FMO法演習

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1 PDB Data の取得 蛋白質ｘ線結晶解析データの取得 蛋白質構造原子座標データの取得 蛋白質 X 線結晶解析データを 検索し 取得する FireFox で PDB サイトから へ 接続する 今回 リガンド - 受容体結合系の計算を行うた め RXR-PPAR ヘテロダイマーの蛋白質結晶 データを取得する

2 PDB Data の取得 1FM9 PDB 名 1FM9 を検索する

3 PDB Data の取得 PDB の DATA を利用するときに解像度に注意を払う 1FM9 は２ １Åである

4 PDB Data の取得 表示画面を見る

5 PDB Data の取得 1FM9 1

6 PDB Data の取得 JMOL で表示 する

7 PDB Data の取得 JMOL で表示し マウスを画面内で 移動すると画像が 回転する 1FM9 はヘテロ ダイマーであること が画像からも一見 できる それぞれ の蛋白質にそれぞ れのリガンドが結 合している事も見 てとれる

8 1FM9 の片側のポリペプチド鎖 A を使用する PDB の説明にも有るように これは RETINOIC ACID RECEPTOR RXR-ALPHA の一部 LIGAND BINDING DOMAIN - RESIDUES である 実際の作業は 1FM9 全 体を取得した後 PC あるいは cloud server 上で必要なデータの切り出しを行う

9 更に下方には RXR-AL PHA に結合しているリ ガンド retinoic acid の情報が出てくる その右方には PDB data 中のリガンドの形を見る Ligand Explorer がある

10 Ligand Explorer をクリックすると Java Web Start が起動し 次頁のように表示される この画 像はマウスにより 回転拡大等が可能である

11 水素原子２８個は表われていない事に注意 結合表現は connection table が重要

12 ファイルを取得

13 PDB ファイルを取得

14 手元の PC 上にデータ を保存する

15 PDB Data の取得 PDB data 1FM9 をダウンロードして PC の適当な場所に保存する 作業中にファイルの数が増えるので 適当なデイレクトリーを作成し その下部に纏めると扱いやすい Directory として 1fm9 という名前 PDB data はその下に 1fm9.pdb という名称で保存する

16 ＦＭＯ法 演習 PDB 1fm9 THE HETERODIMER OF THE HUMAN RXRALPHA AND PPARGAMMA LIGAND BINDING DOMAINS RESPECTIVELY BOUND WITH 9-CIS RETINOIC ACID AND GI AND CO-ACTIVATOR PEPTIDES. なお PPAR-Gamma RXR-Alpha 複合体についての研究情報はここ では扱わない 参考にする研究資 料は数多く存在している

17 PDB data の確認と整形 PDB の蛋白質の構造には FMO/GAMESS 計算をするまでに 不足している情報がある 蛋白質結晶とⅩ線結晶解析の問題として 主鎖 側鎖の 全てが見えている訳ではない 水素原子は普通見えない 結晶水の存在の価値判断 以上３点は PDB を扱う上で注意する必要性が高い リガンドに関しては化学の知識が必要

18 PDB data の確認と整形 Swiss-PdbViewer をダブルクリックして起動する 最初の案内は読めば消す

19 PDB data File をクリックし その中で Open PDB file... を選択する 先にダウンロードした 1fm9.pdb を選択して 開く の確認と整形

20 PDB data いくつかの側鎖が欠けて いる 自動補完を行う と注意が出る の確認と整形

21 補完された側鎖はピンク色で表示される 向かって 左が RXR-Alpha 鎖 外側に大きく側鎖欠落がある 右は PPAR-Gamma 鎖 リガンド 補体もある

22 Coler 表示 を変えながら 見ると 構造が 分かり易い

23 PDB data の確認と整形 File から SAVE を選択し current layer を保存する 保存 file は plain text Form なので TeraPad や秀丸で確認 修正ができる 保存された file を見れば 補完に伴い 原子の順位番号がリナンバーされ 結晶水が 削除されている SPDBV 用の管理タグ行が追加されている 欠落原子 欠落鎖の補完に関しては どのような手法でモデリングするのかが問われる 今回は FMO/GAMESS の演習ということで とりあえず SPDBV で補完された構造を 使用する また A 鎖と REA のみを演習に使用する そのため 以降 A 鎖及び REA 以外の使用しない部分を削除する作業を行う 結晶水はじめ コアクチべータ 補酵素 ダイマー 他等々 個別の蛋白質の計算にあ たっては生体内動態も含め 個々に計算結果に与える影響に充分な検討が必要である

24 PDB data の確認と整形 RXR 鎖と REA のみを含 むように整形 保存したデ ータを可視化して確認する と判り易い 回転 色付け ステレオ 画像等の表示オプション を使って 見てイメージす る ステレオ表示にして 簡 易な立体鏡を使うとイメー ジ化がとても容易である

