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1 厚 生 労 働 科 学 研 究 費 補 助 金 化 学 物 質 リスク 研 究 事 業 特 定 芳 香 族 アミンを 含 有 する 家 庭 用 品 の 規 制 基 準 に 係 る 調 査 平 成 23 年 度 分 担 研 究 年 度 終 了 報 告 書 i

2 平 成 24(2012) 年 3 月 伊 佐 間 和 郎 河 上 強 志 広 瀬 明 彦 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 生 活 衛 生 化 学 部 室 長 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 生 活 衛 生 化 学 部 主 任 研 究 官 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 安 全 性 生 物 試 験 研 究 センター 総 合 評 価 研 究 室 室 長 ii

3 目 次 分 担 研 究 年 度 終 了 報 告 特 定 芳 香 族 アミンを 含 有 する 家 庭 用 品 の 規 制 基 準 に 係 る 調 査 伊 佐 間 和 郎 河 上 強 志 広 瀬 明 彦 ( 資 料 1) Analysis of primary aromatic amines originated from azo dyes in commercial textile products in Japan Tsuyoshi Kawakami, Kazuo Isama, Harunobu Nakashima, Toshie Tsuchiya, Atsuko Matsuoka Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering Volume 45, Issue 10, Pages (2010) ( 資 料 2) 特 定 芳 香 族 アミン 類 の 家 庭 用 品 への 使 用 状 況 及 び 暴 露 評 価 に 関 する 調 査 業 務 報 告 書 日 本 エヌ ユー エス 株 式 会 社 iii

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5 分 担 研 究 年 度 終 了 報 告 特 定 芳 香 族 アミンを 含 有 する 家 庭 用 品 の 規 制 基 準 に 係 る 調 査 伊 佐 間 和 郎 河 上 強 志 広 瀬 明 彦 1

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7 厚 生 労 働 科 学 研 究 費 補 助 金 ( 化 学 物 質 リスク 研 究 事 業 ) 分 担 研 究 年 度 終 了 報 告 書 特 定 芳 香 族 アミンを 含 有 する 家 庭 用 品 の 規 制 基 準 に 係 る 調 査 研 究 分 担 者 伊 佐 間 和 郎 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 生 活 衛 生 化 学 部 室 長 研 究 協 力 者 河 上 強 志 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 生 活 衛 生 化 学 部 主 任 研 究 官 研 究 協 力 者 広 瀬 明 彦 国 立 医 薬 品 食 品 衛 生 研 究 所 安 全 性 生 物 試 験 研 究 センター 総 合 評 価 室 室 長 研 究 要 旨 : 繊 維 製 品 ならびに 革 製 品 中 のアゾ 染 料 由 来 の 芳 香 族 第 一 アミン 類 (Primary Aromatic Amines: PAAs)について 繊 維 製 品 31 製 品 (41 検 体 ) 革 製 品 23 製 品 (23 検 体 )の 実 態 調 査 を 行 った EU で 規 制 対 象 となっている 22 種 類 の PAAs のうち 繊 維 製 品 からは 12 種 類 革 製 品 からは 11 種 類 が 定 量 下 限 値 以 上 で 検 出 された そのほ とんどは 1.0 µg/g 以 下 と 低 濃 度 であったが 繊 維 製 品 では 綿 製 品 (インド 製 )7 製 品 (8 検 体 )から benzidine が EU 基 準 値 (30 µg/g) 以 上 で 検 出 され その 内 訳 はショー ルが 1 製 品 シーツ カバー 類 が 6 製 品 (7 検 体 )であった 一 方 革 製 品 では 革 細 工 用 の 端 切 れから o-toluidine benzidine および 3,3 -dimethylbenzidine がそれぞれ 1 検 体 ずつ EU 基 準 値 以 上 で 検 出 された EU の 基 準 値 を 超 過 した 各 PAAs の 濃 度 は 繊 維 製 品 から 検 出 された benzidine が 45~593 µg/g 革 製 品 から 検 出 された o-toluidine が 430 µg/g benzidine が 31 µg/g および 3,3 -dimethylbenzidine が 40 µg/g であった ショール やシーツなどは 皮 膚 に 直 接 触 れる 可 能 性 があり それらの 製 品 からの benzidine の 曝 露 量 評 価 が 必 要 と 考 えられた A. 研 究 目 的 アゾ 染 料 は 世 界 中 で 広 く 用 いられて いる 染 料 の 一 つであり 繊 維 製 品 紙 製 品 および 革 製 品 など 様 々な 製 品 の 染 色 に 用 いられている このアゾ 染 料 は 19 世 紀 半 ばごろから 使 用 されるようにな った そして その 種 類 が 豊 富 で 安 価 で あることから 現 在 では 世 界 中 で 3000 種 類 以 上 のアゾ 染 料 が 使 用 されており 染 料 市 場 全 体 に 占 める 割 合 は 実 に 65% に 達 すると 言 われている 1) 一 方 で これらのアゾ 染 料 の 一 部 は 皮 膚 表 面 や 腸 内 の 細 菌 および 肝 臓 などで 還 元 的 に 分 解 され 発 がん 性 を 有 するも しくは 疑 われる 芳 香 族 第 一 アミン 類 (Primary Aromatic Amines: PAAs)を 生 成 する 2-4) このアゾ 染 料 由 来 の 発 がん 性 を 有 する PAAs の 事 を 一 般 的 に 特 定 芳 香 族 アミンと 呼 び 発 がん 性 を 有 して いない PAAs と 区 別 している これまで に 合 成 されたアゾ 染 料 の 内 四 分 の 一 以 上 について 発 がん 性 PAAs が 含 まれ 特 に 最 も 発 がん 性 の 高 い PAAs の 一 つであ る benzidine を 基 本 骨 格 とする 染 料 は 3

8 250 種 類 を 超 えているとされている 5) そのため ドイツでは 1994 年 に 家 庭 製 品 規 制 令 が 改 定 され 特 定 のアゾ 染 料 および 顔 料 について 繊 維 製 品 など 皮 膚 に 直 接 長 期 間 接 触 する 製 品 への 使 用 が 禁 止 された この 改 定 より それらのア ゾ 染 料 から 還 元 的 に 生 成 する 発 がん 性 の 確 認 された もしくは 疑 いのある 20 種 類 の PAAs が 初 めて 規 制 された(30 µg/g 以 下 ) 6) EU でも 2002 年 9 月 に EU Council Directive 76/769/EEC( 危 険 物 質 及 び 調 剤 の 上 市 と 使 用 の 制 限 に 関 する 理 事 会 指 令 )の 改 正 が 発 効 した(EU Directive 2002/61/EC) この EU 指 令 によ り アゾ 染 料 に 由 来 する PAAs としてド イツで 規 制 されていた 20 種 類 に 加 えて o-anisidine ( 2-methoxyaniline ) と 4-aminoazobenzene の 2 種 類 を 加 えた 22 種 類 が 規 制 対 象 (30 µg/g 以 下 )となっ た 7) なお 化 学 物 質 管 理 に 関 する 規 則 である REACH(Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) 発 効 に 伴 い 現 在 ではこれ ら PAAs は REACH にて 規 制 されている 8) また ヨーロッパを 中 心 に 繊 維 製 品 の 安 全 性 自 主 基 準 として Oeko-Tex Standard 100 が 用 いられ これら 22 種 類 に 加 えてさらに 2 種 類 (2,4-xylidine 2,6-xylidine)を 加 えた 24 種 類 について 自 主 基 準 を 設 けている( 使 用 していない こと 定 量 下 限 値 :20 µg/g) 9) 中 国 で も 同 じく 24 種 類 の PAAs が 規 制 され 中 華 人 民 共 和 国 国 家 標 準 (GB/T )によって 分 析 法 が 規 定 され ている(20 µg/g 以 下 ) 10) また 韓 国 及 び ベトナムでも PAAs は 法 規 制 されており タイでは 自 主 基 準 が 運 用 されている 11) 我 が 国 では 2008 年 に 自 主 基 準 として 衣 類 家 庭 用 繊 維 製 品 および 工 業 用 繊 維 製 品 についてエコマーク 基 準 の 導 入 が なされた(30 µg/g 以 下 ) 12) EU では 食 料 品 医 薬 品 および 医 療 機 器 以 外 の 消 費 者 製 品 について 域 内 の 加 盟 国 からの 違 反 事 例 の 報 告 を 緊 急 警 戒 システム 13) (Rapid Alert System for non-food consumer products: RAPEX) にて 週 単 位 で 集 計 して 公 開 している 2010 年 及 び 2011 年 に RAPEX で 報 告 さ れた PAAs 違 反 事 例 について 製 品 分 類 と 製 品 名 別 の 報 告 件 数 を 表 1 違 反 製 品 の 生 産 国 を 表 2 違 反 製 品 から 検 出 され た PAAs の 種 類 を 表 3 にそれぞれ 示 した 製 品 として 違 反 報 告 件 数 が 多 いのは 衣 類 やファッションおよびインテリア 製 品 であり 特 にスカーフが 多 い 傾 向 を 示 していた 生 産 国 別 では 中 国 とインドが 多 く PAAs は 中 国 産 では 様 々な 製 品 か ら 検 出 され インド 産 では 主 にスカーフ から 検 出 されている また 違 反 製 品 中 の PAAs 種 類 別 の 検 出 頻 度 は benzidine 4-aminoazobenzene 3,3 -dimethoxybenzidine の 順 であり その 濃 度 範 囲 は 基 準 値 付 近 から 最 大 で 数 千 µg/g であった また インド 産 の 製 品 では benzidine が 主 に 検 出 され 中 国 産 の 製 品 では benzidine および 4-aminoazobenzene が 共 に 検 出 されて いる このように EU 圏 内 では 家 庭 用 品 中 の PAAs の 現 状 が 把 握 されているが 我 が 国 に 流 通 する 繊 維 製 品 等 における 4

