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1 平成 24 年度長崎大学組換え DNA 実験講習会 2. 組換え DNA 実験申請に際しての留意点 岩田修永長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 ( 薬学系 ) 薬品生物工学分野

2 組換え DNA 実験申請に際しての留意点 遺伝子組換え実験を行う際のルールは国の法律であること 組換え DNA 実験安全委員会は 各部局から選出された教員で構成されていること

3 長崎大学組換え DNA 実験安全委員会委員名簿 定足数の2/3(12/17) 以上の委員の審査を持って 意見を取り纏め 委員長 ( 審査 ) へと進みます 官職指定 部局 職名 氏名 内線 保健医療推進センター 准教授 山崎浩則 ( 本 )2213 研究国際部 部長 河野 浩 ( 本 )2869 学長指定委員 ( 任期 : 平成 23 年 8 月 1 日 ~ 平成 25 年 7 月 31 日 ) 病院 講師 星野倫範 ( 病 )7674 学長指定委員 ( 任期 : 平成 24 年 4 月 1 日 ~ 平成 26 年 3 月 31 日 ) 委員長熱帯医学研究所 教授 安田二朗 ( 病 ) 7848 薬学部 教授 岩田修永 ( 本 ) 2435 医学部 准教授 林日出喜 ( 病 ) 7081 病院 教授 宮崎泰司 ( 病 ) 7109 熱帯医学研究所 講師 上村春樹 ( 病 ) 7838 歯学部 准教授 伊藤公成 ( 病 ) 7754 環境科学部 教授 宮西隆幸 ( 本 ) 2768 水産学部 教授 長富 潔 ( 本 ) 2835 教育学部 教授 上薗恒太郎 ( 本 ) 2386 医学部 教授 吉浦孝一郎 ( 病 ) 7118 歯学部 准教授 内藤真理子 ( 病 ) 4253 工学部 准教授 郷田秀一郎 ( 本 ) 2685 先導生命科学研究支援センター 教授 大沢一貴 ( 病 ) 7133 安全主任者 ( 任期 : 平成 24 年 4 月 1 日 ~ 平成 26 年 3 月 31 日 ) 先導生命科学研究支援センター 准教授 木住野達也 ( 病 ) 7191 副安全主任者 ( 任期 : 平成 24 年 4 月 1 日 ~ 平成 26 年 3 月 31 日 ) 薬学部 教授 武田弘資 ( 本 ) 2417

4 2. 教職員ポータル 1. 教職員の皆さまへ

5 4. 申請者の ID で log in 3. 統合認証システム

6 XXXXXX 5. 組換え DNA 実験計画申請 Web システム 新規 変更 終了 譲渡 分与 報告書 マニュアル等 すべてここにあります

7 クリックして下さい XXXXXX

8 6. 組換えDNA 実験講習会の受講記録 XXXXXX 実験責任者 実験従事者の状況を確認してください 別ウインドウで開きます 7. 新規申請

9 XXXXXX 9. 譲渡 分与 の計画書 情報提供書 別ウインドウで開きます 8. 終了 譲渡 分与 報告書 マニュアル等 はここにあります

10 1 記入者情報の入力このアドレスに連絡メールが届きます ログインユーザー以外に実験計画書のデータを参照させたい場合に 記入して下さい XXXXXX 2 実験責任者は 研究の全容を把握し 実験従事者の安全の確保に努めてください 実験責任者 : 組換え実験の経験 3 年以内の組換えDNA 実験講習会受講 [ またはDVDでの受講 ] 1 年以内の健康診断受診の記入が必要です 3 可能であれば 所属する部局の委員に申請前に委員に内容のチェックをお願いして下さい ここに記入した委員にも 実験計画を申請した旨 メールが届きます マウスポインタを近づけると 注釈が表示されます

11 4 実験の区分と封じ込めレベルを決定 組換え DNA 動物実験のみの時は P1A, P2A, P3A のみにチェック DNA 供与体と宿主の組み合わせ 物理的封じ込めレベルの判断 実験計画の内容に基づいて決定 1) P1 と P2 以上 では委員会の審査の流れが大きく異なります P1: 委員長の確認 判断で迅速審査が行われます P2, P3: 委員会の委員全員での審査になります FAQ1) 一時保存の方法組換え DNA 申請者用マニュアルをご覧ください 本来 P1 のものを P2, P3 として申請すると 時間 + 手間 = 迅速な審査の妨げ になります 2) 本来 P1 の扱いだが P2 の実験区域で作業するので P2 実験に準じた取り扱いをする 場合 P1 として申請し 備考の欄に上記を記入して下さい 参照 ) 遺伝子組換え生物の第二種使用等について ( 特に p ページ )