25 PDB data の確認と整形 同じ 1fm9.SPDBV.RXR+REA.no_H2O.pdb を Facio で表示したもの A 鎖と REA のみが表示されている 可視化において ソフトウエアやオプション の選択でイメージを掴む容易さが異なる 容易なものを探す事が必要である 3D で立体視すると入門者でもイメージが 掴み易い

26 閑話 立体視鏡について 昔 とっても使いやすい立体鏡が売っていたが ずいぶん前から見つけら れなくなっていた そのため 自作を余儀なくさせられていたが 最近 また 見つけられるようになってきた 参考までに なお 自作の場合 プラスチック表面鏡は東急ハンズで簡単に入手可能 である 自作案内 上記の簡単な商品化 商品

27 PDB data の確認と整形 適当なテキストエデイターにファ イルを読み込み編集作業を開始 する Linux や unix 上での vi は使い易い この例では MS-Windows 上 で TeraPad を使用した ダウンロードした元々の 1fm9 からデータを切り出す 今回 ソフトウエアの使い勝手 から RXR と REA は最初は 別々に処理を行う この辺りは PC 上でデータを 扱う GUI のソフトウエアの使い 勝手に非常に依存する

28 PDB data の確認と整形 元の PDB file には先 頭部分に この対象蛋白 質についての結晶学的 生理学的他の重要な情報 が記載されている 表示したのは欠落アミノ 酸残基と欠落原子の情報 他の情報についても読む

29 PDB data の確認と整形 アミノ酸残基並びの情報 も重要 欠落残基も把握 しておくこと

30 PDB data の確認と整形 データ処理の過程では作業の流れに沿って必要となる情報がす ぐに探し出せない事が多い 内容情報をメモにしておくと扱いやす い なお 貼り付けた画像は SPDBV の出力だが 今回は元の PDB file を使用するので数値は異なる

31 PDB data の確認と整形 メモに基づき A 鎖と REA のみを残して D 鎖 B 鎖 E 鎖 GI を消去する H2O も今回は消去する CONECTION 情報も REA のみを残し他は消去する なお 画像表示用に SPDBV で欠落側鎖を補完したデータを残し その RXR 鎖及び REA を 取りだしたものも表示は見易い

32 PDB data の確認と整形 A 鎖に関する部分 TER record を含む を 1fm9.RXR.pdb という file に REA に関する部分 CONECTION 情報を含む を 1fm9.REA.pdb という file に 保存する

33 PDB data の確認と整形 1fm9.RXR.pdb PDB の先頭にある 情報はファイルの参考 情報として残しておけ ばよい TER RECORD を A 鎖の終端に残す必要 がある ペプチド鎖の終了部 分の TER RECORD は Facio でペプチド鎖 部分への水素原子付 加を行う時に必要 終 端に適合していないと うまく行かない

34 PDB data の確認と整形 1fm9.REA.pdb PDB の先頭にある 情報はファイルの参考 情報として残しておけ ばよい REA 部分は HETATM record として書かれて いる CONECT 情報が REA の結合 (BOND) を知るた めに必要

35 PDB data の確認と整形 元々の 1fm9.pdb deata では側鎖等に欠落がある SPDBV でこれらの補完を行う File をクリックし その中で Open PDB file... を選択する 先に整形して保存したデータ 1fm9.RXR.pdb を選択して 開く いくつかの側鎖が欠けている 自動補完を行 う と注意が出る OK をクリックする

36 PDB data の確認と整形 File から SAVE を選択し current layer を保存する 保存 file 名は 1fm9.RXR.spdbv.pdb という名前で保存する この 1fm9.RXR.spdbv.pdb は plain text form なので TeraPad や秀丸で確認 修正 ができる 保存された file を見れば 欠落原子 欠落鎖の 補完に伴い 原子の順位番号がリナンバーされ 結晶水が削除されている TER record も削除さ れている SPDBV 用の管理タグ行が追加されて いる TER record は以降の操作に必要なので Text editor で補完しておく 先の通り SPDBV 用の管理タグ情報も不要なので消去す る 最終行は END record が必要 1fm9.RXR.spdbv_modTER.pdb という名前で保存する

37 PDB data の確認と整形 以上で PDB data から RXR-Alpha 蛋白質のリガンド結合部位 と, そのリガンド : Retinoic Acid の系のデータの切り出し作業が終 わった 以降 Facio を利用して FMO/GAMESS の入力データを作成 する 水素原子の付加 フラグメント分割 FMO/GAMESS 計算パラメータ

