解 析 の 実 行 方 法 (First Step Guide) 解 析 の 実 行 File メニューから New Analysis using BLAST を 選 択 します 下 記 の 解 析 開 始 メニューが 表 示 されます への 入 力 データは 16s

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1 解 析 の 実 行 方 法 (First Step Guide) 内 容 についてのお 問 い 合 わせ 先 : 株 式 会 社 ワールドフュージョン 技 術 営 業 部 東 京 都 中 央 区 日 本 橋 人 形 町 新 扇 堂 ビル 7F TEL FAX 電 子 メール techsupport@w-fusion.co.jp URL 当 ドキュメントの 著 作 権 はすべて 株 式 会 社 ワールドフュージョンに 属 します 当 ドキュメントの 無 断 コピーおよび 無 断 掲 載 は 許 可 されていません 2015/04 1

2 解 析 の 実 行 方 法 (First Step Guide) 解 析 の 実 行 File メニューから New Analysis using BLAST を 選 択 します 下 記 の 解 析 開 始 メニューが 表 示 されます への 入 力 データは 16s rrna を シーケンスしたリードデータ(Fasta)の Blast 結 果 です 解 析 の 実 行 前 に 弊 社 より 提 供 している Local Blast 実 行 ツールにより Blast 結 果 ファイルを 取 得 してください 解 析 のプロジェクト 名 をプロジェクト 名 入 力 エリアに 記 入 します( 必 須 ) プロジェクト 名 入 力 ( 必 須 ) Blast 結 果 カットオフパラメータ 設 定 Blast 結 果 フィルタ 通 過 後 の 動 作 設 定 オプション 解 析 に 使 用 する Database の 選 択 欄 Blast 結 果 ファイル 入 力 欄 2

3 BLAST 結 果 にフィルタ 条 件 を 設 定 する 場 合 チェックを 入 れた 項 目 が 有 効 になります 必 須 項 目 はありません Reset Filter ボタンをクリックすると 初 期 値 に 戻 ります identity(%): 配 列 一 致 度 の 下 限 を 指 定 alignmentlength: アラインメント 長 の 下 限 を 指 定 bitscore: 相 同 性 がある 局 所 配 列 の 下 限 を 塩 基 長 の 2 倍 で 指 定 mismatches: 一 致 しない 塩 基 の 許 容 数 を 指 定 gapopenings: 塩 基 のギャップの 許 容 数 を 指 定 e-value: e-value の 上 限 を 指 定 フィルタ 条 件 を 設 定 後 BLAST 結 果 ファイルを BLAST 結 果 ファイル 入 力 エリアにドラッグ&ドロップします 複 数 ファイルを 指 定 可 能 です Submit をクリックすることで 解 析 がスタートします Blast Results Database には Blast 実 行 時 に 使 用 したデータベースを 指 定 します このデータベースは KIN インス トールフォルダ 内 の/rsrc/db フォルダ 内 の.mdb ファイルが 表 示 されます 解 析 が 開 始 されると 入 力 したプロジェクト 名 を 親 フォルダとするフォルダ 内 に Classification analysis フォルダ が 作 られ その 中 に 個 々のサンプルが BLAST ファイル 名 をサンプル 名 として 表 示 されます 解 析 は 解 析 ログ 表 示 画 面 に Complete 入 力 サンプル 数 of 入 力 サンプル 数 の 表 示 が 出 れば 終 了 です 解 析 サンプル 表 示 解 析 ログ 表 示 Blast 結 果 フィルタ 通 過 後 の 動 作 設 定 オプション 入 力 された Blast 結 果 に 対 して 設 定 したフィルターを 通 過 できなかった 場 合 の 動 作 を 指 定 できます *Include number of rejected hits read: チェックすることでフィルタ 条 件 を 通 過 できなかったリードの 総 数 がメタゲノム 解 析 結 果 中 に Rejected hit として 表 示 されます *Include number of no BLAST hits read: Local Blast 実 行 時 に 設 定 された E-value カットオフ 条 件 を 通 過 できなかったリードには Blast 結 果 ファイルにて NO HIT と 記 載 されます チェックすることで NO HIT と 記 載 されたリードの 総 数 がメタゲノム 解 析 結 果 中 に No Blast hit として 表 示 されます *Assign Not determined if taxons of similar accepted hits read do not match 一 つのリードに 複 数 の 異 なった 菌 名 (= 異 なった Taxon id)が 同 じ E-value を 持 っていた 場 合 いずれの 菌 を 真 にリ ードに 割 り 当 てることが 正 しいのか 決 定 できないため 当 該 階 層 ではリードへ Not determined を 割 り 振 り 菌 名 を 付 与 しません より 上 位 の 階 層 にて 同 じ 菌 名 (= 同 じ Taxon id)となった 時 点 で 菌 名 が 付 与 されます 3