9 PAAs の 実 態 は 不 明 であったことから 我 々は 我 が 国 に 流 通 する 繊 維 製 品 中 の PAAs についての 実 態 調 査 を 2009 年 1 月 ~3 月 にかけて 86 製 品 121 検 体 につい て 行 った その 結 果 綿 製 のランチョン マット(インド 製 )の 一 部 から EU 等 の 基 準 値 を 超 える 高 濃 度 の benzidine を 検 出 し 我 が 国 に 流 通 する 繊 維 製 品 中 に これら 発 がん 性 PAAs が 存 在 しているこ とを 明 らかにした 14) EU では 規 制 対 象 の 繊 維 製 品 は 皮 膚 に 直 接 触 れる 可 能 性 のある 製 品 とされ ており ランチョンマットは 直 接 皮 膚 に 触 れることを 意 図 した 製 品 ではない そ のため より 皮 膚 に 触 れる 可 能 性 の 高 い 衣 類 およびシーツ 類 などについて 集 中 的 に 調 査 を 行 う 必 要 がある また EU では 革 製 品 についても 繊 維 製 品 同 様 に PAAs について 規 制 しており 革 製 品 で も PAAs の 検 出 例 が 報 告 されている 13) しかし 我 が 国 に 流 通 している 革 製 品 中 の PAAs の 実 態 は 不 明 である そこで 過 去 の 実 態 調 査 結 果 を 踏 まえて 綿 製 の 衣 類 やシーツ 等 の 皮 膚 に 直 接 触 れる 可 能 性 の 高 い 繊 維 製 品 並 びに 革 製 品 につ いて 実 態 調 査 を 行 ったので 報 告 する 今 回 調 査 対 象 とした PAAs は 表 4 に 示 した 26 種 類 である B. 方 法 B.1 試 料 2011 年 度 後 半 に 一 般 的 な 小 売 店 で 販 売 されている 繊 維 および 革 製 品 を 東 京 都 および 埼 玉 県 内 の 複 数 店 舗 にて 購 入 した 購 入 した 製 品 の 種 類 色 材 質 生 産 国 などについて 繊 維 製 品 は 表 5 革 製 品 は 表 6 にそれぞれ 示 した 繊 維 製 品 については 複 数 の 色 で 構 成 されてい る 試 料 について 可 能 な 限 り 色 別 に 仕 分 けし それぞれを 分 析 用 検 体 とした 最 終 的 に 調 査 製 品 数 は 繊 維 製 品 が 31 製 品 (41 検 体 ) 革 製 品 が 23 製 品 (23 検 体 ) であった なお EU 基 準 値 を 超 えて PAAs が 検 出 された 検 体 については 色 をより 正 確 に 表 現 する 為 に Munsell color system による 色 分 類 を 行 った B.2 試 薬 対 象 とした 26 種 類 の PAAs の 購 入 先 等 を 表 4 に 示 した また 内 部 標 準 物 質 として 関 東 化 学 社 製 の naphthalene-d 8 および anthracene-d 10 並 びに 和 光 純 薬 工 業 社 製 の 2,4,5-trichloroaniline を 用 いた Methyl tert-butyl ether(mtbe) メタノ ールおよびヘキサンは 関 東 化 学 社 製 の 残 留 農 薬 分 析 用 を 用 いた クエン 酸 緩 衝 液 (ph6.0 クエン 酸 として 0.06 mol/l) 用 のクエン 酸 還 元 剤 のハイドロサルフ ァイトおよび 水 酸 化 ナトリウムはシグ マアルドリッチ 製 の 特 級 試 薬 を 用 いた 塩 化 ナトリウムはナカライテスク 製 の 特 級 試 薬 を 用 いた 標 準 溶 液 は 各 PAAs が 1000 もしくは 100 µg/ml となるように メタノールで 調 整 した 後 10 µg/ml とな るように MTBE で 希 釈 して 混 合 標 準 溶 液 とした B.3 前 処 理 方 法 繊 維 製 品 に つ い て は EN :2003( 天 然 繊 維 製 品 ) 16) に 準 拠 して 行 った また 革 製 品 については 試 料 の 調 製 方 法 については 5

10 ISO2418: ) に PAAs 分 析 のための 前 処 理 は EN : ) に 準 拠 して 行 った なお 4-aminoazobenzne につい ては EN : ) に 従 い 分 析 を 行 った 前 処 理 方 法 の 流 れを 繊 維 試 料 は 図 1 に 革 製 品 は 図 2 にそれぞれ 示 した B.3.1 繊 維 試 料 の 前 処 理 方 法 はじめに 適 当 な 大 きさに 細 切 した 繊 維 試 料 1 g を 精 秤 した そして 試 料 と あらかじめ 70 に 加 熱 しておいたクエ ン 酸 緩 衝 液 17 ml を 反 応 容 器 に 入 れ 70 ±2 30 分 間 保 温 した その 後 還 元 剤 として 3 ml のハイドロサルファイト 溶 液 (200 mg/ml)を 加 えた 後 さらに 70±2 で 30 分 保 温 した 30 分 経 過 後 試 料 の 入 った 反 応 溶 液 を 2 分 以 内 に 室 温 まで 冷 却 した 冷 却 後 反 応 溶 液 を 吸 引 濾 過 して 繊 維 と 分 離 し 100 ml 分 液 ロ ートへと 移 した その 後 20 ml の MTBE を 加 え 30 分 間 機 械 振 とう 抽 出 し 一 定 時 間 静 置 後 に 溶 媒 相 を 分 取 した もう 一 度 同 様 に 抽 出 し 溶 媒 相 を 分 取 した 後 最 初 の 溶 媒 相 と 合 わせ 無 水 硫 酸 ナトリ ウムで 脱 水 した 脱 水 後 湯 浴 温 度 が 30 以 下 の 条 件 でロータリーエバポレ ーターにて 約 1 ml まで 濃 縮 した 濃 縮 後 10 ml のフラスコに MTBE を 用 いて 移 し 定 容 した この 試 験 溶 液 から 1 ml 分 取 し 2 µg/ml の 内 部 標 準 物 質 を 含 む MTBE 溶 液 を 50 µl 加 えたものを 測 定 溶 液 とした B.3.2 革 試 料 の 前 処 理 方 法 革 試 料 を 細 切 して 目 開 き 4 mm の 篩 を 通 過 させたものを 分 析 用 試 料 とした 篩 別 した 革 試 料 1 g を 精 秤 して 反 応 容 器 に 入 れた そこに ヘキサン 20 ml を 加 え て 40 で 20 分 間 超 音 波 処 理 を 行 った その 後 ヘキサン 相 をデカンテーション にて 除 去 した 後 もう 一 度 ヘキサン 20 ml を 加 えて 同 様 に 超 音 波 処 理 した 後 に ヘキサン 相 をデカンテーションにて 除 去 し 脱 脂 処 理 とした その 後 ドラフ トチャンバー 内 で 反 応 容 器 の 口 を 開 け た 状 態 で 一 晩 放 置 し 残 留 していたヘキ サンを 完 全 に 除 去 した 次 に 革 試 料 とあらかじめ 70 に 加 熱 しておいたクエン 酸 緩 衝 液 17 ml を 反 応 容 器 に 入 れ 70±2 25 分 間 保 温 し た 次 に 還 元 剤 として 1.5 ml のハイド ロサルファイト 溶 液 を 加 え 10 分 保 温 し た その 後 もう 一 度 1.5 ml のハイドロ サルファイト 溶 液 を 加 えて 10 分 間 保 温 した 後 室 温 まで 冷 却 した 冷 却 後 繊 維 製 品 試 料 と 同 様 に MTBE で 抽 出 し 測 定 溶 液 を 調 製 した 4-aminoazobenzene については 前 述 の ように 脱 脂 処 理 を 行 った 後 9 ml の 2% ( 重 量 %) 水 酸 化 ナトリウム 水 溶 液 を 加 え 十 分 に 試 料 が 濡 れるまで 振 とうした その 後 1 ml のハイドロサルファイト 水 溶 液 を 加 え 十 分 振 とうした 後 40±2 で 30 分 間 保 温 した 30 分 経 過 後 流 水 を 用 いて 試 料 を 1 分 以 内 に 室 温 まで 冷 却 した 次 に 反 応 容 器 中 の 試 料 に 10 µg/ml の 内 部 標 準 物 質 を 含 む MTBE 溶 液 を 50 µl と 5 ml の MTBE および 7 g の 塩 化 ナトリウムを 加 えた 後 45 分 間 振 と う 抽 出 した 冷 却 から 抽 出 開 始 まで 5 分 以 内 で 処 理 した 振 とう 後 3000 rpm で 10 分 間 遠 心 分 離 した そして 遠 心 分 6

