対 象 と 方 法 EGFR T790M 変 異 配 列 における MHC class I 結 合 ペプチドを 複 数 のサーバーにて 予 測 し HLA-A2 拘 束 性 のペプチド(T790M-5:MQLMPFGCLL, T790M-:LIMQLMPFGCL)を 用 意 した HLA-A2 陽

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1 氏 名 ( 本 籍 ) 学 位 の 種 類 報 告 番 号 学 位 授 与 の 日 付 学 位 授 与 の 要 件 学 位 論 文 題 目 論 文 審 査 委 員 やま 山 だ 田 てっ 哲 ぺい 平 ( 福 岡 県 ) 博 士 ( 医 学 ) 甲 第 1553 号 平 成 27 年 3 月 24 日 学 位 規 則 第 4 条 第 1 項 該 当 ( 課 程 博 士 ) EGFR T790M Mutation as a Possible Target for Immunotherapy; Identification of HLA-A*0201-Restricted T Cell Epitopes Derived from the EGFR T790M Mutation (EGFR T790M 変 異 を 標 的 とした 新 規 免 疫 療 法 の 開 発 :EGFR T790M 変 異 由 来 の HLA- A*0201 拘 束 性 T 細 胞 抗 原 の 同 定 ) ( 主 査 ) 福 岡 大 学 教 授 山 下 裕 一 ( 副 査 ) 福 岡 大 学 教 授 白 澤 専 二 福 岡 大 学 教 授 宮 本 新 吾 福 岡 大 学 講 師 田 中 俊 裕 内 容 の 要 旨 背 景 と 目 的 肺 癌 は 最 も 悪 性 度 の 高 い 腫 瘍 の 1 つであるが 近 年 治 療 戦 略 に 大 きな 進 歩 を 認 めている 特 に ゲ フィチニブ(イレッサ)やエルロチニブ(タルセバ)のような EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 による 治 療 は 非 小 細 胞 肺 癌 の 患 者 に 高 い 治 療 効 果 を 示 してきた しかしながら そのほとんどの 腫 瘍 は EGFR チロ シンキナーゼ 阻 害 薬 に 対 する 耐 性 を 獲 得 し その 約 半 数 に EGFR 遺 伝 子 のゲフィチニブ 耐 性 点 突 然 変 異 T790M が 関 与 するとされ 現 在 のところ この 変 異 を 持 つ 患 者 には 有 効 な 治 療 オプションがないのが 現 実 である また 昨 今 はたくさんの 腫 瘍 関 連 抗 原 の 同 定 により 免 疫 治 療 の 分 野 でも 劇 的 な 進 歩 を 認 め 腫 瘍 関 連 抗 原 を 使 用 したがんワクチンを 含 め 多 数 のがん 免 疫 療 法 の 臨 床 試 験 が 行 われている しかし それらの ほとんどが 野 生 型 の 自 己 抗 原 を 用 いたがんワクチンであり 免 疫 寛 容 により 免 疫 原 性 が 低 く 免 疫 逃 避 が 起 こりやすいなどの 理 由 から 有 効 性 を 示 せていない 変 異 遺 伝 子 由 来 の 抗 原 は 免 疫 系 からは 非 自 己 と 認 識 されるため 免 疫 原 性 が 高 く 免 疫 逃 避 が 起 こりにくいため 変 異 遺 伝 子 由 来 の 抗 原 ペプチドは 免 疫 治 療 の 格 好 の 標 的 となりうると 考 えられる 今 回 我 々は EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 耐 性 患 者 に 対 する 新 規 免 疫 療 法 を 開 発 するため EGFR T790M 変 異 由 来 の MHC class I 拘 束 性 T 細 胞 抗 原 の 同 定 を 行 った

2 対 象 と 方 法 EGFR T790M 変 異 配 列 における MHC class I 結 合 ペプチドを 複 数 のサーバーにて 予 測 し HLA-A2 拘 束 性 のペプチド(T790M-5:MQLMPFGCLL, T790M-:LIMQLMPFGCL)を 用 意 した HLA-A2 陽 性 健 常 人 の 末 梢 血 単 核 球 を in vitro で 同 ペプチドを 用 いて 繰 り 返 し 刺 激 し 共 培 養 行 うことで 各 ペプチド 特 異 的 にインターフェロンγを 産 生 する T 細 胞 株 を 樹 立 できるかを 評 価 した また 樹 立 した 細 胞 株 が 非 小 細 胞 肺 癌 細 胞 株 に MHC class I 拘 束 性 に 特 異 的 な 反 応 を 示 すかも 評 価 行 った 次 に EGFR チロシ ンキナーゼ 阻 害 剤 にて 治 療 中 の HLA-A2 陽 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 