H27_大和証券_研究業績_C本文_p indd

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ありおきしげまつ
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1 肝星細胞遊離コレステロール代謝機構を標的とした非アルコール性脂肪肝炎を含む慢性肝疾患の新規診断法治療法の解明防衛医科大学校消化器内科講師冨田謙吾 ( 共同研究者 ) 慶應義塾大学医学部消化器内科専任講師海老沼浩利慶應義塾大学医学部消化器内科特任助教寺谷俊昭はじめに 1) 非アルコール性脂肪肝炎 (Nonalcoholic steatohepatitis: NASH) はメタボリックシンドロームの肝臓での表現形と考えられている肥満人口の増加に伴い増加の一途にある NASHは一部が肝硬変まで進展する進行性の疾患であり肝発癌も引き起こすため治療法の確立は緊急課題であるこの飽食の時代にメタボリックシンドロームを有する患者数が増加し NASHを含む肝臓病患者でも高コレステロール食摂取高コレステロール血症を有する患者が増加している高コレステロール食摂取は NASHを含む肝臓病発症進展の独立した危険因子と考えられているがその病態機序の詳細は明らかとなっていない最近我々は食事由来のコレステロールが肝臓構成細胞の 1 つである肝星細胞に遊離コレステロールとして蓄積し TLR4 シグナルの増強を介して肝星細胞のTGFβ 感受性を増強することにより肝臓線維化病態を悪化させることを明らかにした 2) これらの結果は摂取コレステロール量が多いまたは高コレステロール血症を有する NASHを含む飽食の時代の肝臓病進展の病態機序に肝星細胞内における遊離コレステロールの蓄積が重要な役割を果たすことを示唆している一方で我々は初代肝星細胞を用いたin vitro 解析で遊離コレステロールを蓄積した細胞がTLR4シグナルの増強を介してTGFβに対して易感受性を呈するのに対し Cholesterolesterを蓄積した細胞ではその現象が認められないことを明らかにした 2) この結果は細胞内の全コレステロール量ではなく遊離コレステロール量が肝星細胞のTGFβに対する感受性の規定因子の1つであることを示している以上より我々は肝星細胞内の遊離コレステロール代謝調節が NASHを含む肝臓病線維化進展の治療標的となり得るものと考えた細胞の過剰なコレステロールは choresterol ester (CE) として蓄えられる細胞内でコレステロールは遊離コレステロールまたはCEとして存在するが遊離コレステロールからCEへの変換酵素として acetyl-coa acetyltransferase (ACAT) が知られている哺乳類では isoenzymeであるacat1 およびACAT2 が存在するが ACAT1 は多くの組織で発 30

2 現が認められるのに対して ACAT2 は主に肝臓および小腸で発現していることが報告されている 3) 我々の今回の検討においてマウス肝臓では ACAT1 がマウス肝星細胞に発現する主要なisozymeであり ACAT2 は肝細胞およびKupffer 細胞に発現する主要なisozymeであることが明らかとなった我々は本検討でヒト肝星細胞でもACAT1 が主要なisozymeであることを示しており同酵素の活性調節が治療標的となる可能性を示唆するものである以上の結果を踏まえ本研究では ACAT1 欠損マウスおよび野生型マウスを用いてマウス肝線維化モデルを作成評価検討することにより肝星細胞のACAT1 活性調節がNASHを含む肝臓病肝線維化の治療標的となり得るか否かを探索することを目的とした 1) 結果 ACAT1はヒトおよびマウス肝星細胞では主要なアイソザイムであるウエスタンブロッティングの結果より ACAT1 がマウス肝星細胞の主要なアイソザイムであり ACAT2 発現はほとんど認められなかったヒト正常肝より分離した肝星細胞でも ACAT1 が主要なアイソザイムであった同様にヒト肝星細胞株化細胞である LX2 や htert 導入ヒト肝星細胞でも