19-2 肥満・高脂血症・糖尿病モデル動物の発がん感受性と発がん機構に関する研究

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あいとくぬぎ
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1 19-2 肥満高脂血症糖尿病モデル動物の発がん感受性と発がん機構に関する研究主任研究者国立がんセンター研究所高橋真美研究成果の要旨高脂肪食はハムスターの高脂血症を増悪させ BOP 誘発膵管発がんを促進した II 型糖尿病モデルの KK-A y マウスは顕著な高脂血症を呈しており C57BL/6J マウスに比べて AOM 誘発 ACF の発生数が有意に多く大腸発がん高感受性であることが示唆された大腸発がん感受性の異なる 2 つのラットの系統で溶媒もしくは PhIP 投与時の大腸腺管での mirna の発現に系統差が見られたレプチン受容体遺伝子に異常のある Zucker 雌ラットのヘテロ接合体 (+/fa) では野生型 (+/+) ラットに比し DMBA 誘発乳腺腫瘍が早期に発生し腺がんの発生頻度及び数も +/fa で増加傾向を示したまた遺伝子型に関わらずコーン油添加飼料は血清レプチン値を上昇させ腫瘍体積を増加させる傾向を示した高脂肪食を摂取させた A/J マウスは高コレステロール血症を呈し NNK 誘発肺腫瘍の発生個数及び腫瘍径は増加する傾向を示した高脂肪食メチル基供与体を多く含むメチル化促進飼料を授乳期の母親に与え仔マウスの体重変化への影響を検討したところ高脂肪食による体重増加がメチル化促進飼料により抑制された研究者名および所属施設研究者名高橋真美廣瀬善信今井俊夫久野壽也落合雅子亀井康富所属施設および職名国立がんセンター研究所室長岐阜大学医学部附属病院准教授国立医薬品食品衛生研究所室長香川大学医学部准教授国立がんセンター研究所主任研究官東京医科歯科大学准教授分担研究課題膵臓大腸発がんにおける肥満高脂血症糖尿病の関与大腸肝発がんにおける肥満及び糖尿病の関与肥満ラットを用いた乳腺発がんに関わる内的因子の探索肺発がんにおける肥満高脂血症糖尿病の関与 PhIP 誘発発がんモデルを用いた肥満高脂血症の発がんヘの関与と発がん機構に関する研究肥満糖尿病モデルマウスにおける発がん関連因子の発現調節機構の研究研究報告 1 研究目的 -1-

2 本研究では肥満高脂血症糖尿病モデル動物を用いこれらの病態が発がんに及ぼす影響を調べそのメカニズムを明らかにすることを目的とするこれらの病態と発がんとの関連性が明らかになればがん予防法を確立する上で有用な基礎的研究資料を提供できる本年度は特に高脂血症や高脂肪食が発がんに及ぼす影響について検討を行なった 2 研究方法および成果シリアンゴールデンハムスターは通常食摂取時において既に高脂血症状態でありこの高脂血症が膵管発がん促進に寄与している可能性が考えられるそこでさらに高脂肪食を負荷した場合の血清脂質レベルおよび膵管発がんに対する影響を検討した 6 週齢の雌性シリアンゴールデンハムスターに基礎食として CE-2 diet ( 粗脂肪 4.7% 日本クレア製) を摂取させ N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine(BOP) を 10 mg/kg 体重の用量で一日おきに 4 回皮下投与したその後 8 週齢から 23 週齢まで高脂肪食群には Quick Fat diet( 粗脂肪 14.3% 日本クレア製) を投与し血清脂質レベル及び膵臓病変に対する高脂肪食の影響を基礎食群との比較により検討したその結果高脂肪食群では体重が有意に増加し内臓脂肪量も増加傾向が見られたまた血清のトリグリセリド (TG) 値と総コレステロール値が顕著に上昇した (TG 563 mg/dl 総コレステロール 304 mg/dl) 膵管発がんへの影響について検討したところ前がん病変の異型過形成の発生率が高脂肪食で 3 倍になり個数も 8 倍と顕著に増加したまた膵管がんの発生個数も 2 倍以上に増加した発生した膵管がんのサイズを見ると特に 0.1mm 以下の微小ながんの発生数が増加していることがわかった以上の結果より高脂肪食はハムスターの高脂血症を増悪させ BOP 誘発膵管発がんを促進することが示唆された II 型糖尿病モデルの KK-A y マウスは過食により肥満を呈し糖尿病および高脂血症を高率に発症するそこで KK-A y マウス及び対照として C57BL/6J マウスを用いアゾキシメタン (AOM) 誘発マウス大腸アベラントクリプトフォーサイ (ACF) の形成を指標として糖尿病や高脂血症の大腸発がんへの影響を検討した大腸発がん物質のアゾキシメタンをマウスに投与し 8 週間後の ACF を解析したところ C57BL/6J マウスに比べ KK-A y マウスでは約 4 倍多く ACF の発生が認められ大腸発がん高感受性であることが示唆された体重は 13 週齢時には KK-A y が倍以上重く肥満を呈しており脂肪細胞が肥大化して炎症細胞の数が有意に増加していたさらに KK-A y マウスは顕著な高脂血症を呈しており 13 週齢時の血清脂質値は C57BL/6J に比べ TG 値が約 9 倍総コレステロール値が約 3 倍高値であったまたインスリンレプチンの値が顕著に高く他にも