12

13 レベルダウン

14

15 重要 レベルアップ

16 5 課題名の入力 当然ですが 研究内容を適切に示す課題名にして下さい 6 実施期間 5 年以内で入力してください 7 実験従事者 3 年内の組換え DNA 実験講習会の受講 [ または DVD での受講 ] 1 年以内の健康診断受診が必要です 表示する項目数の変更が可能です FAQ2) 実験責任者の実験の経験欄の記入の方法本学あるいは他大学で過去に実施した組換え DNA 実験の課題番号および課題名 ( 最新のも 1 件 ) を記入 申請ボタン : 申請内容に記入漏れがないか自動的にチェックしてくれます

17 8 実験の目的 詳細に記載して下さい (1) 実験の内容のどの部分が組換え DNA 実験なのか? (2) 動物を用いる実験を行うのか? DNA 組換え体 ( 細菌 マウス等 ) の分与を受ける場合 また作成を外部に依頼する際 ( ノックアウトマウス作成 ) は 分与元 依頼先 ( 研究者名だけでなく所属 ) や参考文献を明記して下さい 9 実験の概要詳細に記載して下さい (3) どこで実験するのか? 各実験ごとに実施する実験室を明記 ( 実験施設のチェックのため 室名までお願いします ) 例 ) 1. 遺伝子クローングや遺伝子発現のためのプラスミド DNA を構築し さらにそのプラスミドを大量調製するために大腸菌を形質転換する 2. 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製 :BSL 3 の細菌の遺伝子をプラスミド (pet28a) に組み込んだものを 大学 学部 氏より分与してもらう ( 文献 ) これを大腸菌 [BL21(DE3)] に導入し リコンビナントタンパク質を調製する 3. 遺伝子改変動物 ( ノックアウトマウスなど ) を購入 導入 ( 入手先を記載 ) 繁殖して実験に用いる 動物実験の申請が必要です ( 申請書のアップロード ) 4. ウイルスベクターを用いた動物細胞および動物個体への遺伝子導入と感染実験 社のキット ( ) を用いてリコンビナントレンチウイルスベクターを作製し HEK293 細胞やマウス ( tg マウス KO マウス ) の脳に遺伝子導入する 5 バキロウイルスを用いて作製したリコンビナントタンパク質の購入

18 10 DNA 供与体 宿主の組み合わせ詳細に記載して下さい 例 ) ヒト (Homo sapiens) マウス (Mus musculus) ラット (Rattus norvegicus) オワンクラゲ (Aequorea victoria) 非病原性大腸菌 (Escherichia coli) 宿主がウイルスの場合 保有細胞 動植物種を記載して下さい ) 注意事項 : DNA 供与体の生物種名菌種名 株名を正確に明記して下さい その他 や など 曖昧な表現は NG です 株によって BSL レベルが異なる菌は株名まで記入して下さい DNA 供与体 ベクター内の DNA や遺伝子 (CMV プロモーターなど ) 注 ) ノックアウトマウスに組み込まれたネオマイシン耐性遺伝子 loxp 配列や GFP, Cre リコンビナーゼ等について記載漏れが多々あります 忘れずに記載して下さい カルタヘナ法では培養細胞は宿主として扱われませんので ご注意ください 注 ) 文科省の説明資料 ( 平成 18 年 10 月 ) には ベクター内に含まれる薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子と 目的遺伝子に係るものを除く発現調節遺伝子である供与核酸が由来する核酸供与体の特性または供与核酸の特性に関しては記載を省略できる 旨記載されていますが DNA 供与体 宿主の組み合わせを省略して良いとは記載されていません 上記を拡大解釈し ノックアウトマウス ( 供与核酸 : 大腸菌 ネオマイシン耐性遺伝子 ) を非 LMO とすることは問題があります プラスミドに含まれる CMV プロモーターを組換えて レンチウイルスベクターに組み込む場合など 明らかに LMO になります