11 離 後 に MTBE 相 を 分 取 し 無 水 硫 酸 ナ トリウムで 脱 水 した 後 に 測 定 溶 液 とし た B.4 ガスクロマトグラフ 質 量 分 析 計 (GC/MS)による 定 量 PAAs の 定 量 は GC/MS にて 行 った GC/MS は Focus GC/DSQ Ⅱ(Thermo Fisher Scientific 社 製 )を 用 い キャピラ リーカラムは 中 極 性 カラム DB-35MS ( 長 さ 30 m 内 径 0.25 mm 膜 厚 0.25 µm Agilent 社 製 )を 用 いた キャリア ーガスには He を 用 い 流 量 は 1.0 ml/min に 設 定 した 注 入 口 トランスファーラ インおよびイオンソース 温 度 はそれぞ れ および 230 に 設 定 し ス プリットレスモードで 測 定 溶 液 を 1 µl 注 入 した カラムオーブンプログラムは 初 期 温 度 55 で 5 分 間 保 持 させた 後 230 まで 15 / 分 で 昇 温 させた その 後 290 までは 5 / 分 で 310 までは 20 / 分 で 昇 温 し 最 終 温 度 で 5 分 間 保 持 し た イオン 化 法 は Electron Ionization(EI) 法 イオン 化 電 圧 は 70 ev とした 測 定 は Selected Ion Monitoring(SIM)モード にて 行 った 各 測 定 対 象 物 質 の 定 量 定 性 イオンについては 表 7 に 記 載 した 各 化 合 物 濃 度 が 0.01 µg/ml ( 但 し 1,4-phenylenediamine 2,4-diaminotoluene 2,4-diaminoanisole については 0.1 µg/ml) の 混 合 標 準 溶 液 を 繰 り 返 し 3 回 測 定 し た 際 の 標 準 偏 差 の 3.3 倍 を 検 出 下 限 値 20) 10 倍 を 定 量 下 限 値 20) として 実 試 料 に 換 算 した 値 を 表 7 に 示 した EU では 検 出 下 限 値 を 5 µg/g と 設 定 しているが 今 回 の 測 定 時 の 検 出 下 限 値 はそれを 十 分 に 下 回 っており 感 度 について 問 題 は 無 か った 回 収 率 については EN : ) に 準 拠 して 以 前 の 調 査 14) と 同 様 に 求 め 革 製 品 中 の 4-aminoazobenzene は EN : ) の 方 法 に 従 った 回 収 率 試 験 ( 設 定 濃 度 5 µg/g: n=5)の 結 果 を 表 7 に 示 した 2,4-diaminoanisole につい ては 回 収 率 が 19%と 目 標 値 である 20% に 届 かず 変 動 係 数 も 24%と 変 動 が 大 き かった また 1,4-phenylenediamine は 目 標 値 設 定 されていないが 回 収 率 は 10% と 低 かった 一 方 4,4 -oxydianiline およ び 4,4 -methylenedianiline は 回 収 率 が 171 および 136%と 高 くなったが 変 動 係 数 は 小 さかった それ 以 外 の 化 合 物 につい ては 回 収 率 は 70~120%の 範 囲 に 入 って おり 変 動 係 数 も 10% 以 内 と 良 好 であっ た 革 製 品 中 の 4-aminoazobenzne の 回 収 率 ( 設 定 濃 度 5 µg/g: n=5)は 99% 変 動 係 数 は 1.4%と 良 好 であった C. 結 果 及 び 考 察 C.1 繊 維 試 料 綿 製 品 29 製 品 (39 検 体 )およびシル ク 製 品 2 製 品 (2 検 体 )について PAAs を 測 定 した それぞれの PAAs について 製 品 および 検 体 中 の 検 出 頻 度 および 濃 度 範 囲 を 表 8 に 示 した また 検 出 され た PAAs について 個 々の 検 体 中 濃 度 を 表 9 に 示 した 測 定 対 象 とした 26 種 類 の PAAs のうち 12 種 類 が 定 量 下 限 値 以 上 で 1 検 体 以 上 検 出 された このうち EU で 規 制 されている PAAs は 10 種 類 であった 検 出 頻 度 の 高 い 順 に aniline ( 定 量 下 限 値 以 上 の 検 体 数 : 29/41) 7

12 4-chloroaniline( 同 : 15/41) o-toluidine ( 同 : 11/41) 4-aminobiphenyl( 同 : 11/41) benzidine( 同 : 11/41)であっ た( 表 8) Aniline については 問 題 と なるアゾ 系 染 料 以 外 の 染 料 等 の 化 合 物 の 構 造 中 に 多 く 含 まれているため その 検 出 濃 度 頻 度 ともに 他 のアミン 類 に 比 べて 高 くなったものと 考 えられた 4-chloroaniline については 様 々な 種 類 の 繊 維 製 品 から 検 出 された 一 方 o-toluidine 4-aminobiphenyl および benzidine については スカーフ 類 およ びシーツ カバー 類 などから 多 く 検 出 さ れ 衣 類 からはほとんど 検 出 されなかっ た 繊 維 製 品 から 検 出 された PAAs の 濃 度 については そのほとんどは 1.0 µg/g 以 下 であったが benzidine については EU 基 準 値 (30 µg/g)を 超 える 濃 度 が 綿 製 の ショールおよびシーツ カバー 類 から 検 出 され 基 準 値 超 過 は 7 製 品 (8 検 体 ) であった( 表 9) それらはインド 製 が 5 製 品 生 産 国 が 不 明 なものが 2 製 品 であ った Benzidine が 検 出 された 試 料 (T-B3_O)のクロマトグラムおよび Scan 分 析 から 得 られたマススペクトル の 例 を 図 4 に 示 した Benzidine は 国 際 がん 研 究 所 (IARC)のカテゴリーで Group1 に 属 し 発 がん 性 が 確 認 されて いる 15) そして ショールやシーツ カ バー 類 は 皮 膚 に 直 接 触 れる 可 能 性 があ り かつ 基 準 値 を 超 えた benzidine 濃 度 は 非 常 に 高 濃 度 (45~593 µg/g)である ことから その 曝 露 量 評 価 などを 行 う 必 要 があると 考 えられる 以 前 に 我 々が 行 った 繊 維 製 品 に 関 す る 実 態 調 査 では インド 製 の 綿 製 品 (ラ ンチョンマット)から benzidine 3,3 -dimethoxybenzidine お よ び 2,4-diaminotoluene が 基 準 値 以 上 の 濃 度 で 検 出 されている 14) 今 回 の 調 査 では 2,4-diaminotoluene は 検 出 されなかった 基 準 値 以 下 の PAAs も 含 めて 検 出 された PAAs を 以 前 の 実 態 調 査 の 結 果 14) と 比 較 すると benzidine が 検 出 された 試 料 から は どちらからも 4-aminobiphenyl 3,3 -dimethylbenzidine お よ び 3,3 -dimethoxybenzidine が 検 出 されてい る これは benzidine を 基 本 骨 格 とする 染 料 が 使 用 されていることを 示 唆 して いるものと 考 えられる また 今 回 調 査 した 試 料 では オレンジ 紫 茶 色 紺 色 および 青 色 の 試 料 から EU 基 準 値 を 超 える PAAs が 検 出 されたが 分 析 操 作 で 緩 衝 液 を 加 えた 段 階 でそれらの 試 料 の 染 色 堅 牢 性 が 低 く 試 料 が 色 落 ちするも のが 見 受 けられた このような 現 象 は 以 前 に benzidine が 高 濃 度 で 検 出 された ランチョンマットでも 認 められており 14) これらの 試 料 には 染 色 堅 牢 性 の 低 い 直 接 染 料 が 使 用 されている 可 能 性 が 高 いものと 示 唆 された T-B3 および T-E7( 小 売 店 A) T-E1~ E4 および T-E5( 小 売 店 B) T-E6 T-E8 T-E9( 小 売 店 C)はそれぞれ 別 々の 小 売 店 から 入 手 したものである このうち 小 売 店 C については 以 前 の 実 態 調 査 で benzidine が 高 濃 度 で 検 出 されたランチ ョンマットを 購 入 した 小 売 店 と 同 一 で ある このように 別 々の 3 つの 小 売 店 から 入 手 した 製 品 から EU 基 準 値 以 上 の benzidine が 検 出 されていることや 8