Pai-1 や IL-6 の値が高くなっておりこれらが大腸発がんに促進的に作用する可能性が考えられた ( 高橋 ) レプチン関連の遺伝子異常によって過食となり肥満を呈する db マウスあるいは ob マウスでは食餌制限下での大腸発がん短期試験にて azoxymethane(aom) で誘発される大腸粘膜内微少病変数が有意に増加することが示されている昨年度は db マウスを用いて AOM/dextran sodium sulfate (AOM/DSS) 誘発大腸発がん長期試験を行ない誘発される腫瘍のサイズが有意に増加することを示した今回は ob マウスを用いた AOM/DSS 誘発大腸発がん長期試験を行いその大腸発がん感受性について検討したまた db マウスにおいても前回より弱い今回の発がん条件にて再度検討した 5 週齢雄 ob/ob マウス (17 匹 ) と lean mice(38 匹 ) に AOM を 10mg/kg の濃度で腹腔内投与しその 1 週後から 1 週間の間 1.5%DSS を飲水投与した実験は飽食の状態で行い 23 週齢にて病理解析を行った 5 週齢雄 db マウス ( ホモ 26 匹, 対照群 25 匹 ) についても同様のプロトコールにて再実験を行った実験終了時には ob 及び db ホモマウスは著明な肥満を呈しており高脂血症高血糖の状態であった大腸においては ob ホモマウス及び対照群の腫瘍発生率と発生数はそれぞれ 47% vs 45% 1.1±1.5 vs 0.7±1.3 であり群間に有意差はなかった腫瘍サイズも ob ホモマウス群と対照群に有意差はなかったまた同様のプロトコールにおける db ホモマウス群と対照群における大腸腫瘍発生率発生数はそれぞれ 8% vs 12% 0.1±0.3 vs 0.2±0.8 であり群間に有意差はなかった腫瘍サイズにも有意差はなかったこれらの結果から ob マウスでの AOM/DSS 誘発大腸発がん感受性が対照群マウスに比べて亢進しているとは言えなかったしかし今回の ob マウスと db マウスの実験結果を比較すると腫瘍誘発率腫瘍発生数ともに ob マウスの方が db マウスよりも有意に多くこの二種類のマウスには発がん感受性の有意な系統差が存在することが示唆された ( 廣瀬 ) PhIP 誘発ラット大腸発がんモデルにおいて KAD NAR 及び F344 と ACI ラットの 3 種の動物モデルを用いて発がん感受性と高脂血症の関連を解析しその機構 -2-

3 の解明を目指した KAD (Kyoto Apc delta) ラットは短期間欠投与法で開始後 32 週では homozygote heterozygote が野性型よりも PhIP による大腸発がん誘発性が高い傾向が認められたが血清 TG 値は遺伝子型による違いが認められなかった KAD rat の高脂血症は若年齢の時期のみ観察され KAD ラットの大腸発がん誘発性が高い傾向とは関連していない可能性が示唆された NAR(Nagase analbuminemic rat) は親系統の SD ラットと比較して高コレステロール血症である投与開始後 12 週において NAR は SD に比較して ACF 誘発性は高感受性の傾向が認められたが 32 週においては肉眼的観察では大腸腫瘍の誘発性に系統間で差は認められなかった現在微小な腫瘍性病変等の誘発性を検討中である F344 は ACI 系統よりも血清 TG 値が高く内臓脂肪の蓄積も顕著である F344 と ACI 系統の大腸腺管を用いて microrna (mirna) の網羅的発現解析を行なった 350 種類の mirna のうち約 190 種類が大腸腺管において発現していた F344 と ACI 間で発現量が 10 倍以上違う mirna もあれば F344 で発現上昇しており脂肪細胞の分化との関連が報告されている mirna もあった溶媒もしくは PhIP 投与群のどちらかで F344 が ACI に比較して 2 倍以上発現が変化しておりかつ有意差が認められた mirna は F344 で発現増加が 4 個発現抑制が 6 個であった両系統間で発現変化が認められた mirna が大腸発がん及び高脂血症や内臓脂肪の蓄積に及ぼす影響や大腸発がんに関与する分子機構を今後解析する予定である ( 落合 ) 肥満により乳がんのリスクが増加することが指摘されているがその詳細は明らかではない本研究では乳腺発がんに関わる可能性のある肥満関連内的因子としてレプチンに着目し昨年度は突然変異レプチン受容体遺伝子 fa を持つ Zucker ラットのヘテロ接合体 (+/fa) では 6 週齢において野生型 (+/+) に比し血清中および脂肪組織中レプチン濃度が高いことを示したまた 7 週齢の +/+ 及び +/fa を基礎飼料あるいはコーン油添加飼料で 12 週齢まで飼育した際の血清生化学検査値 ( 血糖 TG 総コレステロール HDL- 及び LDL-コレステロールインシュリンレプチン ) を比較したところコーン油群では遺伝子型に関わらず TG 値の低下傾向及びレプチン値の上昇が見られその他の項目には明らかな影響はみられなかったそこで +/+ 及び +/fa の Zucker ラットを用いて 7,12-dimethylbenz(a)-anthracene(DMBA) 