平成 23 年度修士論文白色腐朽菌を利用した染料の生分解 Biodegradation of dyes using white-rot fungi. 高知工科大学大学院工学研究科基盤工学専攻物質環境システム工学コース堀澤研究室修士 2 年加藤紘將 1

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かずまさかりこめ
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1 平成 23 年度修士論文白色腐朽菌を利用した染料の生分解 Biodegradation of dyes using white-rot fungi. 高知工科大学大学院工学研究科基盤工学専攻物質環境システム工学コース堀澤研究室修士 2 年加藤紘將 1

2 目次 1. 概要 2. 緒言 3. 実験方法 3-1. 供試菌 3-2. 分解対象 3-3. 菌体の培養方法 3-4. それぞれの実験における染料除去率の測定方法 4. 結果と考察 5. 結論 6. 参考文献 7. 謝辞 2

3 1. 概要白色腐朽菌は木材を白色に腐朽させる担子菌である白色腐朽菌が木材を腐朽させる過程で分泌するリグニン分解酵素は基質特異性が低いという特徴があるこのためリグニンと部分構造が類似するダイオキシン類に代表される難分解性化合物の分解が可能である染料 ( インジゴコンゴーレッドなど ) もまた難分解性である本研究では白色腐朽菌を用いて染料を生分解処理することを考えたこれまでの研究で担体を用いて菌体を固定化することによりリグニン分解酵素の生産性が増加することがわかっているしかし白色腐朽菌染料分解は菌糸への吸着培養器内の他材料への吸着 phの変化による分解物理化学的要因による分解など菌が生産する分泌するリグニン分解酵素による貢献度にはまだ議論の余地があるまた生物的な分解のために物理的処理に比べて処理速度が遅く効率が悪いなどの問題点が挙げられるそこで本研究は白色腐朽菌が分泌するリグニン分解酵素を利用しより効率的な染料の生分解を目的とした分解対象の染料をレマゾールブリリアントブルー R(RBBR 0.4 g/l ( M)) クリスタルバイオレット(0.005 g/l ( M)) コンゴーレッド(0.1 g/l ( M)) p-( フェニルアゾ ) フェノール (0.05 g/l ( M)) の4 種類とした液体培養の際に菌体が空気面への接触の有無での影響を比較検討菌体外酵素による染料分解の検討白色腐朽菌の培養の際に培養液上面の面積 ( 気液接触面積 ) の染料分解に対しての影響の検討そして菌体成長後に染料を添加すること最後に染料分解後の培養液の分析を行った菌体外酵素による染料の分解では菌体を7 日間前培養した培養液を粗酵素液として染料を含む水溶液に毎日 1.5mlずつ添加した菌体の培養の際に気液接触面積の違いによる染料分解では気液接触面積 20 cm 2 と75 cm 2 の培養容器を用い染料を加えた培養液に菌を接種したそして菌体成長後の染料添加と染料分解後の反応液の分析では 75 cm 2 の培養容器を用い菌接種 7 日後に培養液に染料を無菌的に加えたすべて25 の暗所で静置培養とした培養液中の染料の測定方法はそれぞれの上澄み液を4 倍希釈し吸光度 (RBBR クリスタルバイオレットが593 nm コンゴーレッドが497 nm p-( フェニルアゾ ) フェノールが390 nm) によって残存染料濃度を測定した菌体の培養において空気面に接触させて培養を行ったほうが接触していないものと比較すると RBBR とクリスタルバイオレットでは前者の条件で染料分解が進んだ粗酵素液による染料の分解においてカワラタケは RBBR を 90% 以上除去したまたでは約 20% ヒラタケでは約 60% の除去率だったクリスタルバイオレットの分解ではカワラタケで約 70% ヒラタケで約 45% の除去率を示したコンゴーレッドの分解ではカワラタケヒラタケで約 40% で約 30% を示し白色腐朽菌のリグニン分解酵素によって染料が分解されていることが示唆された気液接触面積の違いによるに白色腐朽菌の培養での RBBR の分解はカワラタケアラゲ 3