13 RAPEX での 報 告 でもインド 製 のスカー フから benzidine が 検 出 されている 13) こ とから これらの 製 品 については ある 程 度 の 頻 度 で benzidine を 生 成 するアゾ 染 料 が 用 いられている 可 能 性 が 高 いと 考 えられ 曝 露 量 評 価 が 必 要 である RAPEX では 4-aminoazobenzene の 検 出 率 が benzidine 同 様 に 高 いことが 報 告 され ている 13) が 今 回 の 繊 維 製 品 の 実 態 調 査 では 分 析 操 作 で 行 っている 還 元 処 理 過 程 において 4-aminoazobenzene は aniline と 1,4-phenylenediamine に 分 解 するため 測 定 できない 16) ただし 繊 維 製 品 から 1,4-phenylenediamine が 検 出 されていな いことから 今 回 調 査 した 繊 維 製 品 には 4-aminoazobenzene は 使 用 されていない ものと 考 えられた C.2 革 試 料 革 製 品 23 製 品 (23 検 体 )について PAAs を 測 定 した それぞれの PAAs に ついて 製 品 および 検 体 中 の 検 出 頻 度 お よび 濃 度 範 囲 を 表 10 に 示 した また 検 出 された PAAs について 個 々の 検 体 中 濃 度 を 表 11 に 示 した 測 定 対 象 とし た 26 種 類 の PAAs のうち 11 種 類 が 定 量 下 限 値 以 上 で 1 検 体 以 上 検 出 された このうち EU で 規 制 されている PAAs は 9 種 類 であった 検 出 頻 度 の 高 い 順 に aniline ( 定 量 下 限 値 以 上 の 検 体 数 : 23/23) 4-chloroaniline( 同 : 10/23) 3,3 -dimethylbenzidine ( 同 : 7/23 ) 4-aminobiphenyl( 同 : 4/23) benzidine ( 同 : 4/23 ) お よ び 1,4- phenylenediamine( 同 : 3/23)であり aniline は 全 試 料 から 検 出 された( 表 10) また 4-aminoazobenzne については 前 述 のように 別 の 方 法 で 測 定 したが すべ ての 試 料 から 検 出 されなかった 検 出 さ れた PAAs のうち EU 基 準 値 を 超 えた のは o-toluidine benzidine および 3,3 -dimethylbenzidine であり それぞ れ 1 製 品 ずつから 検 出 された o-toluidine が 検 出 された 試 料 (L-C4)のクロマトグ ラムおよび Scan 分 析 から 得 られたマス スペクトルを 図 5 に 示 した 革 製 品 から EU 基 準 値 を 超 えて 検 出 さ れた PAAs の 濃 度 は o-toluidine が 430 µg/g と 非 常 に 高 く benzidine は 31 µg/g 3,3 -dimethylbenzidine は 40 µg/g であっ た 基 準 値 以 上 の PAAs が 検 出 された 革 製 品 はいずれも 革 細 工 用 の 端 切 れであ り 同 一 小 売 店 から 入 手 した 製 品 であっ た また それらの 端 切 れは 表 面 を 毛 羽 立 たせる 処 理 であるヌバック 処 理 を 摸 した 製 品 で 革 内 部 まで 染 色 されていた 革 製 品 から 検 出 された PAAs の 種 類 を 繊 維 製 品 と 比 較 す る と 1,4-phenylenediamine が 革 製 品 から 高 い 濃 度 で 検 出 された 以 外 は ほぼ 同 様 であ った 1,4-phenylenediamine については 革 製 品 では 4-aminoazobenzene について 別 の 方 法 で 分 析 し 検 出 されていないこ と か ら 1,4-phenylenediamine は 4-aminoazobenzene 由 来 ではないものと 考 えられた D.まとめ 繊 維 製 品 ならびに 革 製 品 中 のアゾ 染 料 由 来 の PAAs について 繊 維 製 品 31 製 品 (41 検 体 ) 革 製 品 23 製 品 (23 検 体 )の 実 態 調 査 を 行 った EU で 規 制 対 9

14 象 となっている 22 種 類 の PAAs のうち 繊 維 製 品 からは 12 種 類 革 製 品 からは 11 種 類 が 定 量 下 限 値 以 上 で 検 出 された そのほとんどは 1.0 µg/g 以 下 と 低 濃 度 で あったが 繊 維 製 品 では 綿 製 品 (インド 製 )7 製 品 (8 検 体 )から benzidine が EU 基 準 値 (30 µg/g)を 超 えて 検 出 され その 内 訳 はショールが 1 製 品 シーツ カバー 類 が 6 製 品 (7 検 体 )であった 一 方 革 製 品 では 革 細 工 用 の 端 切 れから o-toluidine benzidine お よ び 3,3 -dimethylbenzidine がそれぞれ 1 検 体 ずつ EU 基 準 値 を 超 過 して 検 出 された EU の 基 準 値 を 超 過 していた 各 PAAs の 濃 度 は 繊 維 製 品 から 検 出 された benzidine が 45~593 µg/g 革 製 品 から 検 出 された o-toluidine が 430 µg/g benzidine が 31 µg/g お よ び 3,3 -dimethylbenzidine が 40 µg/g であっ た ショールやシーツなどは 皮 膚 に 直 接 触 れる 可 能 性 があり それらの 製 品 から の benzidine の 曝 露 量 評 価 が 必 要 と 考 え られた E. 研 究 発 表 E.1. 論 文 発 表 なし E.2. 学 会 発 表 なし F. 知 的 所 有 権 の 取 得 状 況 F1. 特 許 取 得 なし F2. 実 用 新 案 登 録 なし F3. その 他 なし G. 引 用 文 献 1) Ahlstöm L-H., Sparr Eskilsson C. and Björklund E.: Determination of banned azo dyes in consumer goods, Trends Anal. Chem., 24, 49-56, ) Collier S.W., Strom J.E. and Bronaugh R.L.: Reduction of azo dyes during in vitro percutaneous absorption, Toxicol. Appl. Pharmacol., 118, 73-79, ) Hildenbrand S., Schmahl F.W., Wodarz R., Kimmel R. and Dartsch P.C.: Azo dyes and carcinogenic aromatic amines in cell cultures, Int. Arch. Occup. Environ. Health., 72(Suppl 3),M52-56, ) Platzek T., Lang C., Grohmann G., Gi U-S. and Baltes W.: Formation of a carcinogenic aromatic amine from an azo dye by human skin bacteria in vitro, Hum. Exp. Toxicol., 18, , ) Bafana A., Devi S.S., Chakrabarti T.: Azo dyes: past, present and future, Environ. Rev., 19, , ) Second amendment to the German Consumer Goods Ordinance, Bundesgesetzblatt, Part 1, 1994, p ) European Union: European Commission Off. J. Eur. Commun. L 243/15, ) European Union: Commission regulation (EC) No 552/2009 of 22 June 2009, amending regulation (EC) No 1907/2006 of the European parliament and of the council on the registration, evaluation, authorisation and restriction of chemicals 10

15 (REACH) as regards annex XVII 9) Oeko-Tex Standard 100: oeko-tex.com/oekotex100_public/in dex.asp?cls=02( 最 終 アクセス 日 : 平 成 24 年 3 月 28 日 ) 10) 中 華 人 民 共 和 国 国 家 品 質 監 督 検 査 検 疫 総 局 中 国 国 家 標 準 化 管 理 委 員 会 : 繊 維 製 品 使 用 禁 止 アゾ 染 料 の 測 定, 中 国 標 準 出 版 社, 北 京, ) 独 立 行 政 法 人 中 小 企 業 基 盤 整 備 機 構 : 平 成 21 年 度 情 報 調 査 業 務 繊 維 製 品 中 の 有 害 物 質 に 関 する 調 査 事 業, material_/common/chushou/b_keiei/keie iseni/pdf/ pdf ( 最 終 アクセス 日 : 平 成 24 年 3 月 28 日 ) 12) 財 団 法 人 日 本 環 境 協 会 エコマー ク 事 務 局 : /nintei.html( 最 終 アクセス 日 : 平 成 24 年 3 月 28 日 ) 13) RAPEX: ers/dyna/rapex/rapex_archives_en.cfm ( 最 終 アクセス 日 : 平 成 24 年 3 月 28 日 ) 14) Kawakami T., Isama K., Nakashima H., Tsuchiya T., Matsuoka A.: Analysis of primary aromatic amines originated from azo dyes in commercial textile products in Japan, J. Environ. Sci. Health, Part A., 45, , ) IARC (International Agency for Research on Cancer): iarc.fr/eng/classification/index.php( 最 終 アクセス 日 : 平 成 24 年 3 月 28 日 ) 16) European Union: EN :2003, Textiles - Methods for the determination of certain aromatic amines derived from azo colorants- Part 1: Detection of the use of certain azo colorants accessible without extraction, ) European Union: EN ISO 2418: 2002, Leather Chemical, physical, mechanical and fastness tests Sampling location, ) European Union: EN :2010, Leather Chemical tests for the determination of certain azo colorants in dyed leathers, Part 1: Determination of certain aromatic amines derived from azo colortants (ISO :2010), ) European Union: EN ISO : 2011, Leather Chemical tests for the determination of certain azo coloratnts in dyed leathers, Part 2: Determination of 4-aminoazobenzene (ISO : 2011), ) 井 上 嘉 則 : 測 定 の 信 頼 性 と 精 度 管 理, 環 境 測 定 絵 とき 基 本 用 語 (YAN 環 境 測 定 技 術 委 員 会 編 ), オーム 社, 東 京, p52-65,

16 a 表 1. RAPEXにおける 製 品 別 のPAAs 違 反 件 数 報 告 年 製 品 分 類 (Category) 製 品 名 (Products) 件 数 ( 製 品 数 ) b 2010 Clothing, textiles and fashion items Scarf 8(10) Socks 2(4) Men's shoes 2 T-shirt 1(2) Baby sling 1 Baseball cup 1 Bed linen 1 Children's pyjamas 1 Children's outfit 1 Children's sweatshirt 1 Children's track suit 1 Cushion cover 1 Dress 1 Fleece blanket 1 Gloves 1 Jeans 1 Ladies' boots 1 Pullover 1 Purse 1 Sweatshirt for boys 1 Trousers 1 Women's blouse 1 Women's boots 1 Toys Children's costume 1 Children's pirate costume 1 Finger puppet 1 Childcare articles and children's equipment Baby shoes 1 Decorative articles Christmas socks 1 Hobby, sports equipment Sleeping bag 1 計 38(43) 2011 Clothing, textiles and fashion items Scarf 5 T-shirt 3 Dress 3 Hand bag 2 Boys' underwear 2 Blouse 2 Bed spreads, and cushion cover 1(3) Pashmina-style scarf 1(2) Baby shoes 1 Bag 1 Bed linen 1 Children's cardigan 1 Children's Jacket 1 Children's sweat shirts 1 Denim dress with belt 1 Jeans 1 Men's shorts 1 Sports shoes 1 Towel 1 Trilby hat 1 Women's Jacket 1 Women's Top 1 Toys Fancy dress costume 1 Finger puppets 1 計 35(38) a 製 品 分 類 (Category)および 製 品 名 (Products)の 内 訳 表 記 は 原 文 のまま b 1つの 報 告 の 中 に 複 数 の 製 品 の 記 載 があるため 12