の 末 梢 血 単 核 球 を 実 際 に 用 いて 同 様 な 方 法 で in vitro で 共 培 養 行 うことで 各 ペプチド 特 異 的 にインターフェロンγを 産 生 する T 細 胞 株 を 樹 立 で きるのか 評 価 行 った 結 果 HLA-A2 陽 性 の 健 常 人 において T790M-5 の 刺 激 では 6 人 中 5 人 (83%)に T790M-7 の 刺 激 では 6 人 中 3 人 (50%)に 各 ペプチド 特 異 的 にインターフェロンγを 産 生 する T 細 胞 株 を 樹 立 することがで きた 今 回 樹 立 した EGFR T790M 由 来 ペプチドに 特 異 的 な T 細 胞 株 は HLA-A2 と T790M 変 異 を 持 つ 非 小 細 胞 肺 癌 細 胞 株 へ MHC class I 拘 束 性 に 特 異 的 反 応 を 示 した 興 味 深 いことに EGFR チロシン キナーゼ 阻 害 剤 にて 治 療 中 の HLA-A2 陽 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 において T790M-5 もしくは T790M-7 に 抗 原 特 異 的 な 免 疫 反 応 を 認 めた 7 人 中 1 人 (14%)のみに EGFR-T790M 変 異 を 認 め T790M-5 および T790M-7 に 抗 原 特 異 的 な 免 疫 反 応 を 認 めなかった 15 人 中 9 人 (60%)に EGFR T790M 変 異 を 認 め HLA-A2 陽 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 における EGFR T790M 由 来 ペプチドに 対 する 免 疫 反 応 と EGFR T790M 変 異 の 存 在 は 有 意 に 負 の 相 関 関 係 を 示 した(p = ) 考 察 EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 剤 にて 治 療 中 の 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 において T790M 由 来 ペプチドに 対 す る 免 疫 反 応 が 存 在 すれば T790M 耐 性 変 異 の 誘 導 ( 薬 剤 耐 性 誘 導 )を 抑 制 することが 示 唆 された さら に 我 々が 同 定 した 2 種 の 抗 原 ペプチド(T790M-5:MQLMPFGCLL, T790M-7:LIMQLMPFGCL)は EGFR T790M 点 突 然 変 異 を 有 する 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 に 対 する 免 疫 治 療 の 抗 原 ペプチド(ワクチン 抗 原 ) として 使 用 可 能 で 特 に EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 治 療 中 の 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 において 薬 剤 耐 性 誘 導 を 予 防 するための 抗 原 ペプチド(ワクチン 抗 原 )として 期 待 される 審 査 の 結 果 の 要 旨 変 異 遺 伝 子 由 来 の 抗 原 は 免 疫 系 からは 非 自 己 と 認 識 されるため 免 疫 原 性 が 高 く 免 疫 逃 避 が 起 こりにく いため 変 異 遺 伝 子 由 来 の 抗 原 ペプチドは 免 疫 治 療 の 格 好 の 標 的 となりうると 考 えられる 本 論 文 は 初 めて EGFR T790M 変 異 由 来 の MHC class I 拘 束 性 T 細 胞 抗 原 を 2 種 同 定 することがで き 同 抗 原 は EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 耐 性 変 異 T790M を 有 する 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 に 対 する 免 疫 治 療 の 抗 原 ペプチド(ワクチン 抗 原 )として 使 用 可 能 であり 特 に EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 治 療 中 の 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 において 薬 剤 耐 性 誘 導 を 予 防 するための 抗 原 ペプチド(ワクチン 抗 原 )として 期 待 されることを 証 明 したものである 1. 斬 新 さ