誘発乳腺発がんに対する高脂肪食 (10% コーン油添加飼料 ) の影響を解析した 32 週間の実験期間中の体重は基礎飼料群に比しコーン油群では増加したが遺伝子型による明らかな差は認められなかった触診による観察では +/+ に比し +/fa では早期に乳腺腫瘍が発生しその頻度及び数は増加あるいは増加傾向を示した病理組織学的解析でも乳腺腫瘍の発生頻度及び数は +/+ に比して +/fa で増加傾向を示した一方 +/+ 及び +/fa の何れにおいても基礎飼料群に比しコーン油群では腫瘍体積が増加傾向を示したまた発がん実験の剖検時における血清レプチン値には遺伝子型による差がみられず基礎飼料群に比しコーン油群では高値を示したこれらの結果からレプチンは乳腺発がんに対する感受性を高め発生した乳腺腫瘍に対してはその発育を促進する可能性のあることが示された今後 DMBA 誘発ラット乳腺発がんに対する外因性レプチンの影響等について更なる検討が必要である ( 今井 ) マウスに糖尿病を起こす薬剤であるストレプトゾシン (STZ) に肺腫瘍誘発能があることから糖尿病を来す STZ の量観察期間と肺腫瘍の関係および STZ のアグリコンであるメチルニトロソウレア (MNU) を用いて STZ の肺特異性を検討した STZ(50 mg/kg) を 4 回投与すると糖尿病状態となり 8 週間で全頭に肺腫瘍を認めた STZ(50 mg/kg)1 回投与では糖尿病は発症しないが 16 週で全頭に肺腫瘍が観察された等モル量の STZ MNU 投与の比較では投与後 16 週でいずれにも高率に肺腫瘍を生じたが 1 匹あたりの肺腫瘍数は STZ 群が有意に多かった以上より STZ は MNU と比較して肺上皮細胞に特異的に取り込まれる可能性が示唆された次に遺伝的な肥満及び糖尿病状態の化学肺発がんへの影響を検討するため肥満 II 型糖尿病を示すレプチンレセプター欠如 (db/db) およびレプチン分泌不全 (ob/ob) マウス ( 雌性 6 週齢 ) に肺発がん物質である NNK を投与しそのワイルドマウスとの腫瘍発生を比較検討したこれらのマウスは NNK に対してほとんど感受性を示さずいずれも肺に腫瘍を認めなかった以上の結果から系統投与量観察期間のさらなる検討が必要と考えられた最後に肺腫瘍に対する食餌性の高脂血症の影響を明らかにするため 7 週齢雌性 A/J マウスに 2 mg/body の NNK を投与し誘発される肺腫瘍に対する高脂肪食の修飾効果を検討した実験終了時高脂肪食群には高コレステロール血症を認めた 1 匹あたりの腫瘍数腫瘍径は週のいずれの段階でも高脂肪食によって増加する傾向を認めたが統計学的な差は認められなかった食餌性高脂血 -3-

4 症が肺腫瘍に対して促進的に働く事が明らかになったが A/J マウスが肥満抵抗性の系統であることから系統の変更や実験期間を検討すべきと考えられた ( 久野 ) 肥満マウスの肥大化脂肪細胞においてインプリンティング遺伝子 Mestの発現が著しく増大しているしかし肥満や生活習慣病のエピジェネティクス制御の分子機構については全く知見がない DNAメチル化が肥満プログラムに関与するかを調べるためメチル化促進飼料を与え肥満に対してどのように影響するかを検討したメチル基供与体を多く含むメチル化促進飼料を授乳期の母親に与え離乳後は仔マウスに普通食または高脂肪食を摂取させて体重変化への影響を調べた普通食を与えた仔マウスでは親に与えたメチル化促進飼料の影響は見られなかった一方高脂肪食を与えた仔マウスでは親にメチル化促進飼料を与えていた場合に高脂肪食による体重増加の程度が抑制された以上より肥満には遺伝子のメチル化による制御が関与している可能性が示唆された ( 亀井 ) 3 倫理面への配慮動物は必要最小限数を用い各所属施設の動物実験倫理委員会の承認を得て実験動物取扱い ( 倫理 ) 規定を遵守し飼育実験を行なった研究成果の刊行発表外国語論文 1. Takahashi, M., Kitahashi, T., Ishigamori, R.,Mutoh, M., Komiya, M., Sato, H., Kamanaka, Y., Naka, M., Maruyama, T., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Increased expression of inducible nitric oxide synthase (inos) in N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine-induced hamster pancreatic carcinogenesis and prevention of cancer development by ONO-1714, an inos inhibitor. Carcinogenesis, 29: , 2. Mutoh, M., Niho, N., Komiya, M., Takahashi, M., Ohtsubo, R., Nakatogawa, K., Ueda, K., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Plasminogen activator inhibitor-1 (Pai-1) blockers