4 解 析 結 果 の 表 示 画 面 左 の 解 析 サンプル 表 示 エリアにおいて サンプル 名 をクリックすると 解 析 結 果 が Pie chart/sunbust graph/spreadsheet で 表 示 されます 画 面 右 上 のプルダウンメニューから 表 示 するグラフの 形 式 と 階 層 を 切 り 替 えることができます 1, 表 示 するサンプルを 選 択 2, 表 示 したいグラフと 階 層 を 選 択 4

5 解 析 結 果 の 削 除 は 削 除 した Project のフォルダを 選 択 後 メニューの Edit から Delete Analysis をクリック することで Project 単 位 の 解 析 データ 削 除 が 可 能 です 5

6 Pie Chart( 円 グラフ) 表 示 画 面 説 明 Pie chart では Hit リード 数 の 多 い 上 位 20 件 までの 菌 名 がグラフ 下 部 に 表 示 される 選 択 されている 菌 の 名 前 と Hit リード 数 表 示 するグラフの 形 式 と 階 層 サンプル 名 をクリックすると 表 示 する Pie chart のサンプルを 変 更 可 能 6

7 Sunburst graph(ドーナツグラフ) 表 示 画 面 説 明 ドーナツグラフは 中 心 から 外 側 へ superkingdom phylum class order family genus species no rank の 階 層 順 で 並 んでいます マウスポインタを 合 わせると 菌 名 と Hit した リード 数 が 表 示 される 7

8 解 析 結 果 の 出 力 Spreadsheet の 表 示 サンプルごとの 菌 の 出 現 頻 度 を 見 るには Spreadsheet が 便 利 です Spreadsheet は 菌 ごとの 出 現 頻 度 (=リ ード 数 )を 階 層 ごとに 表 形 式 で 表 示 します Rejected reads は 解 析 実 行 時 に 設 定 したフィルタ 条 件 でのぞか れたリード 数 を 表 します 2,プルダウンメニュから Spreadsheet を 選 び 表 示 する 階 層 を 選 択 1,サンプルをクリックして Spreadsheet で 表 示 するサンプルを 指 定 解 析 データファイルの 保 存 先 の 解 析 データは File->Switch Workspace で 表 示 されるデータ 保 存 先 フォルダにプロジェ クト 名 のフォルダを 自 動 的 に 作 成 し その 下 部 にサンプルの 名 前 をフォルダ 名 として 保 存 されます(データの 保 存 先 は 変 更 可 ) =プロジェクト 名 サンプルごとのフォルダ 内 には 上 位 階 層 の 解 析 項 目 におけるサンプルごとの =サンプル 名 解 析 結 果 が 保 存 されています CSV ファイル: 解 析 項 目 のグラフ 作 成 元 データが 記 録 されています = 解 析 項 目 名 HTML ファイル: 各 解 析 項 目 のグラフが 記 録 されています グラフ 画 像 の 表 示 には FireFox が 必 要 です 02_hits_result フォルダの accepted.csv :メタゲノム 解 析 に 持 ち 込 まれた 個 々のリードが 何 れの 菌 株 に 割 り 当 てら れたのか 階 層 を 通 じて 記 録 したデータが 保 存 されています 02_hits_result フォルダ 内 の rejected.csv : 解 析 実 行 時 に 設 定 したフィルタ 条 件 に BLAST 結 果 のパラメータが 達 せず 解 析 から 除 外 されたリードが 記 録 されています 02_hits_result フォルダ 内 の no_blast.csv フォルダには Blast 実 行 時 に 設 定 した E-value に 達 せず Blast DB 上 にリードのシーケンスに 対 応 する 菌 株 がないと 判 断 されたリードが 記 録 されています 8