4 カワラタケの 2 種類で気液接触面積が大きいほうが 4 日目から除去速度が上がり最終的な除去率も高いことが分かった一方クリスタルバイオレットの分解では最終的な除去率はカワラタケの 2 種類では差がなかったどの供試菌においても気液接触面積の小さい培養器のほうが除去速度が大きかった菌体成長後の染料添加では RBBR においてはカワラタケで染料添加から 1 日で約 90% の除去率を示しすべての菌体で最終的に除去率が 90% を超えたコンゴーレッドではカワラタケが約 90% ヒラタケはそれぞれ約 75% の除去率を示したコンゴーレッドは以前の実験で染料を混合した液体培地での培養では菌が増殖できず死滅したが菌体の成長後に添加することによって分解が可能となった p-( フェニルアゾ ) フェノールではで約 70% カワラタケで約 55% ヒラタケで約 30% の除去率を示しクリスタルバイオレットではすべての供試菌で 90% を超える除去率を示した染料分解後の培養液の可視紫外吸収スペクトルを測定したところすべての染料において最も高いピークが消失したしかし RBBR においては 593nm のピークが分解後では 300nm 付近にシフトし色も黄色のような色に変化したリグニン分解酵素によって分解された染料がどこまでの化学構造に分解されているかまだ明らかではないため今後詳細な分析が必要である 4

2. 緒言担子菌である木材腐朽菌には大きく2つに分類される木材中のセルロースのみを分解し木材を褐色に腐朽させる褐色腐朽菌とセルロースのみだけでなくリグニンを分解して木材を白色に腐朽させる白色腐朽菌である

複数の環状構造を持つ難分解性化合物を分解する事が可能である染料も複数の環状構造を持つ難分解性化合物である古代より染料としては様々な動物や植物から抽出した天然色素が用いられてきた植物由来の染料が種類としては最も多くアカネアイ

1856 年にウィリアムパーキンにより最初の合成染料が作られて以来現在では数百種が工業生産されており使用されている染料のほとんどが合成染料である ( 図 1) 化学構造による分類ではアゾ染料 ( コンゴーレッドオレンジ Ⅱ な A B ど )

5 2. 緒言担子菌である木材腐朽菌には大きく2つに分類される木材中のセルロースのみを分解し木材を褐色に腐朽させる褐色腐朽菌とセルロースのみだけでなくリグニンを分解して木材を白色に腐朽させる白色腐朽菌である白色腐朽菌が木材を腐朽させる過程で分泌するリグニン分解酵素 ( マンガンペルオキシダーゼリグニンペルオキシダーゼラッカーゼなど ) は基質特異性が低いという特徴がありリグニンと部分構造が類似するダイオキシン類などに代表される複数の環状構造を持つ難分解性化合物を分解する事が可能である染料も複数の環状構造を持つ難分解性化合物である古代より染料としては様々な動物や植物から抽出した天然色素が用いられてきた植物由来の染料が種類としては最も多くアカネアイウコンなどが古代から利用されている動物由来のものとしてはイボニシ等から得られる貝紫やエンジムシから得られるコチニールがあるこれらの染料の多くは大量の天然物を処理してもわずかな量しか得ることが出来ないため希尐品であり使用が制限されてきたしかし 1856 年にウィリアムパーキンにより最初の合成染料が作られて以来現在では数百種が工業生産されており使用されている染料のほとんどが合成染料である ( 図 1) 化学構造による分類ではアゾ染料 ( コンゴーレッドオレンジ Ⅱ な A B ど ) やアントラキノン染料 ( スレンレッド 5GK スレンブラウン R スレンブリリアントグリーン B など ) インジゴイド染料 ( インジゴ白藍など ) などの染料があげられる染料は環状の構造を持つ化学的に安定 C 図 1. 工業生産の染料 (A; インジゴ B; Pigment Yellow 65 C; タートラジン ) な構造であるため分解さ 5