suppress intestinal polyp formation in Min mice. Carcinogenesis, 29: , 3. Kitahashi, T., Takahashi, M., Yamada, Y., Oghiso, Y., Yokohira, M., Imaida, K., Tsutsumi, M., Takasuka, N., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Occurrence of mutations in the epidermal growth factor receptor gene in X-ray-induced rat lung tumors. Cancer Sci., 99: , 4. Takasuka, N., Takahashi, M., Hori, Y., Kitahashi, T., Iigo, M., Imai, T., Yoshimi, N., Sugimura, T., Wakabayashi, K. Promotion of mouse two-stage skin carcinogenesis by diacylglycerol-rich edible oil. Cancer Lett., 275: , Mori. H., Hirose, Y., et al. Precancerous conditions of the colon; multistage carcinogenesis in animal models. Int. J. Cancer Prev., 2: , 6. Shimizu, M., Hirose, Y., et al. EGCG suppresses azoxymethane-induced colonic premalignant lesions in male C57ML/KsJ-db/db mice. Cancer Prev. Res., 1: , Hirata, A., Imai, T., et al. Carcinogenic risk of heterocyclic amines in combination - assessment with a liver initiation model. Food Chem. Toxicol., 46: , 8. Cho, Y.M., Imai, T., et al. A new medium-term rat colorectal bioassay applying neoplastic lesions as end points for detection of carcinogenesis modifier- Effects with weak or controversial modifiers. Toxicol. Pathol. 36: , 9. Imai, T., et al. Modifying effects of prepubertal exposure to potassium perchlorate and tetrabromobisphenol A on susceptibility to N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine- and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-induced carcinogenesis in rats. Toxicol. Lett., 185: , Kuno, T., et al. Lack of modifying potential of 8-methoxypsoralen in the promotion or progression stages of lung carcinogenesis in A/J female mice. Oncol. Rep., 20: , 11. Yokohira, M., Kuno, T., et al. Establishment of a bioassay model for lung cancer chemoprevention initiated with 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon e (NNK) in female A/J mice. Exp. Toxicol. Pathol., -4-

5 60: , 12. Yokohira, M., Kuno, T., et al. Potential inhibitory effects of D-allose, a rare sugar, on liver preneoplastic lesion development in F344 rat medium-term bioassay. J. Biosci. Bioeng., 105: , 13. Yokohira, M., Kuno, T., et al. A 90-day toxicity study of L-asparagine, a food additive, in F344 rats. Food Chem. Toxicol., 46: , 