17 表 2. RAPEXにおける 生 産 国 別 のPAAs 違 反 件 数 報 告 年 生 産 国 報 告 件 数 ( 製 品 数 ) a 2010 China 20(22) India 8(10) Philippins 2 Bangladesh 1 Bulgaria 1 Guatemara 1 France 1 Unknown 4(5) 2011 China 17 India 9(12) Bangladesh 3 Greece 1 Syria 1 Unknown 4 a 1つの 報 告 の 中 に 複 数 の 製 品 の 記 載 があるため a 表 3. RAPEXで 検 出 が 報 告 されたPAAsの 種 類 別 報 告 件 数 およびその 濃 度 範 囲 報 告 年 検 出 化 合 物 報 告 件 数 濃 度 範 囲 (μg/g) 2010 Benzidine Aminoazobenzene ,3'-Dimethoxybenzidine ,3'-Dimethylbenzidine ,4-Diaminotoluene Chloro-o-toluidine ,4'-Methylenedi-o-toluidine ,4'-Methylene-bis-(2-chloro-aniline) ,4'-Oxydianiline Azo dye b Benzidine Aminoazobenzene ,3'-Dimethoxybenzidine Aminobiphenyl ,4-Diaminotoluene ,3'-Dimethylbenzidine Chloroaniline ,4'-Methylenedianiline o-toluidine a 濃 度 の 記 載 が 無 いもの 等 を 除 いた b 詳 細 不 明 13

18 表 4. 対 象 化 合 物 の 名 称 CAS 番 号 化 学 構 造 など No. Name CAS No. Chemical structure REACH IARC Annex XVII a) Group b) Supplier c) 1 4-Aminobiphenyl NH 2 1 A 2 Benzidine H 2 N NH 2 1 A 3 4-Chloro-o-toluidine C H 3 H 2 N Cl 2A B 4 2-Naphthylamine NH 2 1 A 5 o-aminoazotoluene H (Solvent Yellow 3) 3 C H 3 C 6 5-Nitro-o-toluidine H 2 N NO 2 N N NH 2 CH 3 2B 3 B B 7 4-Chloroaniline H N Cl 2 + 2B C 8 2,4-Diaminoanisole H 3 C O H 2 N NH 2 2B D 9 4,4'-methylenedianiline B H 2 N NH ,3'-Dchlorobenzidine B 11 3,3'-Dimethoxybenzidine B H 2 N Cl Cl NH 2 H 3 C O O CH 3 H 2 N NH 2 D C D 12 3,3'-Dimethylbenzidine B H 2 N H 3 C CH 3 NH 2 C H 3 C CH 3 4,4'-Methylenedi-otoluidine B H 2 N NH 2 B a) REACH Annex XVIIによって 指 定 されている 化 合 物 b) IARC clasification groups: 1 = Carcinogenic to humans, 2A = Probably carcinogenic to humans, 2B = Possibly carcinogenic to humans, 3 = Not classifiable as to carcinogenic to humans 15) c) A: SUPELCO, B: Sigma-Aldrich, C: AccuStandard Inc., D: 和 光 純 薬 工 業, E: Fulka, F: 東 京 化 成 工 業 14

19 表 4. 対 象 化 合 物 の 名 称 CAS 番 号 化 学 構 造 など( 続 き) REACH IARC No. Name CAS No. Chemical structure Annex XVII a) Group b) Supplier c) 14 p-cresidine B H 3 C O H 2 N CH 3 D 4,4'-Methylene-bis-( chloro-aniline) 16 4,4'-Oxydianiline B Cl H 2 N H 2 N O Cl NH 2 NH 2 B B 17 4,4'-Thiodianiline H 2 N S NH 2 2B D CH 3 NH 2 18 o-toluidine D 19 2,4-Diaminotoluene H 3 C H 2 N NH 2 2B C H 20 2,4,5-Trimethylaniline N CH 3 + H 3 C 3 C CH 3 21 o-anisidine H 3 C O NH 2 2B D 22 4-Aminoazobenzene H 2 N N N + 2B (Solvent Yellow 1) 23 2,4-Xylidine H 3 C H 2 N CH 3 E F 24 2,6-Xylidine H 3 C NH 2 CH 3 2B F 25 Aniline H 2 N - 3 D 26 1,4-Phenylenediamine H N NH - 3 F 2 2 a) REACH Annex XVIIによって 指 定 されている 化 合 物 b) IARC clasification groups: 1 = Carcinogenic to humans, 2A = Probably carcinogenic to humans, 2B = Possibly carcinogenic to humans, 3 = Not classifiable as to carcinogenic to humans 15) c) A: SUPELCO, B: Sigma-Aldrich, C: AccuStandard Inc., D: 和 光 純 薬 工 業, E: Fulka, F: 東 京 化 成 工 業 15

20 表 5. 繊 維 製 品 試 料 の 用 途 試 料 名 色 生 産 国 および 素 材 a 用 途 試 料 名 色 a 生 産 国 素 材 装 身 具 バンダナ T-A1 赤 中 国 綿 T-A2 青 紫 中 国 綿 T-A3 紺 色 中 国 綿 T-A4 赤 インドネシア 綿 T-A5 紫 インドネシア 綿 スカーフ T-B1 オレンジ 不 明 シルク T-B2 青 紫 不 明 シルク ショール T-B3(SB YG O) 水 色 (SB) 黄 緑 (YG) オレンジ(O) 不 明 綿 衣 類 T-シャツ T-C1 赤 中 国 綿 T-C2 紺 色 中 国 綿 子 供 用 半 袖 T-シャツ T-C3 ピンク 中 国 綿 T-C4 黄 色 中 国 綿 T-C5 紫 中 国 綿 T-C6 青 中 国 綿 T-C7 オレンジ 中 国 綿 T-C8 薄 紫 中 国 綿 子 供 服 T-C9 紺 色 インド 綿 T-C10 ピンク インド 綿 男 児 ブリーフ T-D1 黒 中 国 綿 T-D2(BL R) 黒 (BL) 赤 (R) 中 国 綿 トランクス T-D3 赤 インドネシア 綿 T-D4 黒 インドネシア 綿 シーツ カバー 類 マルチカバー T-E1 オレンジ インド 綿 T-E2 紫 インド 綿 T-E3 黄 色 インド 綿 T-E4 赤 インド 綿 枕 カバー T-E5(V O) 紫 (V) オレンジ(O) インド 綿 T-E6(G Y B V) 緑 (G) 黄 色 (Y) 青 (B) 紫 (V) インド 綿 シーツ T-E7(DB B SB ST) こげ 茶 (DB) 青 (B) 空 色 (SB) スティールブルー(ST) 不 明 綿 T-E8 オレンジ インド 綿 T-E9 紺 色 インド 綿 a 括 弧 内 は 色 別 に 検 体 とした 際 の 検 体 名 16

21 表 6. 革 製 品 試 料 の 用 途 試 料 名 生 産 国 色 および 素 材 用 途 試 料 名 色 生 産 国 素 材 小 物 類 グローブ L-A1 黒 中 国 羊 革 L-A2 ベージュ 中 国 豚 革 ベルト L-A3 赤 中 国 天 然 皮 革 L-A4 明 るい 茶 色 中 国 天 然 皮 革 リストバンド L-A5 赤 不 明 革 L-A6 水 色 不 明 革 財 布 L-B1 エンジ タイ 牛 革 L-B2 オレンジ タイ 牛 革 キーホルダー L-B3 赤 韓 国 革 ベースネックホルダー L-B4 オレンジ 不 明 牛 革 革 細 工 用 端 切 れ ヌバック 風 革 ハギレ L-C1 赤 不 明 牛 革 L-C2 深 緑 不 明 牛 革 L-C3 紺 不 明 牛 革 L-C4 青 紫 不 明 牛 革 端 革 ハギレ L-C5 こげ 茶 色 不 明 革 L-C6 黒 不 明 革 L-C7 エンジ 不 明 革 L-C8 青 不 明 革 L-C9 茶 色 不 明 革 L-C10 濃 緑 不 明 革 L-C11 こげ 茶 色 不 明 革 L-C12 紺 不 明 革 L-C13 黒 不 明 革 17

22 表 7. 対 象 化 合 物 の 保 持 時 間 定 量 イオン 定 性 イオン 検 出 下 限 値 定 量 下 限 値 および 液 々 抽 出 による 回 収 率 a a 保 持 時 間 定 量 イオン 定 性 イオン 検 出 下 限 値 定 量 下 限 値 液 々 抽 出 (n=5) b 測 定 対 象 化 合 物 b 目 標 回 収 率 (min) (m/z) (m/z) (μg/g) (μg/g) 回 収 率 (%) 変 動 係 数 (%) Aniline o-toluidine % 2,4-Xylidine ,6-Xylidine o-anisidine % 4-Chloroaniline % p-cresidine % 2,4,5-Trimethylaniline % 1,4-Phenylenediamine Chloro-o-toluidine % 2,4-Diaminotoluene % 2,4-Diaminoanisole % 2-Naphthylamine % 5-Nitro-o-toluidine Aminobiphenyl % 4-Aminoazobenzene ,4'-Oxydianiline % 4,4'-Methylenedianiline % Benzidine % o-aminoazotoluene ,4'-Methylenedi-o-toluidine % 3,3'-Dimethylbenzidine % 4,4'-Thiodianiline % 4,4'-Methylene-bis-(2-chloro-aniline) % 3,3'-Dichlorobenzidine % 3,3'-Dimethoxybenzidine % Naphthalene-d8 c ,4,5-Trichloroaniline c Anthracene-d10 c a b EN : 2003の 方 法 に 準 拠 ( 革 製 品 中 の4-aminoazobenzeneについては 別 途 EN ISO :2011に 従 い 試 験 した[n=5 回 収 率 99% 変 動 係 数 1.4%]) c 低 濃 度 (0.01 μg/ml: 1,4-phenylendiamine 2,4-diaminotolueneおよび2,4-diaminoanisoleについては0.1 μg/ml) 標 準 溶 液 の 繰 り 返 し3 回 測 定 時 の 標 準 偏 差 に3.3 および10を 乗 じて 実 試 料 換 算 した 値 を 検 出 および 定 量 下 限 値 とした 内 部 標 準 物 質 (naphthalene-d8: aniline to 2,4-diaminotoluene, 2,4,5-trichloroaniline: 2,4-diaminoanisole and 2-naphthylamine, anthracene-d10: 5-nitro-o-toluidine to 3,3'-dimethoxybenzidine) 18