3 現 在 までに K-ras 変 異 や EGFR Variant III などの 変 異 遺 伝 子 由 来 のワクチン 抗 原 に 関 する 報 告 は 認 めるが EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 耐 性 変 異 T790M 由 来 の MHC class I 拘 束 性 T 細 胞 抗 原 の 同 定 を 行 った 報 告 は 初 めてである ( 特 許 広 告 番 号 : WO A1) 2. 重 要 性 今 回 同 定 された 2 種 の 抗 原 ペプチド(T790M-5:MQLMPFGCLL, T790M-7:LIMQLMPFGCL)は EGFR T790M 点 突 然 変 異 を 有 する 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 に 対 する 免 疫 治 療 の 抗 原 ペプチド(ワクチン 抗 原 ) として 使 用 可 能 で 特 に EGFR チロシンキナーゼ 阻 害 薬 治 療 中 の 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 において 薬 剤 耐 性 誘 導 を 予 防 するための 抗 原 ペプチド(ワクチン 抗 原 )として 期 待 される 近 年 Immuno check point 阻 害 剤 に 関 して 世 界 中 の 注 目 が 集 まる 中 併 用 薬 としては 免 疫 原 生 の 高 い ワクチン 抗 原 が 最 も 重 要 視 されており 今 回 同 定 された 2 種 の 抗 原 ペプチドは Immuno check point 阻 害 剤 との 併 用 薬 としても 期 待 される 3. 研 究 方 法 の 正 確 性 本 研 究 では 確 立 された 方 法 を 用 いて HLA 結 合 ペプチドの 選 択 を 行 い 抗 原 特 異 的 免 疫 原 生 や 細 胞 傷 害 性 を 確 認 している また χ 2 検 定 で HLA-A2 陽 性 非 小 細 胞 肺 癌 患 者 における EGFR T790M 由 来 ペ プチドに 対 する 免 疫 反 応 と EGFR T790M 変 異 の 存 在 は 有 意 に 負 の 相 関 関 係 を 示 している 4. 表 現 の 明 確 性 本 論 文 は EGFR T790M 薬 剤 耐 性 変 異 を 持 つ 患 者 には 現 時 点 で 有 効 な 治 療 オプションがないという 最 大 の 問 題 点 に 対 して 斬 新 で 画 期 的 な 新 規 免 疫 療 法 の 開 発 で 予 後 改 善 を 目 指 すという 臨 床 に 即 した 目 的 を 明 確 に 表 現 している また 論 文 構 成 においても 必 要 十 分 な 実 験 方 法 と 明 確 に 導 き 出 された 結 果 により 目 的 に 即 した 考 察 展 開 ができており 表 現 は 明 確 である 5. 主 な 質 疑 応 答 Q1: ペプチドワクチンに 関 する 基 本 的 な 機 序 に 関 する 質 問 ですが 体 外 から 投 与 したペプチドがどのよ うに MHC Class I に 乗 るのか? A1: 体 外 から 投 与 されたペプチドの MHC Class I への affinity が 高 い 場 合 には 細 胞 表 面 の MHC Class I にもともと 乗 っているペプチドと 入 れ 替 わる 形 で MHC Class I に 乗 ると 考 えられています Q2: 今 回 実 験 に 使 用 した 数 種 類 の EGFR T790M 変 異 由 来 ペプチドは MHC class I のどの pocket にど のように 提 示 され またどのように T 細 胞 レセプターに 認 識 されるのか? A2: HLA-A2 拘 束 性 のペプチドはアンカー 部 位 ( 一 般 的 には N 末 端 から 2 番 目 のアミノ 酸 と C 末 端 のア ミノ 酸 が 相 当 )を 介 して MHC class I の pocket に 結 合 します そのアンカー 部 位 以 外 のアミノ 酸 が MHC class I の pocket から 外 に 露 出 される 形 となり T 細 胞 レセプターに 認 識 されると 考 えら れています Q3: HLA-A*0201 での 免 疫 原 性 を 調 べたとのことであるが その 他 の HLA-A2 subtype との 交 差 反 応 は 調 べたか? A3: 今 回 の 実 験 では 調 べていないが これまでの 報 告 からも HLA-A*0201 に 結 合 する 多 くのペプチドは 他 の HLA-A2 subtype にも 交 差 反 応 を 示 すと 報 告 されています なお 今 回 報 告 したペプチドに 関 しては HLA-A*0201 以 外 の HLA-A2 subtype (HLA-A*0206 および HLA-A*0207)への 交 差 反 応 を 調 べている 際 中 です