14. Yokohira, M., Kuno, T., et al. Lung toxicity of 16 fine particles on intratracheal instillation in a bioassay model using F344 male rats. Toxicol Pathol., 36: , 15. Tomita, H., Kuno, T., et al. N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced gastric carcinogenesis in rats. Oncol. Rep., 19: 11-15, 16. Matsuda, Y., Kuno, T., et al. One-year chronic toxicity study of Aloe arborescens Miller var. natalensis Berger in Wistar Hannover rats. A pilot study. Food Chem. Toxicol., 46: , 17. Kamei, Y., et al. Regulation of SREBP1c gene expression in the skeletal muscle: role of RXR/LXR and FOXO1. Endocrinol., 149: , 18. Miura, S., Kamei, Y., et al. Isoform-Specific Increases in Murine Skeletal Muscle Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma Coactivator-1alpha (PGC-1alpha) mrna in Response to beta2-adrenergic Receptor Activation and Exercise. Endocrinol., 149: , 19. Toyoda, T., Kamei, Y., et al. Effect of peroxisome proliferator-activated receptor alpha ligands in the interaction between adipocytes and macrophages in obese adipose tissue. Obesity, 16: , 20. Yamada, H., Kamei, Y., et al. In vivo and In vitro Inhibition of Monocyte Adhesion to Endothelial Cells and Endothelial Adhesion Molecules by Eicosapentaenoic Acid. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 28: , 21. Ito, A., Kamei, Y., et al. Role of C-C chemokine receptor 2 in bone marrow cells in the recruitment of macrophages into obese adipose tissue. J. Biol. Chem., 283: , 22. Miura, S., Kamei, Y., et al. 2-AMPK activity is not essential for an increase in fatty acid oxidation during low-intensity exercise. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 296: E47-E55,

られる糖尿病を合併した高血圧の治療の薬物治療の第一選択薬はアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬とアンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) であるこのクラスの薬剤は単なる降圧効果のみならず様々な臓器保護作用を有しているが ACE 阻害薬や ARB のプラセボ比較試験で糖尿病の新規

られる糖尿病を合併した高血圧の治療の薬物治療の第一選択薬はアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬とアンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) であるこのクラスの薬剤は単なる降圧効果のみならず様々な臓器保護作用を有しているが ACE 阻害薬や ARB のプラセボ比較試験で糖尿病の新規論文の内容の要旨論文題目アンジオテンシン受容体拮抗薬テルミサルタンのメタボリックシンドロームに対する効果の検討指導教員門脇孝教授東京大学大学院医学系研究科平成 19 年 4 月入学医学博士課程内科学専攻氏名廣瀬理沙要旨背景目的わが国の死因の第二位と第三位を占める心筋梗塞や脳梗塞などの心血管疾患を引き起こす基盤となる病態として過剰なエネルギー摂取と運動不足などの生活習慣により内臓脂肪が蓄積する内臓脂肪型肥満を中心に