ACAT1 が主要アイソザイムであったそしてこれらのヒト肝星細胞ではACAT2 発現はほとんど認められなかった一方でマウスより分離した肝細胞 Kupffer 細胞では ACAT2が主要なアイソザイムであったその結果 ACAT1 欠損マウス由来の肝星細胞では ACAT 活性がほとんど消失していたが肝細胞およびKupffer 細胞では ACAT 活性が保持されていた ACAT1 欠損は有意に肝線維化病態を進展させた以上の結果より ACAT1 欠損マウスを利用することにより肝臓中で星細胞特異的な ACAT 欠損の影響を検討することが可能であるため肝線維化モデルに供した肝線維化モデルの一つであるCCl 4 投与による肝線維化モデルに供した結果 ACAT1 欠損マウスは野生型マウスに比較して有意に肝線維化が増悪することが肝組織像において明らかとなった Sirius-red 染色面積による評価でも有意な線維化の増悪が確認されたまた肝星細胞活性化マーカーであるαSMAの発現量 collagen1a1, collagen1a2 発現量も ACAT1 欠損マウス肝臓で有意に発現量が増加していた一方肝臓 TGFβ 発現量は ACAT 欠損マウスと野生型マウスとの間に有意差は認めなかった総胆管結紮による肝線維化モデルでも同様の結果であった ACAT1 欠損は TLR4 タンパクレベルの増加を介して肝星細胞のTGFβ 感受性を増強し肝星細胞活性化を促進する ACAT1 欠損マウスより分離直後の肝星細胞では野生型肝星細胞に比し遊離コレステロール量が有意に増加していた一方 CE 量には違いを認めなかったこれらの肝星細胞に 31

3 TGFβを添加する刺激培養実験を施行したところ肝星細胞の活性化が促進され αsma collagen1a1 collagen1a2 発現が有意に増加したが ACAT1 欠損によりそれらの反応がさらに有意に増強した分離直後の肝星細胞の検討では TGFβ 偽受容体であり TLR4の下流分子であるBambi(bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor) の発現が ACAT1 欠損肝星細胞で有意に低下していた TGFβreceprot-1 receptor-2の発現量には差を認めなかったそして TLR4タンパクレベルはACAT1 欠損肝星細胞で野生型肝星細胞に比較して増加していた一方 TLR4 mrnaに関しては遺伝子型による違いは認められなかったまた分離 Kupffer 細胞では遺伝子型によるTLR4 タンパクレベルの違いを認めなかった TLR4 タンパク質の細胞内移行はリガンド形成により促進し細胞膜よりエンドソームへ移行しユビキチン化されリソソームへ輸送され分解を受ける 4,5) 培養肝星細胞を用いた検討で野生型肝星細胞では LPS 投与 60 分後に TLR4 タンパク発現レベルは有意に減少したが ACAT1 欠損肝星細胞では高い発現量を維持していた我々は以前の検討で肝星細胞の遊離コレステロール蓄積がリガンド結合により促進されるTLR4タンパク質の分解を抑制することでその下流のBambi 発現を減弱させ肝星細胞の TGF 刺激に対する感受性を増強し結果として肝星細胞の活性化が促進されることを明らかにした 2) 今回の結果は同様の機序で ACAT1 欠損が遊離コレステロールの蓄積を介して肝星細胞のTGF 惹起活性化を促進することを示唆するものである ACAT1 欠損は TLR4シグナル依存的に肝線維化進展を増悪させたさらに我々は ACAT1 欠損マウスとTLR4 欠損マウスとを交配させその2 重欠損マウスを作成した TLR4 欠損マウスおよびTLR4/ACAT1 2 重欠損マウスを2 種類の肝線維化モデル ( 総胆管結紮モデル CCl 4 投与モデル ) に供し肝線維化進展に及ぼすACAT1 欠損の影響が遊離コレステロール蓄積により増強するTLR4 シグナルに依存的であるか否かを検討した四塩化炭素肝線維化モデルで TLR4 シグナルが欠損した状態では ACAT1 欠損は肝線維化進展に影響を及ぼさなかった Sirius-red 染色面積肝臓 