4 Q4: HLA A2 の 日 本 人 での 割 合 は? A4: 40% 程 度 です Q5: 今 回 の 論 文 における 患 者 さんの HLA は 調 べているのか? A5: PBMC を 抗 HLA-A2 抗 体 で 染 色 したのちフローサイトメトリーで 解 析 することにより HLA の 血 清 型 を 確 認 しています 論 文 における 患 者 さん 全 員 が 血 清 型 で HLA-A2 を 持 つことは 確 認 している が HLA-A2 subtype(アリル 型 (4 桁 ))までは 調 べていません Q6: 癌 細 胞 では MHC Class I の 発 現 は 減 少 していると 言 われているが? A6: 癌 細 胞 における 免 疫 逃 避 のメカニズムの 一 つとして MHC Class I の 発 現 減 少 ( 喪 失 )がしばしば 報 告 されており( 肺 癌 では 約 30%の 患 者 で MHC Class I の 発 現 減 少 ( 喪 失 )を 認 めると 報 告 されてい る) CTL を 介 した 免 疫 療 法 の 臨 床 効 果 が 得 られない 原 因 の 一 つと 言 われています 従 って そう した MHC Class I の 発 現 減 少 ( 喪 失 )を 認 める 患 者 に 対 して CTL 以 外 の 免 疫 細 胞 (NK 細 胞 や gdt 細 胞 など)を 介 した 免 疫 療 法 の 開 発 が 望 まれています Q7: 今 回 の 実 験 に 用 いた HLA A2 結 合 ペプチト はどうやって 合 成 したのか? A7: Thermo Fisher Scientific GmbH 社 が 人 工 的 に 合 成 したものを 購 入 し 使 用 しました Q8: 今 回 の 実 験 に 使 用 した T790M 由 来 ペプチドのアミノ 酸 配 列 をどうやって 決 めたのか? A8: 多 数 ある T790M 由 来 ペプチド(アミノ 酸 配 列 )の 中 から 2 種 のサーバー(BIMAS および NetMHC 3.2)を 使 用 して HLA-A2 に 結 合 すると 予 想 されるペプチドを 選 択 しました さらに 実 際 に HLA-A2 に 結 合 するかどうかを HLA-A2 を 発 現 した 細 胞 株 を 用 いた binding assay で 確 認 したのち 免 疫 原 性 を 調 べる 実 験 に 使 用 しました Q9: Table2 で 免 疫 原 性 がなく T790M 変 異 を 持 つ 人 9 人 /15 人 (60%)の 患 者 にはこのワクチンは 効 か ないということか? A9: In vitro の assay 系 で 特 異 的 T 細 胞 の 誘 導 がみられない( 免 疫 原 性 がない) 患 者 にも ペプチドをワ クチンとして 用 いることにより 特 異 的 T 細 胞 を 誘 導 できれば 治 療 効 果 がみられるものと 期 待 して います Q10: Table2 で EGFR-TKI に 感 受 性 のあるグループに T790M 変 異 を 持 つ 患 者 が 2 名 いるのは 何 故 か? A10: EGFR-TKI に 感 受 性 なし 感 受 性 ありの 判 断 は CT 画 像 上 の 評 価 で PD であるか 否 かであり 同 T790M 変 異 を 持 つ 患 者 2 名 は 血 液 sample を 頂 いた 時 点 では EGFR-TKI に 感 受 性 ありと 判 断 しま した T790M 変 異 を 持 つ 患 者 の 腫 瘍 にも T790M 変 異 を 持 つ 部 分 と 持 たない 部 分 が 存 在 し T790M 変 異 を 持 たない 部 分 に EGFR-TKI の 効 果 があり PD にはならなかったのではないかと 考 えています なお 後 に PD に 至 った 可 能 性 があるが 経 過 は 追 っていません Q11: 通 常 は 変 異 の 有 無 は 生 検 組 織 などで 確 認 すると 思 うが 何 故 血 漿 中 で 行 ったのか? また それはよく 行 われているのか? 信 頼 性 はあるのか? A11: 今 回 は EGFR-TKI にて 治 療 中 もしくは 治 療 後 の 患 者 を 対 象 としたため その 時 点 で 新 たに 組 織 を 同 患 者 から 得 ることは 困 難 なため 患 者 血 漿 から 分 離 した cell-free DNA を 用 いて PCR 測 定 を 行 い 代 用 しました 昨 今 研 究 段 階 ではありますが 手 術 ( 生 検 ) 適 応 のない 患 者 においても 侵 襲 の 少 ない 方 法 で 診 断 を 可 能 とするために 末 梢 血 中 の cell-free DNA を 用 いて mutation の 有 無 を 確 認 しようとする 論 文 も 増 えてきています 変 異 陽 性 と 出 たのものは 変 異 陽 性 として 評 価 可 能 で あると 思 いますが 変 異 陰 性 と 出 たものの 中 には 本 来 は 陽 性 のもの( 偽 陰 性 )が 存 在 する 可 能 性 は