9 解 析 データの 出 力 Pie chart Sunburst graph 等 のグラフ 画 像 データは 出 力 したいグラフを 表 示 後 メニューの File -> ExportActive Chart or Table を 選 択 することで 保 存 先 フォルダを 指 定 して 出 力 できます 出 力 されるファイル 形 式 はグラフ 画 像 の 場 合 HTML 形 式 で 表 は CSV 形 式 となり FireFox およびエクセルにて 開 くことでデータを 表 示 できます * 表 示 する 菌 数 が 多 くなった 場 合 アプリケーション 上 で Pie chart や Sunburst graph が 表 示 されないことがあり ます そのような 場 合 も File -> Export Active Chart or Table により HTML 形 式 で 出 力 することでグラフの 画 像 を ブラウザ 上 で 閲 覧 できます Export された.html ファイルを 開 いてグラフ 画 像 を 表 示 するには FireFox をブラウザ に 用 いる 必 要 があります プロジェクトに 含 まれるデータをすべて Export するには File -> Export All Charts or Tables を 選 択 します 保 存 先 のフォルダを 指 定 するとプロジェクト 内 に 含 まれる すべてのサンプルのグラフ(html 形 式 ) 表 (CSV 形 式 ) クラスタ 解 析 結 果 画 像 ファイルが 出 力 されます プロジェクトのフォルダ Export All Charts or Tables で 出 力 されるフォルダには 以 下 の 情 報 が 含 まれます 個 々のサンプル ---- 解 析 ログファイル ----リード 名 と 割 り 当 てられた 菌 名 の 対 応 表 ---- 階 層 ごとの 頻 度 解 析 結 果 (CSV 形 式 ) ---- 円 グラフ 画 像 および 円 グラフ 作 成 元 データ(CSV 形 式 ) ----ドーナツグラフ 画 像 (html 形 式 ) ---- 同 時 に 解 析 対 象 となった 複 数 サンプルにおける 菌 の 頻 度 情 報 ---- 棒 グラフ 画 像 (html 形 式 )および 棒 グラフ 作 成 元 データ(CSV 形 式 ) 次 元 PCA 解 析 結 果 画 像 次 元 PCA 解 析 結 果 ( 自 動 コマ 送 り) 次 元 PCA 解 析 結 果 ( 手 動 コマ 送 り) ---- 階 層 型 クラスタリング 結 果 画 像 ----SOM 解 析 結 果 画 像 9

10 Bar_chart フォルダの 中 身 : 階 層 ごとの 棒 グラフ 画 像 データ 画 像 の 表 示 には FireFox が 必 要 階 層 ごとの 棒 グラフ 作 成 元 データ( 解 析 サンプルごとのリード に 割 り 当 てられた 菌 の 頻 度 情 報 ) Pie_chart フォルダの 中 身 : 階 層 ごとの 円 グラフ 作 成 元 データ( 解 析 サンプルごとのリード に 割 り 当 てられた 菌 の 頻 度 情 報 ) data_table フォルダの 中 身 : Blast にていずれの 菌 に 何 本 のリードが Hit したのかを 階 層 ごとにまとめた 表 hits_result フォルダの 中 身 : Accepted_hits:リードがどの 菌 種 に 割 り 当 てられたのかを 階 層 ごとに 一 覧 表 示 した 表 Query ID はリード 名 を 表 し 各 階 層 における Taxon ID と 菌 名 が 示 される No_blast_hit:BLAST 実 行 時 に 設 定 したフィルタ 条 件 をクリアできなかったリード rejected_hit:メタゲノム 解 析 実 行 時 に 設 定 した Blast 結 果 フィルタ 条 件 をクリアで きなかったリード 10

11 解 析 結 果 の HTMT 形 式 出 力 File メニュー 内 の Create HTML Report を 指 定 すると Workspace で 表 示 されるデータ 保 存 先 フォルダの 解 析 プロジェクト 名 フォルダ 内 に HTML ファイルが 作 成 されます 作 成 された index.html を 開 くことで 解 析 結 果 を を 使 わずに 閲 覧 できます 別 PC にて 解 析 結 果 を 閲 覧 する 場 合 は index.html のある 場 所 からひとつ 上 のディレクトリに 位 置 するプロジェク ト 名 フォルダを 移 動 して 下 さい 11