6 れにくいという特徴をもっている染料工場の排水処理槽にはこのような環状構造の染料が複数混在していると考えられる処理槽中の染料除去方法として従来は活性炭による吸着沈殿による除去光によって結合を開裂させる光分解化学物質を使用する環状構造の開裂分解などの物理的な処理によって除去されている本研究では工場排水の処理槽で生物である白色腐朽菌による染料の生分解を目指す生物を利用する方法の利点は生物的分解のため環境負荷が尐なく常温常圧にて除去できることであるまた小規模な工場などでは物理的処理の際のエネルギーやコストの準備が困難な場合があるため生物的な処理を採用する意義があるしかし白色腐朽菌を用いる生物処理では染料分解におけるリグニン分解酵素が貢献しているのかどうかまた物理的処理に比べて処理速度が小さいことをどう改善するかなどの問題点が挙げられる従って本研究では染料がリグニン分解酵素による分解であるかどうかの検証やより効率的な染料分解の条件を検討することにした一方で我々はこれまでに担子菌の液体培養時に菌糸を担持させる担体を用いることでその種類や有無によってリグニン分解酵素セルロース分解酵素の生産量に違いがみられる (1) ことや担体を用いて菌体を培養することで菌体の色素除去能力が増加すること (2) を見出してきたそこで本研究では最終的な目標として処理槽での染料分解システムを想定しそのための基礎的なデータを得るため液体培地で培養した白色腐朽菌と菌体から分泌されたリグニン分解酵素のみによる染料分解力を比較し培養条件の影響を評価した 6

Pleurotus ostreatus NBRC6515 の3 種の白色腐朽菌を実験に供した

分解対象 Remazol Brilliant Blue R(RBBR) クリスタルバイオレットコンゴーレッド p-( フェニルアゾ )

分解酵素活性の評価が出来ることから様々な研究において白色腐朽菌の選定に使用されてきたクリスタルバイオレットは ph

7 3. 実験方法 3-1. 供試菌カワラタケ Trametes versicolor FFPRI1030 Trametes hirsuta KUT0807 ヒラタケ Pleurotus ostreatus NBRC6515 の3 種の白色腐朽菌を実験に供した各菌株の継代培養及び実験の前培養にはポテトデキストロース寒天 (PDA) 培地を用い 25 の暗所で培養した 3-2. 分解対象 Remazol Brilliant Blue R(RBBR) クリスタルバイオレットコンゴーレッド p-( フェニルアゾ ) フェノールの 4 種の染料を実験に供した RBBR はアントラキノン系の染料であり水溶液中で青色を呈する ( 図 2-A) 吸光度によってリグニン分解酵素活性の評価が出来ることから様々な研究において白色腐朽菌の選定に使用されてきたクリスタルバイオレットは ph 指示薬やグラム陽性の染色液として用いられており水溶液中で紫色を呈する ( 図 2-B) 殺菌消每効果もあるため微生物培養検査における発育阻止剤などにも使用されているコンゴーレッドはアゾ系の染料で水溶液中では赤色を呈し ph 指示薬にも用 A C B D 図 2. 使用した染料の化学構造 A; RBBR B; クリスタルバイオレット C; コンゴーレッド D; p-( フェニルアゾ ) フェノール 7

8 いられている ( 図 2-C) セルロース繊維に強い親和性を持っておりまた每性が強い染料である p-( フェニルアゾ ) フェノールは水溶液中で黄色を呈しアゾ染料として基本的な構造をもつ ( 図 2-D) アゾ染料は現在合成染料として種類が多く価格も比較的安いことから最も多く使用されている染料であるといえるなお染料の濃度はそれぞれ RBBR クリスタルバイオレットが 593 nm コンゴーレッドが 497 nm p-( フェニルアゾ ) フェノールが 390 nm の吸光度で測定したそれぞれの染料の濃度は RBBR が 0.4 g/l ( M) クリスタルバイオレットが g/l ( M) コンゴーレッドが 0.1 g/l ( M) p-( フェニルアゾ ) フェノールが 0.05 g/l ( M) で液体培地に添加した 3-3. 菌体の培養方法本研究で使用した液体培地の組成を表 1に示した表 1. 液体培地の組成この液体培地 30 ml を 100 ml のマヨネーズ瓶また Glucose 0.1% は 270 ml の細胞培養用フラスコに分注したマヨネ NH4NO3 0.1% ーズ瓶での培養では液体培地を分注後に細胞培養用 KH2PO4 0.08% フラスコでの培養では分注前にオートクレーブで Na2HPO4 0.02% min 滅菌した供試菌であるカワラタケ MgSO4 7H2O 0.05% およびヒラタケを PDA 培地に前培 Yeast extract 0.2% 養しそのコロニーの先端部を直径 11.5 mm のコルク脱イオン水ボーラーで打ち抜き実験 1 実験 5(3-4 に記述 ) のそれぞれの液体培地に接種した種菌接種した後それらを 25 の暗所にて静置培養を行ったそれぞれの菌体染料ごとのサンプル繰り返し数は4 本ずつとし染料の除去量は4 本の平均値とした 3-4. それぞれの実験における染料除去率の測定方法実施した実験 1 実験 5 の内容を以下に記述する実験 1 菌体が気液面における接触の有無においての染料分解への影響染料を添加した液体培地にフロー担体としてスギ炭 2 g を投入し一方は菌体が気液面に接触するように添加したもう一方は担体に潜り込ませるように菌体を添加し気液面への接触がないようにしたフロー担体とは液体培養において菌体が培地の気液面と接触しやすいように支持する資材である実験 1 では菌体が確実に空気面に接触しているものとしていないものを作るためフロー担体としスギ炭を投入した反応液を 250 μl 採取し 750 μl の蒸留水を混ぜ合わせ吸光度計でそれぞれの染料の吸光度で測定を行った 8