38 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 Facio を利用して FMO/GAMESS の入力データを作成する 今回 欠落側鎖 原子は SPDBV で補完したので Facio での 主たる作業は以下のものとなる 水素原子の付加 ペプチド鎖への付加 リガンド分子への付加 フラグメント分割 FMO/GAMESS 計算パラメータ付加

39 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 ペプチド鎖への水素原子の付加 MS-Windows PC で Facio を起動する なお Facio の操作概念については を自習すれば良く解かる 蛋白質ペプチド鎖への水素原子の付加は Facio 内部に PDB data を読み込 む必要が無い Facio 起動後 Facio パネルの FMO をクリックする Facio の起動初期画面

40 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 FMO PDB Utilities Add Hydrogen Atoms to Protein PDB by ATOM Record 水素付加条件を決定する この条件は目標蛋白質の生理的環境 折り畳ま れている状態 相互作用 溶媒環境等を考える事が必要である 座標データ処理とは別の次元で検討が必要だ 取敢えず既定条件で行う Load New PDB and Execute をクリックする

41 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 ファイル選択画面が出るので 先に作成しておいた 1fm9.RXR.spdbv_modTER.pdb を選択して 開く をクリックする

42 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 次いで計算結果の保存 ファイル名を入力する 既定ではファイル名の 最後に _H を付加した ファイル名を提示される それで良ければ 保存 をクリックする

43 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 水素原子が付加された RXR ペプチド鎖 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb を FACIO に読み込む 原子順番号 275 と 345 が近接していると云う warning が出る

44 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 水素原子が付加された RXR ペプチド鎖 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb を FACIO に読み込むと 原子順番号 275 と 345 が近接している と warning が出た 一般的に はこの後 MM 等を使って構造最適化を行うが 今回 どのような現象が現れているのか を見るため 手動で試して見る これ以降の Facio での手動操作は一定の方法は無く 若 干慣れが必要だ まず 画面を見ながら原子順番号 275 と 345 を特定する Miscellaneous Highlight Specified Atom を選択する Models wire Plain を選択すると探しやすくなる H 原子 275 がメチル基 339 の H 原子と近接 メチル基の結合 を回転させれば解消 する MM 法の TINKER で解決出来そうだが... 手でやる

45 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 手動で行う場合 ケースによって手法が異なる [ ] の場合はメチル基の回転を行う Edit Group Rotate Group Around Bond を選択して マウスで表示画像から atom と選択する と 単独で存在する原 子があるのでうまくいか ないかもしれない と いう警告が出る これは 今回の場合 Pdb file の TER record を存在している ATOM と見てしまう事からくる TER record の処理 自体は後ほど行うので 警告は無視する

46 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 この作業を行う時に 後に ATOM record を持った pdb file が必要になるのに備える すなわち 変更したデータの Facio からの出力は HETATM record と CONECT record を持った形式となる ATOM record を持った形に戻すために 座標データが変更される原 子順番号を記録する事が重要である 今回 メチル基 339 の H 原子を の軸の周りに回転させれ ば解消すると見込まれるため メチ ル基の 3 つの水素原子が座標が 変更される これらの水素原子をマウスでヒッ トすると Facio's worksheet に原 子順番号が表示されるので それ を記録する fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb から該当する原子の情報を抜き書 346 きして 次ページの様な表を作成し ておくと後の処理がやり易い

47 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 なお 近接原子の検出は Utilities Find Small Interatomic Distance をクリックすることにより Facio's Worksheet に表示される

48 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb から該当する原子の情報を抜き書きして この様な表 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb.SID_list.txt を作成しておくと後の処理がやり易い

49 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 Edit Group Rotate Group Around Bond を選択 して マウスで表示画像中の Atom 337 atom 339 と選 択すると 変更パネルが出現する Rotation Angle を少しづつ 動かしていくと 画面のメチル 基も 軸の回りに少 しづつ動いていく 今回 47 度動かした このメチル基の問題は非特定 的な 水素原子付加 によっ て生じた事が容易に理解でき る 変更を決定後 Apply をクリ ックする

50 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 再度近接原子の警告が出る 同様に原子順番号 312, 366 を特定する これらは主鎖と芳香族環に付 いているものであり PDB data 自体の問題と思われる マニュアルでの移動は任意性 が大きすぎるので MM で行 うのが良い 今回 TYR を少し手動で回 転させる -60 度動かす 座標が変化する原子は多い ので注意して記録しておく

51 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 次に同様に が 出る これはメチル基の水素 なので [ ] 軸回転 により解消する 回転軸基 454 回転軸

52 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 今回 -50 度回す この様な作業を繰り返して 接近しすぎている原子の距 離を調整する 今回は理解のため手で行 うが 分子力場を使い自動 的に行うのが普通 次いで の原子が近接 しているという情報が出る