5 あると 考 えています Q12: PCR でプライマーは 何 を 使 用 したのか? 存 在 する T790M 変 異 のアミノ 酸 配 列 まで 調 べたのか? A12: Applied Biosystems 社 の Taqman Mutation Detection Reference Assays, 用 のプライマーを 購 入 して 使 用 したが プライマーの 配 列 は 非 公 開 であるため 不 明 です なお T790M 変 異 のアミノ 酸 配 列 は 調 べていません Q13: Immuno check point があるためにがんワクチンは 効 かないと 思 うが どういう Strategy で 今 後 の 癌 ワクチンは 進 むべきと 考 えますか? A13: 現 在 Immuno check point 阻 害 剤 が 臨 床 応 用 され その 臨 床 効 果 が 科 学 的 に 証 明 されつつありま すが もともと 癌 特 異 的 な 免 疫 細 胞 (T 細 胞 )を 認 める 患 者 にのみ 臨 床 効 果 を 認 めることが 判 明 し ています ただし 癌 特 異 的 な 免 疫 細 胞 (T 細 胞 )のない 患 者 にもがんワクチンなどの 免 疫 療 法 に より 特 異 的 免 疫 細 胞 (T 細 胞 )を 誘 導 することができれば Immuno check point 阻 害 剤 の 臨 床 効 果 が 期 待 できるようになると 考 えられています 従 って 今 後 はがんワクチンと Immuno check point 阻 害 剤 などの 免 疫 調 整 薬 との 併 用 が 主 流 となると 推 察 されます Q14: がんワクチン 単 独 とがんワクチンと 抗 PD-1 抗 体 の 併 用 で 効 果 に 差 がないという 論 文 があるが? A14: がんワクチンと immuno check point 阻 害 剤 ( 抗 PD-1 抗 体 など)との 併 用 で 治 療 効 果 が 向 上 すると いう 動 物 モデルでの 報 告 はありますが ヒトでの 臨 床 研 究 としてがんワクチンと 抗 PD-1 抗 体 との 併 用 効 果 を 科 学 的 に 評 価 した 報 告 はないと 思 います Q15: 変 異 遺 伝 子 を 標 的 としたり 予 防 したりするペプチドワクチンとのことであるが T790M 耐 性 変 異 のような 遺 伝 子 変 異 が 起 こる 過 程 に 免 疫 が 関 与 している 事 を 想 像 できないのだが? A15: 遺 伝 子 変 異 は 一 般 的 には 免 疫 原 性 が 高 いために 遺 伝 子 変 異 の 生 じたほとんどの 正 常 細 胞 (ある いは 癌 細 胞 )は 免 疫 系 による 攻 撃 をうけ 死 滅 すると 考 えられています(immune surveillance theory) しかし 宿 主 の 免 疫 系 の 変 化 ( 何 らかの 免 疫 抑 制 が 生 じた 場 合 など)や 免 疫 原 性 の 弱 い 遺 伝 子 変 異 が 生 じた 場 合 には 免 疫 系 によるコントロールが 不 十 分 となりがんが 発 生 すると 考 えら れています(immune escape) 従 って 免 疫 原 性 の 弱 い 遺 伝 子 変 異 がより 選 択 的 にがん 細 胞 に 発 現 している 可 能 性 も 指 摘 されています Q16: HLA-A2 以 外 にも 効 果 は 期 待 できるのか? A16: 今 回 同 定 したペプチドは HLA-A2 拘 束 性 ですので 他 の HLA 型 には 効 果 が 期 待 できないと 推 察 さ れます なお 他 の HLA 型 に 拘 束 性 のペプチドが 同 定 できれば HLA-A2 以 外 にも 効 果 は 期 待 で きると 考 え 現 在 検 討 中 です Q17: T790M 耐 性 変 異 を 持 つ 患 者 は 国 内 にどのくらいいるのか? A17: 非 小 細 胞 肺 癌 の 国 内 での 年 間 罹 患 者 数 は 約 10 万 人 ですが そのうち 約 20%は EGFR T790M 変 異 陽 性 であると 考 えられることから 患 者 数 は 国 内 で 約 2 万 人 程 度 と 推 定 されます 以 上 の 内 容 の 斬 新 さ 重 要 性 研 究 方 法 の 正 確 性 表 現 の 明 確 性 および 質 疑 応 答 の 対 応 を 踏 まえ 主 査 および 副 査 による 審 査 の 結 果, 本 論 文 は 学 位 論 文 に 値 すると 評 価 された

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