9 測定日は菌体添加後 0, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 日目とした実験 2 白色腐朽菌が分泌するリグニン分解酵素による染料分解の検証液体培地に供試菌を接種したものを培養しその培養液を粗酵素液とした培養から 7 日後の粗酵素液を染料が溶解した水溶液に毎日 1.5 ml ずつ添加したなお培養している液体培地の量は 30 ml を保つため粗酵素液を採取後に液体培地を 1.5 ml 継ぎ足したその反応液を 250 μl 採取し 750 μl の蒸留水で希釈し吸光度計でそれぞれの染料に適切な波長で測定を行った染料濃度の測定日は粗酵素液添加後 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 日目に行った実験 3 気液接触面積の違いが染料分解に及ぼす影響の検討気液接触面積 20 cm 2 のマヨネーズ瓶 (100 ml 容, ガラス製,TPX ねじ口フタ付 ) と 75 cm 2 の細胞培養用フラスコ (270 ml 容, ポリスチロール製 ) の2 種類で菌体を培養し染料の除去量を実験 1 と同様に反応液 250 μl と 750 μl の蒸留水で希釈し吸光度により評価した測定日は菌体添加後 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 日目とした実験 4 菌体成長後の染料添加における分解液体培地で菌体を 7 日間または 3 日間培養した培養液上清に終濃度が各染料の濃度になるように添加したでは, 他の 2 つの供試菌と比較すると成長が速いため 7 日間培養した培養液中では分泌されたリグニン分解酵素の活性が下がっていることが考えられることから 3 日間だけの培養も試みた染料の除去量の評価は反応液 250 μl と 750 μl の蒸留水で希釈し吸光度を評価した測定日は染料添加後 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 日目に行った実験 5 染料分解後の反応液の解析実験 4 と同様に菌体成長後に染料を添加し分解された 8 日目の反応液を吸光度計で 800 nm~200 nm の波長における吸光スペクトルを測定した 9

10 供試菌液体培地染料が溶解した水溶液供試菌染料を添加した 20 cm 2 液体培地 75 cm 2 供試菌供試菌を 7 日間 (3 日間 ) 培養し染料をそれぞれの濃度で添加図 3. それぞれの実験方法の概要 ( 上から順に実験 1 実験 2 実験 3 実験 4 5) 除去率の算出方法はブランク ( 菌体を添加せず液体培地に染料だけ ( 実験 1 においては担体のみ ) を添加したもの ) の測定値を分母分解された反応液の測定値を分子として算出したなおそれぞれの実験方法の概要を図 3 に示した 10

11 除去率 (%) 除去率 (%) 4. 結果と考察 4-1. 実験 1 菌体が気液面における接触の有無においての染料分解への影響実験 1 において RBBR およびクリスタルバイオレットの除去率の経時的変化を図 4 に示した RBBR 菌体添加後日数 ( 接触有 ) カワラタケ ( 接触有 ) カワラタケヒラタケ ( 接触有 ) ヒラタケクリスタルバイオレット菌体添加後日数 ( 接触有 ) カワラタケ ( 接触有 ) カワラタケヒラタケ ( 接触有 ) ヒラタケ図 4. 菌体が気液面に接触の有無における除去率. 上 :RBBR, 下 : クリスタルバイオレット. 11