53 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 は OH 基の付加水素 なので これも回転で解消する 座標移動するのは 504 のみ 回転角は -60 度 以上で水素原子付加による原 子間のぶつかりを解消する File Save As (HETATM/CONECT) format PDB を選択する この時 TER record も 消去処理される 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio.out.pdb として保存する 以上の様に近接原子の生成は pdb データに無い 水素原子の自動 発生に起因するものが大きいという 事が理解できる MM で緩和する事 が一般に行われる 近接原子が生成すると GAMESS の SCF 計算が収束しない

54 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio.out.pdb 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H.pdb.SID_list.txt を参照して 座標が変化した原子の座 標値を元の pdb file に書き出して 別 の名で保存する 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio_CORR.pdb

55 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 ペプチド鎖とは分離しておいた REA について 水素原子の発生を行う Facio に REA の pdb ファイル 1fm9.REA.pdb を読み込む この中の CONECT record には水素は含まれていない Utilities Complete Missing Bond を選択して 各原 子の不足結合を算出する それから Utilities Complete Missing Hydrogen Atoms を選択して水素原子を発生させる File Save as (HETATM/CONECT) format PDB として結果を 1fm9.REA_H.pdb に書き出す

56 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 書き出した 1fm9.REA_H.pdb では原子順番号がリナンバーされている 分離しておいた RXR 鎖 pdb file と結合する時に順番号が混乱するので RXR の後に順番号が振られるよう にリナンバーする まず Facio に RXR 鎖の pdb 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio_CORR.pdb を読み 込ませ その上に File Load and Append Another Molecule をキックする 入力窓が 出るので その入力欄に 1fm9.REA_H.pdb をドラッグ ドロップして記載する Load and Append をキック する すると 座標系の変換指示の窓が 出るが 今回は 行わない

57 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 リナンバーされた pdb data を 1fm9.REA_H_RENUM.pdb に書き出す この file を TeraPad で開き リナンバーされた HETATM record 部分の REA と該当する CONECT record を切り出 して 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio_CORR.pdb の TER record が 3684 なのでその後部に 3685 から追加する 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio_CORR+REA_H.pdb で保存する

58 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 1fm9.RXR.spdbv_modTER_H_facio_CORR+REA_H.pdb で保存した RXR と REA のデータは元の PDB データから RXR 鎖と REA 鎖を抜き出して水素原子を補完したものとなる できたデータは欠落原子がないか 何度も確かめる これで 必要な形式のデータが準備された

59 RXR+REA+H の座標データが作成できたら FMO/GAMESS 入力データの作成に入る FMO FMO(GAMESS) Control Panel を Panel から クリックする Panel が出る Reset and Find Initial Fractioning Point を クリックすると warning が出る

60 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 上の WARNING は Facio で Fragment に分別すべきポイント を探している最中に REA の最初 に見つけた原子が端子ではない と見てとったようだ これは FMO ではなく Facio の仕様によるものと思われる REA ３６８４番 隣接して結合している REA ３６９９番と交換する

61 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 1fm9.RXR+REA-H2O_modTER_REACONrcv_H_2.pdb データを直接編集する TeraPad に file を読み込む 原子順番号を以下のように交換する 検索 置換 機能で 3684 XXXX 3699 YYYY XXXX 3699 YYYY 3684 次いで 順番になるように行を入れ替 える 1fm9.RXR+REA-H2O_modTER_REACONrcv_H_3.pdb で保存

62 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 再度 panel を起動すると 今度は原子順番号 3676 で warning が出る 3676 は A 鎖ペプチド終端の Proline の環内原子

63 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 REA と同様に 3676 を 3673 と スワップする TeraPad で置換を行う 3676 XXXX 3673 YYYY XXXX 3673 YYYY 3676 行の入れ替え 1fm9.SPDBV.RXR+REA-H2O_modTER_REACONrcv_H_5.pdb で保存 Proline 終端のカルボン酸の酸素原子が無い これはペプチド鎖の欠落のためだが 補完した 方が良いか Facio で再読み込みを行う

64 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 再度 FMO FMO(GAMESS) Control Panel を開き Reset and Find Initial Fractioning Point をクリックする Warning が出なくなった

65 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 Expert Mode, Show FMO Input Options にチェックすると FMO 計算パラメータ が設定できる ノード当たり core は 4 または 6 ノード当たり memory は 8GB

66 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 Make FMO Input をクリックすると入力データが作成される

67 FMO/GAMESS 入力ファイル作成 以上で FMO/GAMESS 入力データが作成された 内容について確認すること GAMESS のマニュアルに内容の詳細な説明がある 以降は 入力データファイルを計算サーバーに転送する サーバーで並列計算のシェルスクリプトの準備をする ジョブを投入する 出力結果を取り 計算サーバーから PC に出力ファイルを転送する 解析する を行う