19 11 ベクターの特性 核酸供与体の特性詳細に記載して下さい 核酸供与体ならびに供与核酸のとくせいについて記載して下さい また 毒素産生性の有無 哺乳動物に対する毒性があれば 明記して下さい ベクターの特性例 ) 1. puc 系 (pbluescript 等 ) の大腸菌用のクローニングベクター ( 参考資料としてマップ添付もしくは販売元会社名 ) 2. pbr322 系 :ptrc (Invitrogen), pet (Novagen), pqe (Qiagen) 等の大腸菌の発現用プラスミドベクター 3. puc 系 (pcdna3 等 ) 哺乳類細胞発現用プラスミドベクター (Invitrogen) 4. アデノ随伴ウイルス作製用プラスミドベクター (pw1,p5clz,pim45,pladeno1 等 : 参考資料 10[ 自作ベクターはマップを添付 ]) 5. plenti 系レンチウイルス作製用プラスミドベクター (plenti6.3, plenti7.3 等 : Invitrogen) 核酸供与体の特性例 ) 1. ヒト マウス ラット cdnaおよびゲノム断片 ( 同定済み遺伝子 ) 2. 大腸菌 ( 同定済み遺伝子 ): 薬剤耐性遺伝子 ( アンピシリン カナマイシン ネオマイシン テトラサイクリン耐性遺伝子等 ): 省略可 3. 有鞘類オワンクラゲ ( 同定済み遺伝子 ): 蛍光タンパク質遺伝子 (EGFP, YFP 等 ) 4. Renillaウミシイタケ ( 同定済み遺伝子 ): 蛍光タンパク質遺伝子 (ZsGreen, DeRed 等 ) 核酸供与体 5. バクテリオファージ科 P1ファージ ( 同定済み遺伝子 ): Cre リコンビナーゼ loxp 配列 ( 組換え酵素認識配列 ) 6. 上記に加え P1ファージエンハンサー 各種発現用プロモーター ポリアデニン付加シグナルは 哺乳類細胞内で翻訳されないため病原性等をもたない : 省略可 7. 本実験に使用する組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えレンチウイルスは自己増殖に必要な遺伝子を欠失しているため二次的なウイルス粒子を産生 ( 増殖 ) し 伝播することはなく 大臣確認実験には該当しない ウイルス粒子から毒素は産生しない 組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えレンチウイルスのバイオセーフティーレベルは 各々レベル1およびレベル2である

20 DNA 供与体 宿主の確認 DNA 供与体 宿主の区分は 下記のサイトを参考にして 注意深く記載してください 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件平成 16 年文部科学省告示第 7 号最終改正 : 平成 22 年 1 月 15 日 改正点についてはこちらを参照 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件の一部を改正する告示 ( 平成 22 年 1 月 15 日 ) についての解説

21 宿主 ベクターの確認

22 宿主 ベクターの確認

23 Competent cell: BL21(DE3) は 遺伝子組換え体です (1) 宿主情報宿主名 : BL21( 由来 : E.coli B 株 ) 導入遺伝子 : T7 RNA Polymerase 遺伝子 ( 由来 : T7 ファージ ) DE3 遺伝子 ( 由来 : λ ファージ ) (2) 遺伝子型 F, ompt, hsdsb (rb, mb ), dcm, gal, λ(de3), plyss (Cmr)

24 11 使用する実験室 次頁に解説 室名を正確に記入し 部屋番号を 施設部 ( 事務 ) 管理の室番号か動物実験施設の室番号かいずれかで統一表記して下さい アップロードした図面での部屋番で記載して下さい 12 関連する実験の申請書例 ) 動物実験申請書 ( または申請状況を記載する ) 遺伝子改変動物を入手して使用する場合 入手先を記載 : 学外からの譲渡等の場合は譲渡の計画書と先方からの情報提供書 以前の実験の継続のために新規に申請する場合 以前の申請書 PDFファイルや画像ファイルを添付資料としてアップロードできます 一般的でないベクターについてププ FAQ3) 参照する実験計画書のリンク方法プルダウンしますと 動物か遺伝子か聞いてきますので どちらかを選択後 左の整理番号を入力してリターンボタンをクリックすると自動的にリンクします

25 どこの実験室を使用するのか? 1. 使用を希望する実験室の BSL レベルの確認実験計画の内容に基づいて決定したレベル以上の実験室を使用して下さい 組換え DNA 実験室として登録してある実験室名登録されてない実験室 部局の委員に相談 委員のチェックを受けて登録 2. 申請者の実験室外で実験を行う場合 実験室の責任者に使用の許可を得てください 組換え DNA 実験室の入り口に責任者名が表記されている 例 : 動物実験 先導生命科学研究支援センター棟 : 動物実験施設 Tg マウス飼育室 (404) 封じ込めレベル : P1A 図面 : pdf

26 13 訂正箇所修正等のために差し戻された場合 再提出の際 修正した点について まとめて記載して下さい

27 変更申請について 14 変更 追加申請ここをクリックして下さい (( この画面では になっていますが 承認されている課題についてはクリックできます ))