12 RBBR における菌糸の気相への接触の有無に対する影響ではカワラタケヒラタケで最終的な除去率の差が生じたでは最終的な除去率に差はなかったが 4 日目から除去速度が上がったカワラタケにおいては 3 種類の供試菌の中でも最も顕著な差があり気相に菌糸が接触した方では最終的な除去率が約 50% も上回ったクリスタルバイオレットにおいても RBBR と同様にカワラタケヒラタケで最終的な除去率に差影響が認められカワラタケでは気相に接触した方で 2 日目から除去速度が増加した今回実験を行った供試菌では 3 種類とも同様に菌糸が気液面への接触している条件で染料分解の効率が上がることがわかった特に抗菌性のあるクリスタルバイオレットでは成長速度などからみても気液面への接触の条件の違いだけで大きな差が生じたこの要因としては菌体への酸素供給量の差がそのまま除去率にも反映されたと考えられるこの結果より今後は気液面に接触した菌体培養を最低条件として実験を進めた 12

13 除去率 (%) 除去率 (%) 除去率 (%) 4-2. 実験 2 白色腐朽菌が分泌するリグニン分解酵素による染料分解の検証実験 2 について染料除去率の経時的変化を図 5 培養の様子を図 6 に結果を示した RBBR 粗酵素液添加後日数カワラタケヒラタケカワラタケ ( 菌体あり ) クリスタルバイオレット粗酵素液添加後日数カワラタケヒラタケ ( 菌体あり ) コンゴーレッドカワラタケヒラタケ粗酵素液添加後日数図 5. 菌体外酵素による染料除去率 13

初めはあまり分解が進んでいないが粗酵素液を毎日添加していくことで除々に分解したなおコンゴーレッドの場合は染料を液体培地に混合した条件で菌糸の培養を行った際には菌体が死滅したため分解が全く見られなかったが菌体外酵素のみを添加していくと ( 実験 2の条件 )

14 A B C 図 6. 菌体外酵素による染料の分解. A; RBBR( カワラタケ ) B; クリスタルバイオレット ( ) C; コンゴーレッド ( ヒラタケ ), それぞれ左のビンは無処理, 右のビンは粗酵素添加区を示す. RBBR の除去ではカワラタケの粗酵素液は高い除去率を示したヒラタケではカワラタケと比較すると除去速度は遅いが粗酵素液を添加するごとに尐しずつ分解していることが認められたクリスタルバイオレットコンゴーレッドでは 3 つの供試菌間で除去速度に差は表れず初めはあまり分解が進んでいないが粗酵素液を毎日添加していくことで除々に分解したなおコンゴーレッドの場合は染料を液体培地に混合した条件で菌糸の培養を行った際には菌体が死滅したため分解が全く見られなかったが菌体外酵素のみを添加していくと ( 実験 2の条件 ) 染料濃度を低下させることが可能であることが示された菌体が存在している状態での染料分解では菌体への吸着によって染料が除去されているように見えた可能性も考えられたが実験 2 結果では粗酵素液( 菌体外酵素 ) を添加し続けることでも菌体が存在している状態と同様に染料の分解がなされていることが確認できた 14

15 除去率 (%) 除去率 (%) 4-3. 実験 3 気液接触面積の違いが染料分解に及ぼす影響の検討実験 3 の RBBR およびクリスタルバイオレットの除去率の経時的変化を図 7 に示した RBBR 日数 ( 面積大 ) カワラタケ ( 面積大 ) カワラタケヒラタケ ( 面積大 ) ヒラタケクリスタルバイオレット日数 ( 面積大 ) カワラタケ ( 面積大 ) カワラタケヒラタケ ( 面積大 ) ヒラタケ図 7. 気液接触面積の違いによる染料分解気液接触面積が染料分解に及ぼす影響を検討したところ, まず RBBR でカワラタケの 2 種類の供試菌で気液接触面積の大きい方が 4 日目から除去速度が増加し最終的な除去率が高まることがわかった一方クリスタルバイオレットの分解では最終的な除去率はカワラタケはほとんど変化がなかった気液接触面 15

16 積はどの供試菌においても気液接触面積の小さい従来のマヨネーズ瓶の培養で除去速度が速いことが示された抗菌性のあるクリスタルバイオレットとそうではない RBBR では気液接触面積の影響が異なることがわかったしたがって気液接触面積はその影響が染料や菌種によって異なる可能性があると考えられる 16