23 表 8. 繊 維 製 品 から 定 量 下 限 値 以 上 で 検 出 された 対 象 化 合 物 の 製 品 数 検 体 数 および 濃 度 範 囲 対 象 化 合 物 a 繊 維 製 品 製 品 数 検 体 数 濃 度 範 囲 (μg/g) Aniline o-toluidine ,4-Xylidine 1 2 tr b ,6-Xylidine c o-anisidine 4 6 tr Chloroaniline 9 15 tr p-cresidine ,4,5-Trimethylaniline ,4-Phenylenediamine Chloro-o-toluidine 0 0-2,4-Diaminotoluene 0 0-2,4-Diaminoanisole Naphthylamine Nitro-o-toluidine Aminobiphenyl Aminoazobenzene 0 0-4,4'-Oxydianiline 0 0-4,4'-Methylenedianiline Benzidine 9(7) 11(8) o-aminoazotoluene 0 0-4,4'-Methylenedi-o-toluidine 0 0-3,3'-Dimethylbenzidine ,4'-Thiodianiline 0 0-4,4'-Methylene-bis-(2-chloro-aniline) 0 0-3,3'-Dichlorobenzidine 0 0-3,3'-Dimethoxybenzidine a 括 弧 内 はEU 基 準 値 (30 μg/g)を 超 えた 製 品 数 および 検 体 数 b tr: 検 出 下 限 値 以 上 定 量 下 限 値 未 満 c -: 不 検 出 19

24 表 9. 繊 維 製 品 中 で 検 出 されたPAAsの 濃 度 (μg/g) a Aniline o-toluidine 2,4- Xylidine o-anisidine 4-Chloroaniline p-cresidine 2,4,5- Trimethylaniline 2-Naphthylamine 4-Aminobiphenyl Benzidine 3,3'- Dimethylbenzidine 3,3'- Dimethoxybenzidine Munsell Color b T-A T-A2 1.1 tr d T-A T-A4 c T-A5 T-B T-B T-B3_SB T-B3_YG T-B3_O YR 4/8 T-C T-C T-C T-C4 T-C5 T-C6 tr T-C7 tr T-C8 T-C T-C T-D T-D2_BL 3.0 T-D2_R T-D3 T-D T-E YR 5/8 T-E PB 3/4 T-E T-E tr tr R 4/8 T-E5_O T-E5_V T-E6_B T-E6_G T-E6_V 0.50 tr T-E6_Y 0.78 tr T-E7_B PB 4/6 T-E7_DB PB 2/1 T-E7_SB T-E7_ST T-E R 6/10 T-E PB 2/4 a 赤 字 はEU 基 準 値 (30 μg/g)を 超 えた 検 体 b Munsell color systemによる 分 類 : 色 相 (Hue) 明 度 (Value)/ 彩 度 (Chroma) c : 不 検 出 d tr: 検 出 下 限 値 以 上 定 量 下 限 値 未 満 20

25 a 表 10. 革 製 品 から 定 量 下 限 値 以 上 で 検 出 された 対 象 化 合 物 の 製 品 数 検 体 数 および 濃 度 範 囲 対 象 化 合 物 革 製 品 製 品 数 濃 度 範 囲 (μg/g) Aniline o-toluidine 2(1) ,4-Xylidine 0 - b 2,6-Xylidine 0 - o-anisidine 0-4-Chloroaniline p-cresidine ,4,5-Trimethylaniline 0-1,4-Phenylenediamine Chloro-o-toluidine 0-2,4-Diaminotoluene 0-2,4-Diaminoanisole 0-2-Naphthylamine Nitro-o-toluidine 0-4-Aminobiphenyl Aminoazobenzene 0-4,4'-Oxydianiline 0-4,4'-Methylenedianiline 0 - Benzidine 4(1) o-aminoazotoluene 0-4,4'-Methylenedi-o-toluidine 0-3,3'-Dimethylbenzidine 7(1) ,4'-Thiodianiline ,4'-Methylene-bis-(2-chloro-aniline) 0-3,3'-Dichlorobenzidine 0-3,3'-Dimethoxybenzidine 1 15 a 括 弧 内 はEU 基 準 値 (30 μg/g)を 超 えた 製 品 数 および 検 体 数 b -: 不 検 出 21

26 表 11. 革 製 品 中 で 検 出 されたPAAsの 濃 度 (μg/g) a Aniline o-toluidine 4-Chloroaniline p-cresidine 1,4- Phenylenediamine 2-Naphthylamine 4-Aminobiphenyl Benzidine 3,3'- Dimethylbenzidine 4,4'- Thiodianiline 3,3'- Dimethoxybenzidine Munsell Color b a L-A1 587 c L-A2 22 L-A3 1.7 L-A L-A L-A L-B L-B L-B L-B L-C R 3/10 L-C L-C PB 2/2 L-C PB 2/8 L-C L-C L-C L-C L-C9 61 L-C L-C L-C L-C 赤 字 はEU 基 準 値 (30 μg/g)を 超 えた 検 体 b Munsell color systemによる 分 類 : 色 相 (Hue) 明 度 (Value)/ 彩 度 (Chroma) c : 不 検 出 22

27 繊 維 試 料 を 色 材 質 別 などに 分 離 繊 維 試 料 を 細 切 後 1 g 精 秤 試 料 を 反 応 容 器 に 入 れる 70±2 のクエン 酸 緩 衝 液 17 mlを 反 応 容 器 に 加 え 70±2 にて30 分 間 保 温 ハイドロサルファイト 水 溶 液 ( 200 mg/ml)を3 ml 加 え 70±2 にて30 分 間 保 温 2 分 以 内 に 室 温 まで 冷 却 吸 引 濾 過 20 mlのmtbeで30 分 間 抽 出 (2 回 ) 有 機 溶 媒 相 を 分 取 し 無 水 硫 酸 ナトリウムにて 脱 水 ロータリーエバポレーターで 約 1 mlまで 濃 縮 ( 湯 浴 温 度 30 以 下 ) 10 mlのメスフラスコに 試 料 を 移 し 定 容 1 mlの 試 料 溶 液 を 分 取 し 内 部 標 準 物 質 を 含 むMTBE 溶 液 50 μl(2 μg/ml)を 加 える GC/MS 測 定 図 1. 繊 維 製 品 中 の PAAs 分 析 法 23

28 革 試 料 を 細 切 し 目 開 き4 mmの 篩 を 通 過 させる 篩 別 した 試 料 1 gを 精 秤 し 反 応 容 器 に 入 れる 20 mlヘキサンを 加 え 40 で20 分 間 超 音 波 処 理 し ヘキサン 相 をデカンテーションで 除 去 (2 回 ) 残 留 ヘキサンを 反 応 容 器 の 口 を 開 けてドラフト 内 で 一 晩 放 置 して 除 去 70±2 のクエン 酸 緩 衝 液 17 mlを 反 応 容 器 に 加 え 70±2 にて25 分 間 保 温 ハイドロサルファイト 水 溶 液 (200 mg/ml)を1.5ml 加 え 70±2 にて10 分 間 保 温 もう 一 度 ハイドロサルファイト 水 溶 液 を1.5 ml 加 え 70±2 にて10 分 間 保 温 2 分 以 内 に 室 温 まで 冷 却 吸 引 濾 過 20 mlのmtbeで30 分 間 抽 出 (2 回 ) 有 機 溶 媒 相 を 分 取 し 無 水 硫 酸 ナトリウムにて 脱 水 ロータリーエバポレーターで 約 1mlまで 濃 縮 ( 湯 浴 温 度 30 以 下 ) 10 mlのメスフラスコに 試 料 を 移 し 定 容 1 mlの 試 料 溶 液 を 分 取 し 内 部 標 準 物 質 を 含 むMTBE 溶 液 50 μl(2 μg/ml)を 加 える GC/MS 測 定 図 2. 革 製 品 中 の PAAs 分 析 法 (4-aminoazobenzene は 除 く) 24