28 15 変更事項 変更理由 訂正箇所を記入して下さい 変更申請について ( 従来 ) 変更申請で OK なのは 実験従事者の削除 追加 所属等変更 同じクラスの核酸供与体の追加など軽微な変更 ( ただし DNA 供与体の種の追加については 科が同じであれば P1 レベルのみ変更 追加申請 ) 部局担当者 xxxxxxxxx 例 ) 実験従事者として以下の2 名を追加 薬学部学部生 薬学部学部生組換えDNA 実験を行うため 委員長決済 ( 今後 ) 上記に加え 異なるクラスの核酸供与体の追加や実験室の追加 変更も可 ( 実験責任者 課題名 実験の目的等の重大な変更については変更ではなく新規の計画として申請すること ) 部局担当者 委員長判断で 部局担当者もしくは委員全員の審査に委ねるかを決定

29 大臣確認実験申請書 ( 第二種使用等拡散防止措置確認申請書 ) 申請書の様式は 文部科学省の遺伝子組換え実験の HP からダウンロードできます 記入法や注意点は 文部科学省の遺伝子組換え実験の HP 遺伝子組換え生物等の第二種使用等の手引き および日本ウイルス学会の HP を参照してください 記入例 ) arta_expla08.pdf

30 第二種使用等に係る大臣確認の手続きの流れと審査スケジュールについて 実験実施機関における実験の企画 立案 実験実施機関から文部科学省研究振興局ライフサイエンス課への連絡 < 申請書のドラフトを送付 > 委員会開催日の 1 か月前位 文部科学省研究振興局ライフサイエンス課担当官による申請書の事前チェック 事前チェック終了後 担当官の連絡を受けてから 申請書 ( 職印付き ) を提出 委員会開催日の 10 日 -2 週間前位 文部科学省科学技術 学術審議会生命倫理 安全部会組換え DNA 技術等専門委員会による審議 ( 年 6 回程度開催 ) 審議終了後 文部科学大臣による確認 通常 委員会開催後 2-3 週間程度 確認 ( 公文受理 ) 後 実験実施機関における実験の開始

31 実験実施場所および保管施設に必要な表示について 遺伝子組換え実験時は 実験内容に応じた表示をし 扉は閉める ( 遺伝子組換え生物等の培養 飼育および栽培も含む 実験に使用する遺伝子組換え生物等を実験室で保管する場合も 法令上は 実験中 となりますので 同様の措置を取ってください 実験を行わず 実験室の扉を開放する場合は 表示をしない 実験中を示す表示をしている場合は 実験室の扉を閉めておく 扉の開放 閉鎖にかかわらず 外部の者がみだりに立ち入らぬように 関係者以外立ち入り禁止の表示を行う 実験の種類 拡散防止措置区分 拡散防止措置区分応じた表示 微生物使用実験 P1 ( 表示義務がありません ) P2 P2 レベル実験中 動物使用実験 1 P1A 遺伝子組換え動物等飼育中 P2A 遺伝子組換え動物等飼育中 (P2) 植物等使用実験 1 P1A 遺伝子組換え植物等栽培中 P2A 遺伝子組換え植物等栽培中 (P2) 1 動物使用実験は動物作成実験と動物接種実験を 植物等使用実験は植物等作成実験と植物等接種実験を含みます

32 実験実施場所および保管施設に必要な表示について 実験室の扉 冷蔵 冷凍庫 組換え体保管中 (P2)

33 組換え体の授受について 遺伝子改変動物 ( ノックアウトマウス トランスジェニックマウスなど ) 遺伝子組換え生物 ( 細菌等 ) 購入する もらって導入する あげる 預ける 1. 譲渡 提供 委託の計画書を DNA 組換え実験安全委員会に提出情報提供書も付けてください 学内様式 : 動植物個体又はその子孫の譲渡等の計画書 ( 様式 1)(Word ファイル ) 学内様式 : 遺伝子組換え生物等の譲渡 提供 委託に際しての情報提供書 ( 様式 2)(Word ファイル ) 学内様式 : 動植物個体又はその子孫の譲受等の計画書 ( 様式 3)(Word ファイル ) 海外へ輸出する場合は 第 37 条 3 項の規定により 様式 14 の表示が必要です 2. DNA 組換え実験安全委員会の承認をもらう 3. 実際に 遺伝子改変動物 遺伝子組換え生物のやり取りを行う ( 譲渡の際は 情報提供書を先方に必ず渡すこと ) 昨年 4 月から 計画書 情報提供書とも書式が変更してます 譲渡書類は手続きに数日かかるため余裕を持って提出してください 不明な点があれば 申請前に 部局の組換え DNA 実験安全委員会委員にご相談下さい

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