17 除去率 (%) 除去率 (%) 4-4. 実験 4 菌体成長後の染料添加における分解実験 4 における 4 種類の染料の経時的除去率を図に示した RBBR (7 日目 ) (3 日目 ) カワラタケ (7 日目 ) ヒラタケ (7 日目 ) 日数クリスタルバイオレット日数 (7 日目 ) (3 日目 ) カワラタケ (7 日目 ) ヒラタケ (7 日目 ) 図 8 1. 菌体成長後の染料添加. 上 :RBBR, 下 : クリスタルバイオレット. 17

18 除去率 (%) 除去率 (%) コンゴーレッド (7 日目 ) (3 日目 ) カワラタケ (7 日目 ) ヒラタケ (7 日目 ) 日数 p-( フェニルアゾ ) フェノール染料添加後日数 (7 日目 ) (3 日目 ) カワラタケ (7 日目 ) ヒラタケ (7 日目 ) 図 8 2. 菌体成長後の染料の添加. 上 : コンゴーレッド, 下 :p-( フェニルアゾ ) フェノールまずの培養日数についてはほかの 2 種類の供試菌と比較すると成長が速く分泌されるリグニン分解酵素の活性が低下していることが考えられたため菌体培養後 3 日目に染料添加する試験区を設定した RBBR においてはカワラタケで染料添加 1 日に約 90% の除去率を示しすべての菌種で最終的な除去率が 90% を超えたクリスタルバイオレットではすべての供試菌で 90% を超える除去率を示したの培養日数が RBBR およびクリスタルバイオ 18

19 レットの除去に対して異なる影響を示した原因としてはそれぞれの染料分解に働く酵素が別のものであると考えられるコンゴーレッドではカワラタケが約 90% ヒラタケはそれぞれ約 75% の除去率を示したコンゴーレッドは以前の実験で染料を混合した液体培地での培養では菌体が死滅したので除去率は 0% であったが菌体成長後に染料を添加することによって菌体を死滅させることなく分解出来ることが示された p-( フェニルアゾ ) フェノールではで約 70% カワラタケで約 55% ヒラタケで約 30% の除去率を示したまた p-( フェニルアゾ ) フェノールにおいてのみほかの 3 種類の染料とは異なりで培養 7 日目に染料添加を行ったもののほうが高い除去率を示した菌体成長後の染料添加においては RBBR やクリスタルバイオレットの分解で染料添加後 1 日目で高い除去率を示したことから染料を連続的に添加し分解処理が考えられるまた菌体の成長段階によっても除去率が変化することが新たに判明した 19

4-5. 実験 5 染料分解後の反応液の解析実験 5 の可視紫外光吸収スペクトルおよび培養ビンの様子を図 9 1 3 に示した図 9 1.

20 4-5. 実験 5 染料分解後の反応液の解析実験 5 の可視紫外光吸収スペクトルおよび培養ビンの様子を図に示した図 9 1. 染料分解後の培養液の可視紫外吸光スペクトル (RBBR) および培養ビンの様子 ( 左 : 無処理, 右 : 培養後 ). 図 9 2. 染料分解後の培養液の可視紫外吸光スペクトル ( クリスタルバイオレット ) および培養ビンの様子 ( 左 : 無処理, 右 : 培養後 ). 20

21 図 9 3. 染料分解後の培養液の可視紫外吸光スペクトル ( コンゴーレッド ) および培養ビンの様子 ( 左 : 無処理, 右 : 培養後 ). 可視紫外吸光スペクトルを測定した結果 RBBR クリスタルバイオレットは 593nm コンゴーレッドは 497nm にピークがあったものがそれぞれそのピークが減尐し 300nm 付近にシフトしていることがわかるこのことによって添加された染料が別の化学物質に分解されていること予想できるしかしもとの染料の構造がリグニン分解酵素によってどのような分解過程を経過するのかまた最終的にどんな構造に分解されているかなど不明な点が多くさらなる解明が必要であると考えている 21