29 革 試 料 を 細 切 し 目 開 き4 mmの 篩 を 通 過 させる 篩 別 した 試 料 1 gを 精 秤 し 反 応 容 器 に 入 れる 20 mlヘキサンを 加 え 40 で20 分 間 超 音 波 処 理 し ヘキサン 相 をデカンテーションで 除 去 (2 回 ) 残 留 ヘキサンを 反 応 容 器 の 口 を 開 けてドラフト 内 で 一 晩 放 置 して 除 去 9 mlの2%( 重 量 %) 水 酸 化 ナトリウム 水 溶 液 を 加 え 試 料 が 十 分 に 濡 れるまで 振 とう ハイドロサルファイト 水 溶 液 (200 mg/ml)を1 ml 加 え 40±2 にて30 分 間 保 温 流 水 を 用 いて1 分 以 内 に 室 温 まで 冷 却 反 応 容 器 に10 μg/mlの 内 部 標 準 物 質 を 含 むMTBE 溶 液 を 加 える 5 分 以 内 反 応 容 器 に5 mlのmtbe 溶 液 および7 gの 塩 化 ナトリウムを 加 える 45 分 間 振 とう 抽 出 3000rpmで10 分 間 遠 心 分 離 有 機 溶 媒 相 を 分 取 し 無 水 硫 酸 ナトリウムにて 脱 水 GC/MS 測 定 図 3. 革 製 品 中 の 4-aminoazobenzene 分 析 法 25

30 a benzidine b3_o-scan #4042 RT: AV: 1 SB: NL: 5.84E7 T: + c Full ms [ ] b 184 (M + ) 85 Intensity Relative abundance (%) Relative Abundance Time (min) m/z m/z 200 図 4. Benzidine が 高 濃 度 で 検 出 された 試 料 (T-B3_O)の(a)トータルイオンクロマトグラム (SIM モード)および(b)Scan 分 析 (m/z=60~300)で 得 られた benzidine のマススペクトル a o-toluidine l-c4_scan #1280 RT: AV: 1 SB: NL: 3.22E8 T: + c Full ms [ ] b 106 (M + ) Intensity Relative abundance (%) Relative Abundance Time (min) m/z m/z 120 図 5. o-toluidine が 高 濃 度 で 検 出 された 試 料 (L-C4)の(a)トータルイオンクロマトグラム(SIM モード)および(b) Scan 分 析 (m/z=60~300)で 得 られた o-toluidine のマススペクトル 26

31 参 考 別 表 1 各 国 の 繊 維 製 品 におけるPAAsへの 対 応 及 び 各 自 主 基 準 (Oeko-Tex Standard 100)について a 国 名 等 規 制 区 分 基 準 値 PAAs 分 析 法 検 出 下 限 値 備 考 日 本 法 規 制 無 し 米 国 法 規 制 無 し b EU REACH c 30 mg/kg 以 下 22 種 類 d EN :2003 EN : mg/kg 分 析 法 は2012 年 3 月 改 訂 予 定 ISOに 国 際 標 準 化 提 案 されている 中 国 GB18401:2003 繊 維 製 品 に 関 する 国 家 一 般 安 全 技 術 規 範 e 20 mg/kg 24 種 類 (EU22 種 類 +2,4-xylidineお よび2,6-xylidine) GB/T mg/kg 分 析 法 は2006 年 に 改 訂 規 制 PAAsを23 種 類 と 表 記 する 報 告 書 もあり 確 認 が 必 要 韓 国 品 質 経 営 及 び 工 産 品 安 全 管 理 法 30 mg/kg 以 下 KS K0147およびKS K0734に 基 づく 染 色 製 品 について 実 施 規 制 PAAsは 中 国 と 同 等 ベトナム 法 規 制 あり( 法 令 名 は 不 明 ) 22 種 類 d TCVN7619-1:2007 TCVN7619-2: 年 11 月 より 施 行 分 析 法 はEUと 同 じ タイ 法 規 制 無 し( 任 意 規 定 :タイ 国 基 準 No 衣 類 (Fabrics): 有 害 染 料 と 化 学 物 質 からの 安 全 ) 30 mg/kg 以 下 24 種 類 (EU22 種 類 +2,4-xylidineお よび2,6-xylidine) Oeko-Tex Standard 100 自 主 基 準 20 mg/kg 以 下 24 種 類 (EU22 種 類 +2,4-xylidineお よび2,6-xylidine) 非 開 示 定 量 下 限 値 20 mg/kg 欧 州 を 中 心 に 世 界 中 で 用 いられている エコマーク 自 主 基 準 30 mg/kg 以 下 24 種 類 (EU22 種 類 +2,4-xylidineお よび2,6-xylidine) 日 本 a 大 部 分 は 引 用 文 献 10) 独 立 行 政 法 人 中 小 企 業 基 盤 整 備 機 構 : 平 成 21 年 度 情 報 調 査 業 務 繊 維 製 品 中 の 有 害 物 質 に 関 する 調 査 事 業 を 基 にして 作 成 した b ベンジジンを 含 む 染 料 が1970 年 代 より 製 造 使 用 禁 止 されているが 染 色 品 の 輸 入 は 規 制 されていない c REACH Annex XVII (REACH 発 効 前 はEU Directive 2002/61/EC) d 表 4 参 照 e 法 律 ではないが 法 と 同 等 の 強 制 力 を 持 つ 27

32 28

33 ( 資 料 1) Analysis of primary aromatic amines originated from azo dyes in commercial textile products in Japan Tsuyoshi Kawakami, Kazuo Isama, Harunobu Nakashima, Toshie Tsuchiya, Atsuko Matsuoka Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering Volume 45, Issue 10, Pages (2010) 29

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35 Journal of Environmental Science and Health Part A (2010) 45, Copyright C Taylor & Francis Group, LLC ISSN: (Print); (Online) DOI: / Analysis of primary aromatic amines originated from azo dyes in commercial textile products in Japan TSUYOSHI KAWAKAMI 1,3, KAZUO ISAMA 1,3, HARUNOBU NAKASHIMA 2, TOSHIE TSUCHIYA 1 and ATSUKO MATSUOKA 1 1 Division of Medical Devices, National Institute of Health Sciences, Tokyo, Japan 2 Life and Hygiene Division, Department of Environmental Health, Osaka Prefectural Institute of Public Health, Osaka, Japan 3 Present address: Division of Environmental Chemistry, National Institute of Health Sciences, Tokyo, Japan The purpose of this study was to clarify the actual condition of 26 types of carcinogenic primary aromatic amines (PAAs) originated from azo dyes in commercial textile products in Japan. In the case of textiles made of various fibers of various colors, the fibers were separated by color and analyzed. A total of 86 textile products (117 samples) were analyzed. Twenty-one kinds of PAAs were detected in the samples and almost all the PAAs were detected at low concentrations. However, the concentrations of benzidine, 3,3 -dimethoxybenzidine, and 2,4-diaminotoluene ( µgg 1 ) in placemats made of cotton were found to exceed EU regulation limits of 30 µg g 1. Although such placemats do not always come into contact with the user s skin, it is thought that they should be handled more carefully. Finally, 7 products (8 samples) contained PAAs at concentrations that exceeded the regulation limits. Two sample preparation methods (with and without solvent extraction) were performed on the same sample in order to compare the PAAs in samples in which it is difficult to separate the component materials, such as a cotton fabric that contained polyester fibers. In a comparison of the results obtained from the two methods, it was observed that the concentrations and/or kinds of PAAs detected in the samples were different. It was therefore thought that textile products that present this particular challenge should be analyzed by both methods. Keywords: Aromatic amine, azo dye, textile products, solvent extraction, reduction. Introduction Azo dyes have been widely used in many industrial products since the second half of the 19th century on account of their wide variety of available colors and low cost. At present, three thousand azo dyes are used worldwide and they constitute more than 65% of the global commercial dye market. [1] As one of the most popular dye groups in the world, azo dyes are used as colorants for a variety of consumable products such as papers, textiles, toys, leather goods, food items, and cosmetics, among others. [1] However, certain types of azo dyes are degraded by the liver, microorganisms on the skin and intestinal bacteria under reductive conditions. On account of these reductive reactions, carcinogenic primary aromatic amines (PAAs) are generated. [2 4] For these reasons, in 1994, the German Government enacted a second amendment to the German Address correspondence to Tsuyoshi Kawakami, Division of Environmental Chemistry, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo , Japan. tkawa@nihs.go.jp Received February 23, Consumer Goods Ordinance that banned the use of certain azo dyes in consumer goods that can potentially come into direct, long-term contact with human skin. According to this amendment, the azo dyes that are degraded by reduction and that generate the 20 kinds of PAAs listed in the Ordinance were banned for the first time (regulation limit: below 30 µg g 1 ). [5] Since 1999, the European Union (EU) has explored the restriction of azo dye usage, and in 2002, it published the 19th amendment to the Council Directive 76/69/EEC (related to restrictions on the marketing and use of certain dangerous substances and preparations). [6] This EU Directive banned the 20 kinds of PAAs listed in the German Ordinance that are found in textile products that can potentially come into direct contact with human skin. Two specific kinds of PAAs (o-anisidine and 4-aminoazobenzene) were also banned at the same time (thus, 22 kinds of PAAs were ultimately banned), and the regulation limit of these amines was established below at 30 µg g 1. [6] In addition to the 22 kinds of PAAs listed by the EU, 2 kinds of PAAs (2,4- and 2,6-xylidine) were prohibited in China by the National Standard for the People s Republic of China (GB/T : below 20 µgg 1 ). [7]