12 複 数 サンプルの 棒 グラフ 表 示 複 数 のサンプル(= 複 数 の BLAST 結 果 ファイル)を 同 時 に 解 析 した 場 合 は 棒 グラフで 全 サンプルの 菌 の 構 成 を 表 示 できます サンプル 表 示 エリアにおいて Statistical Analysis の default をクリックし ドロップダウンメニューにおいて Bar chart と 表 示 すべき 階 層 を 選 択 することで 表 示 されます Statistical Analysis をクリックした 状 態 でドロップダウンメニューをクリックすると 棒 グラフや 各 種 クラスター 解 析 結 果 を 閲 覧 することができるようになります 2,Bar chart と 表 示 したい 階 層 を 選 択 サンプル 表 示 エリア 1,Statistic Analysis の default をクリック 12

13 クラスター 解 析 結 果 の 表 示 複 数 のサンプルを 解 析 した 場 合 では 以 下 5 種 類 の 解 析 が 実 行 されます PCA 2D: 主 成 分 分 析 ( 二 次 元 ) PCA 3D Animation: 主 成 分 分 析 ( 三 次 元 アニメーション) PCA 3D Interactive: 主 成 分 分 析 ( 三 次 元 インタラクティブ) Clustering: 階 層 的 クラスタリング SOM: 自 己 組 織 化 マップ クラスター 解 析 結 果 を 閲 覧 するには プロジェクトフォルダ 内 の Statistical Analysis フォルダ 内 の default アイ コンを 選 択 し プルダウンメニューから 表 示 したいクラスター 解 析 結 果 を 選 択 します クラスター 解 析 は 階 層 ごとに 実 施 されるため どの 階 層 における 結 果 を 表 示 するかをプルダウンメニューから 選 択 できます 2, 表 示 したいクラスタ 解 析 と 階 層 を 指 定 1,Statistical Analysis の default を 選 択 13

14 2 次 元 PCA 解 析 結 果 の 表 示 プルダウンメニューから 2D PCA を 選 択 すると 主 成 分 分 析 の 二 次 元 プロット 画 像 が 菌 の 階 層 ご と に 表 示 さ れま す % 表 示 は PC1 と PC2 で 表 示 される プロット 図 の 保 持 する 情 報 量 を 示 してい ます プルダウンメニューの 階 層 を 変 更 する ことで 表 示 する 階 層 を 変 更 でき File メニューから 使 用 できる Export 機 能 により 表 示 している 2D PCA 解 析 のプ ロット 図 は 画 像 ファイルとして 出 力 でき ます プルダウンメニューから PCA rotation info を 選 択 することで PCA 解 析 の 第 一 主 成 分 から 第 三 主 成 分 までの 菌 ごとの 重 み(rotation 情 報 )を 表 示 できます 各 主 成 分 にそってサンプルをプロットする 段 階 で 何 れの 菌 がサンプルのプロットパターンに 影 響 を 与 えている のかを 示 しています Rotation 情 報 をしめすテーブルにて 正 負 の 符 号 に 関 わらず 絶 対 値 の 大 きな 菌 が 当 該 主 成 分 上 でサンプルを 区 分 けする 際 の 重 みが 大 きい=サンプル 間 の 存 在 量 の 差 が 大 きいことを 示 します 14

15 3 次 元 PCA 解 析 結 果 の 表 示 プルダウンメニューから 3D animated PCA を 選 択 すると 主 成 分 分 析 の 三 次 元 プロットアニメーションが 菌 の 階 層 ご とに 作 成 されます プルダウンメニュから 3D interactive PCA を 選 択 すると 主 成 分 分 析 の 三 次 元 プロットが 菌 の 階 層 ごとに 表 示 されます が アプリケーション 上 では 三 次 元 プロッ ト 図 が 正 常 に 表 示 されません ドラッグ&ドロップによる 表 示 角 度 の 変 更 や 開 始 点 へ 移 動 コマ 送 り マウスホイールによるサイズ 変 更 は 表 示 している 3D interactive PCA の 図 をエクスポート 機 能 により 出 力 し FireFox ブラウザで 開 くことで 可 能 になります 再 生 停 止 ボタン 終 了 点 へ 移 動 自 動 再 生 スピード 表 示 している 図 のエクスポート 方 法 : メニューの File->Export Active Chart or table により 出 力 先 フォルダを 選 択 すると 出 力 された.html ファイルを FireFox で 開 くことで 可 能 になります 15