22 5. 結論白色腐朽菌を利用した染料の生分解において染料濃度の低下は酵素による分解菌体への吸着物理化学的劣化 ph の変化による色調変化など様々な要因が染料除去に関与している可能性があったため純粋に酵素分解の寄与を明らかにする必要があった本研究の実験 2 の結果では粗酵素液を添加していくことで菌体がある状態と同様に染料の分解が起こっていることが確認できたこれまでの研究で菌体が気液面に接触している場合のほうが染料除去率が高い傾向がみられることが分かっていた本研究の実験 1 から菌糸が気相に接していると除去率が高いことが示され菌体への酸素供給が酵素生産に影響を与えることで除去率が増加する可能性が示された特に抗菌性のあるクリスタルバイオレットついては成長速度などからみてみても菌体が気相に接触したときに顕著な除去率増加があることがわかる今後染料分解を行う際の白色腐朽菌の培養については気液面に接触している場合での培養が最低条件であると考えられる実験 3 における気液接触面積の違いが染料分解に及ぼす影響の検討では RBBR の分解でカワラタケの 2 種の菌体で除去率増加が見られたがクリスタルバイオレットの分解では見られなかったこの原因としては空気に接触している面積は大きいがそれに伴って浮遊している面積も大きくなるため菌体の成長が遅れたためと予想出来るしかしこの課題については担体を用いて菌体を固定化することで克服できるのではないかと考えられる実験 4 の菌体成長後の染料添加における分解においては初期増殖を終えた時期に染料を添加することで安定して高い除去率を得ることができたすなわち増殖中の菌体に負荷を与えることを避け酵素生産力を獲得した後に染料を添加する方法を見いだしたこれは処理槽での染料分解のための基礎的なデータを得ることには一定の成果があったように思うこれは RBBR やクリスタルバイオレットの分解で染料の添加後 1 日目で高い除去率を示したことから染料を連続的に添加し分解処理が考えられる実験 5 の染料分解後の反応液の可視紫外吸光スペクトル測定ではどの染料でも最大吸収波長のピークが下がりクリスタルバイオレットにおいてはほぼ分解していることがわかったしかし RBBR のように青色から分解され赤色となり染料の化学構造をどの段階まで分解しているかが不明であるコンゴーレッドでもピークは減尐しているものの RBBR と同様に分解後の化学構造はわからない 22

23 本研究での課題としてはまず白色腐朽菌が分泌する酵素が染料の化学構造をどの段階まで分解しているのかがわからないことであるそして様々な化学物質が混在する処理槽での除去に際して生物である白色腐朽菌の活性や成長の低下が考えられるまた処理槽において菌体が生育できない可能性もあり生育が可能だとしても白色腐朽菌の酵素分泌が著しく阻害されることも考えられるため菌体の生存能力強化染料除去能力の向上のためのリグニン分解酵素生産量の増加が必要であると考えている 23

24 6. 謝辞本論文のご指導いただいた堀澤先生に深く感謝いたします 7. 参考文献 1)A.Asano. 担体を用いた白色腐朽菌による色素除去 ( 2006) 高知工科大学修士論文 2)K.Katou. 担体を用いた白色腐朽菌の酵素活性変化量 ( 2010) 高知工科大学卒業論文 3)N.Nishida. 白色腐朽菌を用いた染料の分解 ( 2011) 高知工科大学卒業論文 4)G.Suzuki. et al. 難分解性物質含有排水の分解処理技術に関する研究開発 ( 2003) 24

豚丹毒 ( アジュバント加 ) 不活化ワクチン ( シード ) 平成 23 年 2 月 8 日 ( 告示第 358 号 ) 新規追加 1 定義シードロット規格に適合した豚丹毒菌の培養菌液を不活化しアルミニウムゲルアジュバントを添加したワクチンである 2 製法 2.1 製造用株名称豚丹

豚丹毒 ( アジュバント加 ) 不活化ワクチン ( シード ) 平成 23 年 2 月 8 日 ( 告示第 358 号 ) 新規追加 1 定義シードロット規格に適合した豚丹毒菌の培養菌液を不活化しアルミニウムゲルアジュバントを添加したワクチンである 2 製法 2.1 製造用株 2.1.1 名称豚丹毒菌多摩 96 株 ( 血清型 2 型 ) 又はこれと同等と認められた株 2.1.2 性状感受性豚に接種すると

平成 23 年度修士論文 白色腐朽菌を利用した染料の生分解 Biodegradation of dyes using white-rot fungi. 高知工科大学大学院工学研究科基盤工学専攻 物質 環境システム工学コース 堀澤研究室修士 2 年 加藤紘將 1

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