B:β-1,6- グルカン 量 86

93 β-グルカンの 分 岐 構 造 を 調 べるために β-1,3-グルカナーゼ 処 理 後 により 得 られた β-1,6-グルカンを 解 析 した β-1,6-グルカンの 還 元 糖 量 が β-1,6-グルカンの 分 岐 数 を 反 映 すると 仮 定 した このような 仮 定 の 下 では β-1,3-グルカン 量 当 たりの 還 元 糖 量 は β-グ ルカンの 分 岐 度 を 反 映 し 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカン 量 は 分 岐 β-1,6-グルカンの 長 さ( 重 合 度 )を 反 映 すると 考 えた ソモギ ネルソン 法 で 還 元 糖 量 を 測 定 し 結 果 から 計 算 した BQ-55 株 では β-1,3-グルカン 量 当 たりの 還 元 糖 量 は T-128 株 と 比 較 して 低 かった( 図 5.11 A) 一 方 で BQ-55 株 の 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカンでは T-128 株 に 比 べ 高 か った( 図 5.11 B) 次 に BQ-10 株 や BQ-48 株 についても 調 べた BQ-10 株 でも β-1,3- グルカン 量 当 たりの 還 元 糖 量 は T-128 株 と 比 較 して 低 かった しかし BQ-48 株 では T-128 株 とほぼ 同 等 だった それゆえ 3 株 の 変 異 株 で 共 通 の 結 果 は 観 察 できなかった 得 られた 値 は 文 献 情 報 に 近 かった[15]が 今 後 NMR などを 用 いた 厳 密 な 測 定 を 行 う 必 要 がある 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカンでは T-128 株 に 比 べ 高 く 3 株 (BQ-10 BQ-48 BQ-55)で 共 通 の 結 果 が 観 察 できた 得 られた 値 は 文 献 情 報 に 近 かった[8 10] が 今 後 MS などを 用 いた 厳 密 な 測 定 を 行 う 必 要 がある 結 果 は 示 さないが これらの 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカンの 増 加 は AQ-37 株 とその 親 株 の y-21 株 の 間 でも mcd4δ とその 親 株 の WT(BY4741 株 )の 間 でも 観 察 された これらの 結 果 は β-グル カンの 長 い β-1,6-グルカンの 分 岐 は マクロファージを 活 性 化 する 能 力 を 高 めることが 示 唆 された BQ-55 株 の 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカンの 値 は BQ-48 株 よりも 少 し 高 い これが BQ-55 株 の 方 が BQ-48 株 よりマクロファージ 活 性 化 能 が 高 い 要 因 の 可 能 性 がある 87

94 図 5.11 細 胞 壁 β-グルカンの 分 岐 構 造 還 元 糖 量 はソモギ ネルソン 法 で 測 定 した 結 果 は 異 なる 培 養 の 酵 母 を 用 いた 3 回 の 実 験 の 平 均 値 を 示 す また エラーバーは 標 準 偏 差 を 示 す A:β-1,3-グルカン 量 当 たりの 還 元 糖 量 B: 還 元 糖 量 当 たりの β-1,6-グルカン 量 88

95 分 岐 β-1,6-グルカンの 長 さとマクロファージ 活 性 化 能 との 関 係 については 次 のように 考 えた マンナンタンパク 質 は 主 として GPI アンカーを 介 して β-1,6-グルカンと 結 合 し 主 鎖 である β-1,3-グルカンに 固 定 されている[10] それゆえ β-1,6-グルカンは 細 胞 壁 最 外 層 のマンナンタンパク 質 を 固 定 する 足 場 として 機 能 する β-1,6-グルカンが 長 いと 細 胞 壁 にスペースが 生 じやすいと 考 えられる そのスペースが β-1,3-グルカンと 免 疫 細 胞 表 面 上 の 受 容 体 の 間 の 接 触 を 促 進 するかもしれない 従 って マンナンタンパク 質 の 減 少 による β-グルカンの 露 出 に 加 えて β-グルカン 中 の β-1,6-グルカンの 長 さの 増 加 もマクロファージ 活 性 化 能 に 重 要 かもしれない 従 って 変 異 株 の 細 胞 壁 構 造 の 活 性 化 への 影 響 は 次 のように 考 えた( 図 5.12 ) マンナンタンパク 質 が 減 少 した 変 異 株 ( 図 5.12 B)や β-1,6-グルカンの 長 さが 増 加 した 変 異 株 ( 図 5.12 C)は 高 い 活 性 化 能 を 有 すると 考 えられる さらに それら 両 方 を 併 せ 持 つ 変 異 株 はより 活 性 化 能 が 強 くなると 考 えられる( 図 5.12 D) また 図 5.9 の 結 果 から β-グルカンの 構 造 が β-グルカン 自 体 の 活 性 化 能 に 影 響 していると 考 えられる 89

96 90

97 図 5.12 マンナンタンパク 質 の 減 少 および β-1,6-グルカンの 長 さの 増 加 がマクロファージの 活 性 化 機 構 に 与 える 影 響 A: 野 生 株 B:マンナンタンパク 質 が 減 少 した 変 異 株 C:β-1,6-グルカンの 長 さが 増 加 した 変 異 株 D:A と B の 両 方 の 性 質 を 持 つ 変 異 株 マンナンタンパク 質 の 減 少 や β-1,6-グルカンの 長 さの 増 加 により 細 胞 壁 にスペースを 生 じマクロファージ 細 胞 表 面 の 受 容 体 と 接 触 しやすくな り 高 い 活 性 化 能 を 獲 得 したと 考 えられる 91