36 1282 Kawakami et al. The Oeko-Tex R Standard 100 and Eco Mark schemes have voluntary regulations for textile products, and they have also limited the use of these 24 kinds of amines. [8,9] However, few investigations into the amounts of PAAs in actual commercial products have been carried out [10 12] although the amounts of PAAs in migration solution from paper products, [10] plastic laminates, and cooking utensils [11,12] have been investigated. An investigation into the use of these PAAs in commercial textile products is therefore necessary. The purpose of this study is to clarify the amount of PAAs generated from the reduction of azo dyes in commercial textile products in Japan. In this study, the abovementioned 24 kinds of PAAs that are used in commercial textile products were investigated. In addition, 2 kinds of PAAs (aniline and 1,4-phenylenediamine) were analyzed because their analysis is recommended in the EU. Thus, a total of 26 kinds of PAAs were investigated (Table 1). Materials and methods Samples Commercial textile products were purchased from several retail stores in Japan between January and March They were divided into classes on the basis of usage, color, material, and country of manufacture (Table 2). In the case of textiles made of fibers of various colors, these fibers were separated as much as possible. However, these fibers could not be separated in the case of textiles composed of different materials of the same color, e.g., a densely woven textile composed of cotton and polyester. Therefore, such samples were analyzed by two sample preparation methods (the details of these extraction methods are provided below). Thus, a total of 86 textile products (117 samples) were analyzed. Materials The details of the 26 kinds of PAAs investigated in this study are listed in Table 1. Naphthalene-d 8 and anthracened 10, which were obtained from Kanto Chemical Co., Inc., and 2,4,5-trichloroaniline, which was obtained from Wako Pure Chemical Industries Ltd., were used as internal standards for gas-chromatography/mass-spectrometry (GC/MS) analysis. The pesticide residue-grade methyl tertbutyl ether (MTBE) and methanol were obtained from Wako Pure Chemical Industries Ltd. Chlorobenzene, citrate acid, and sodium dithionite were obtained from Sigma- Aldrich. The diatomaceous column (Chemelute, 20 ml) were obtained from Varian. The citrate buffer solution used for sample processing was adjusted to ph 6.0 (0.06 mol L 1 as citrate acid). A sodium dithionite solution (200 mg ml 1 ) was prepared immediately before use. Sample processing The samples were processed using the following two standard European methods with minor modifications: EN (without solvent extraction, particularly for textiles made of cellulose and protein fibers) [14] and EN (with solvent extraction, particularly for textiles made of synthetic fibers such as polyester). [15] Fifteen samples were analyzed by these two methods to compare the different effects of sample preparation. During the processing of these samples, o-aminoazotoluene and 5-nitro-o-toluidine were further reduced to o-toluidine and 2,4-diaminotoluene, respectively. [14,15] In addition, 4-aminoazobenzene generated aniline and 1,4-phenylenediamine under the reaction conditions used in these methods. [14,15] In accordance with EN , each textile sample was cut in an appropriate manner and 1.00 g of the sample was weighed and placed in a reaction tube. To this tube, 17 ml of citrate buffer solution preheated to 70 ± 2 C was added. After being shaken by hand, the reaction tube was kept for 30 min at 70 ± 2 C. Subsequently, 3 ml of aqueous sodium dithionite solution was added to bring about the reductive cleavage of the azo group. The reaction tube was shaken vigorously by hand and immediately kept again for 30 min at 70 ± 2 C. After 30 min, the reaction tube was cooled to room temperature within 2 min. After cooling, this sample solution was filtered and transferred to a separating funnel. Then, 20 ml of MTBE was added to the sample solution, the mixture was shaken by hand for 5 min, and the MTBE layer was separated from the aqueous phase. This extraction procedure was performed twice and the MTBE layer was combined and filtered through anhydrous sodium sulfate. The filtrate was concentrated to approximately 1 ml with a rotary evaporator keeping the temperature of the water bath below 30 C. Next, the volume of the sample solution was adjusted to 5 ml with MTBE. Then, 50 µl of MTBE solution containing 2 µg ml 1 of internal standard was added to 1 ml of the sample solution, and this solution was then analyzed by GC/MS. In accordance with EN , the textile sample was cut in an appropriate manner. Then, 1.00 g of the sample was weighed and hung by inert material in the extractor to soak the condensed extraction solvent, which was not in direct contact with the boiling solvent. For reflux extraction, 70 ml of chlorobenzene was used, and the extraction procedure was performed for 25 min. In the case of insufficient decolorization, the extraction time was increased. After this extraction procedure, the extracted solution was cooled to room temperature and concentrated to approximately 1 ml with a rotary evaporator, with the temperature of the water bath kept below 45 C. The sample was transferred to a reaction tube with methanol using an ultrasonic bath to disperse the sample as required. The solvent in the reaction tube was removed by a gentle stream of N 2, with the temperature of the water bath kept below 65 C. The residue was dissolved in 2 ml

37 Analysis of primary aromatic amines in textile 1283 Table 1. Physical and chemical properties and some characteristics of the investigated PAAs. EU IARC No. Name CAS No. Chemical structure Properties Directive a) Group b) Supplier c) 1 4-Aminobiphenyl M.W m.p.: 53 C, b.p.: 302 C pka A 2 Benzidine M.W m.p.: 128 C, b.p.: 401 C pka Chloro-o-toluidine M.W m.p.: C,b.p.:241 C pka A + 2A B 4 2-Naphthylamine M.W pka A 5 o-aminoazotoluene (Solvent Yellow 3) M.W m.p.: C pka B B 6 5-Nitro-o-toluidine M.W m.p.: C pka Chloroaniline M.W m.p.: 72.5 C, b.p.: 232 c pka ,4-Diaminoanisole M.W m.p.: 67 C pka ,4 -methylenedianiline M.W m.p.: 93 C, b.p.: C pka ,3 -Dichlorobenzidine M.W m.p.: 133 C, b.p.: 368 C pka ,3 -Dimethoxybenzidine M.W m.p.: C pka ,3 -Dimethylbenzidine M.W m.p.: 129 C, b.p.: 200 C pka ,4 -Methylenedi-otoluidine M.W m.p.: 149 C pka p-cresidine M.W m.p.: 53 C, b.p.: 235 C pka B + 2B C + 2B D + 2B D + 2B C + 2B D + 2B C + 2B B + 2B D 15 4,4 -Methylene-bis-(2- chloro-aniline) M.W m.p.: 110 C pka B 16 4,4 -Oxydianiline M.W m.p.: C,b.p.: 190 C pka ,4 -Thiodianiline M.W m.p.: 108 C pka B B + 2B D (Continued on next page)

38 1284 Kawakami et al. Table 1. Physical and chemical properties and some characteristics of the investigated PAAs. (Continued) EU IARC No. Name CAS No. Chemical structure Properties Directive a) Group b) Supplier c) 18 o-toluidine M.W m.p.: C, b.p.: C pka ,4-Diaminotoluene M.W m.p.: 99 C, b.p.: 292 C pka ,4,5-Trimethylaniline M.W m.p.: 68 C, b.p.: 234 C pka A D + 2B C + 3 C 21 o-anisidine M.W m.p.: 6.2 C, b.p.: 225 C pka Aminoazobenzene (Solvent Yellow 1) M.W m.p.: 12.4 C pka ,4-Xylidine M.W m.p.: 26 C, b.p.: 226 C 24 2,6-Xylidine M.W m.p.: 10 C, b.p.: 216 C + 2B D + 2B E 3 F 2B F 25 Aniline M.W D 26 1,4-Phenylenediamine M.W m.p.: 145 C, b.p.: 267 C 3 F a) List of primary aromatic amines in the Directive 2002/61/EC. b) IARC clasification groups: 1 = Carcinogenic to humans, 2A = Probably carcinogenic to humans, 2B = Possibly carcinogenic to humans, 3 = Not classifiable as to carcinogenic to humans. c) A: SUPELCO, B: Sigma-Aldrich, C: AccuStandard Inc., D: Wako Pure Chemical Industiries, Ltd., E: Fulka, F: Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. of methanol using an ultrasonic bath as required. Next, 15 ml of citrate buffer preheated to 70 C was added to this tube. The reaction tube was ultrasonicated for 30 min at 70 C. Subsequently, 3 ml of aqueous sodium dithionite solution was added to the reaction tube, which was then vigorously shaken by hand and immediately kept again for 30 min at 70 ± 2 C without ultrasonication. After 30 min, the reaction tube was cooled to room temperature within 2 min. Then, the sample solution was extracted by MTBE in the same manner as in the case of EN GC/MS analysis All samples in this study were analyzed by a Focus GC equipped with a DSQII MS (Thermo Fisher Scientific). A DB-35MS fused silica capillary column (length: 30 m, internal diameter: 0.25 mm, film thickness: 0.25 µm, Agilent) was used for analysis in this study. A DB-5MS fused silica (length: 30 m, internal diameter: 0.25 mm, film thickness: 0.25 µm, Agilent) was also used in a preliminary test. The carrier gas used was He gas, with the gas flow rate being set to a constant value of 1.0 ml min 1. The temperatures of the injector, transfer line and ion source were 230, 250, and 230 C, respectively. The sample was injected in the splitless mode and the injected volume was 1 µl. The GC oven temperature was initially maintained at 55 Cfor 5 min and programmed to undergo temperature increases in three steps. In the first step, the temperature increased to 230 Catarateof15 Cmin 1 ; in the second step, to 290 C at 5 C min 1 ; and in the final step, to 310 Cat20 C min 1. The oven temperature was then maintained at 310 Cfor5 min. The MS was operated in the electron ionization mode at 70 ev and the analysis was performed using the selected ion monitoring (SIM) mode. The retention times and the quantifying and qualifying ions are listed in Table 3. The limits of detection and quantification (LOD and LOQ, respectively) were calculated using the computer software named Total Optimization of Chemical Operations (TOCO), version 2.0, the operation of which is based on the function of mutual information (FUMI) theory. [16] The concentrations obtained from relative standard deviation of 33% and 10% on the basis of mass chromatograms of standard and blank solutions were used to define the instrumental LOD and LOQ, respectively (Table 3). [17] No