16 階 層 型 クラスター 解 析 結 果 の 表 示 プルダウンメニューから Clustering を 選 択 することで 階 層 型 クラスタリングの 結 果 が 表 示 されます 解 析 に 用 いたサンプルにおいて 高 い 出 現 頻 度 を 示 す 菌 が 赤 色 で 表 示 され 頻 度 の 少 ない 菌 が 黄 色 ~ 白 色 で 表 示 されます 表 示 する 階 層 はプルダウン メニューから 選 択 できます サンプル 間 の 類 似 度 のツリー 構 造 菌 株 間 の 出 現 頻 度 の 類 似 度 ツリー 構 造 File メニューから 使 用 できる Export 機 能 により 表 示 しているクラスター 解 析 結 果 画 像 を PNG 形 式 の 画 像 ファイ ルとして 出 力 できます 階 層 型 クラスター 解 析 の HeatMap 画 像 は 表 示 される 菌 の 数 が 1000 を 超 えると 表 示 されません より 上 位 の 階 層 において 菌 数 が 1000 以 下 になった 階 層 から HeatMap が 作 成 されます 16

17 自 己 組 織 化 マップ (SOM) 解 析 結 果 の 表 示 プルダウンメニューから SOM code info もしくは SOM map plot を 選 択 することで 自 己 組 織 化 マップの 結 果 が 表 示 されます SOM のクラスタリング 結 果 ファイルは 階 層 ごとに 2 つのクラスタリング 画 像 ファイル (_code.png と_map.png)で 構 成 されます 右 の SOM map plot はサンプル 名 の 記 載 されたサンプルクラスタリン グの 結 果 情 報 をあらわし 左 の SOM code info は 各 階 層 (= 円 )における 菌 の 構 成 成 分 を 表 します SOM map plotにおいて 同 じ 円 の 中 にあるサンプルは 菌 の 構 成 が 似 通 っていることをあらわし 隣 り 合 った 円 と 円 を 構 成 するサンプル 間 でも 類 似 性 が 存 在 することを 示 します 具 体 的 にどのような 菌 を 根 拠 に 類 似 している かを 示 す 図 がSOM code infoになります SOM Code info において 円 内 の 弧 の 色 は 各 菌 の 別 をあわらし 弧 の 角 度 は 同 じです パイの 高 さの 差 は 該 当 する 円 を 構 成 するサンプルの 菌 の 構 成 比 に 比 例 しています このため 隣 り 合 った 円 の 中 に 存 在 するパ イの 色 および 大 きさはほぼ 類 似 します SOM を 形 成 する 円 内 のパイは サンプル 間 の 分 散 の 大 きい 上 位 14 個 の 菌 (=サンプル 間 でばらつきが 大 きな 菌 )を 選 択 して 表 示 しています File メニューから 使 用 できる Export 機 能 により 表 示 している SOM 解 析 結 果 画 像 を PNG 形 式 の 画 像 ファイルと して 出 力 できます 17

18 Blast フィルタ 条 件 をパスしなかったリードのメタゲノム 解 析 への 反 映 解 析 実 行 メニューの Include number of にチェックを 入 れることで Blast 結 果 の 相 動 性 フィルタ 条 件 を 通 過 しなかったリードや データベースに 登 録 された 菌 が 見 つからなかったリードの 数 をメタゲノム 解 析 に 反 映 する ことができます Include number of rejected hits read (trapped read by BLAST filter) にチェックを 入 れることで KIN におけ る 解 析 実 行 時 の Filter Conditions を 通 過 できなかったリードが Rejected hit としてグラフやクラスター 解 析 に 出 現 するようになります Include number of no BLAST hits read にチェックを 入 れることで BLAST 実 行 時 のカットオフ 条 件 により 相 動 性 をもつ 菌 が 存 在 しなかったリードの 数 が No BLAST hit としてグラフやクラスタ 解 析 に 出 現 するようになります rejected hit を 解 析 に 反 映 させた 場 合 No BLAST hit を 解 析 に 反 映 させた 場 合 18