αsma collagen1a1, collagen1a2 発現量の検討でも ACAT1 欠損による影響は認めなかった総胆管結紮による肝線維化モデルでも同様の結果であった TLR4 シグナルが欠損した状態でも ACAT1 欠損により肝星細胞の遊離コレステロール蓄積が有意に増強したが CE 蓄積には影響していなかった各マウスより分離直後の肝星細胞にTGFβ 刺激を施行したところ collagen 1a1 collagen1a2 発現が有意に増加したが TLR4 シグナルが欠失している状態では ACAT1 欠損による反応性の増強は認めなかった各マウスより分離直後の肝星細胞の検討では TLR4 シグナル存在下ではACAT1 欠損により Bambi 発現が有意に減弱していたが TLR4 シグナル非存在下ではBambi 発現はACAT1 の影響を受けていなかったこれらの結果は遊離コレステロール蓄積により増強したTLR4シグナルが ACAT1 欠損による肝線維化の増悪に重要な役割を果たすことを示唆するものである 32

4 1) 考察本研究で我々は ACAT1 欠損が 2つの肝線維化モデル ( 総胆管結紮モデル CCl 4 投与モデル ) における肝線維化進展を増悪させることを明らかとした本病態機序は肝細胞障害やKupffer 細胞活性化を介していなかった ACAT1 は肝星細胞における主要なACATアイソザイムであり一方 ACAT2 は肝細胞およびKupffer 細胞での主要なアイソザイムであるため ACAT1 欠損マウスを用いた本検討では主として肝星細胞での遊離コレステロール蓄積増強を介した機序により肝線維化が増強していた蓄積した遊離コレステロールは肝星細胞のTLR4 タンパク質発現を増強し Bambi 発現低下を介して TGFβ 刺激への易感受性を惹起し肝星細胞活性化を促進するものと考えられた細胞におけるコレステロール蓄積は主としてlow-density lipoprotein(ldl) 取り込みによるものか新規合成に基づくものである 3) これらのコレステロールは最終的にはER に到達しその一部は主としてACAT1 によりCEへ変換され主に細胞質中の脂肪滴として存在する CE 生合成と加水分解反応は持続的に起こり遊離コレステロール /CEサイクルを形成する 3) 本研究で我々は ACAT1 が肝星細胞での遊離コレステロール蓄積に関わる重要な調節因子であることを明らかとした肝星細胞ではコレステロールのほとんどは遊離コレステロールとして存在しており ACAT1 欠損は肝星細胞の遊離コレステロールを増加させるが CE 蓄積には影響を及ぼさなかった ACAT1 欠損による肝星細胞での遊離コレステロール蓄積はリガンド結合により惹起されるTLR4 タンパク質の分解を阻害していたこれらの検討結果は我々の以前の報告に合致するものである 2,6) 動脈硬化に際してはマクロファージでの慢性的な CEの蓄積により泡沫化マクロファージが形成され病態に寄与するものと考えられているそのため複数のACAT 阻害剤が合成され動脈硬化病態の加療での有効性が検討されてきたしかしながらその有効性に関して未だ一定の見解が得られていない 3) 高コレステロール血症患者に対するACAT 阻害剤の投与で動脈硬化病変が改善しないばかりか逆に増悪し心血管イベントが増加したとの報告がなされた 7) 8) 同様に ACAT 阻害が冠動脈疾患患者の動脈硬化を増悪させたとの報告や脂質異常症に関連するマクロファージでの選択的なACAT 阻害が動脈壁での遊離コレステロール蓄積を増強しかえって動脈硬化病態を増悪させたとの報告も散見している 9,10) これらの報告と我々の今回の結果を踏まえるとヒト疾患病態でACAT 活性減弱が病態機序に及ぼす役割は細胞内 CE 減弱による作用というよりもむしろ細胞内遊離コレステロール蓄積増強に起因するものであることが推察される細胞膜構造は多くの基本的な細胞機能に重要であり ACAT1 により調節される遊離コレステロールは多くの疾患の病態機序に関与している可能性がある今回肝星細胞での遊離コレステロール蓄積が肝線維化病態進展機序に重要な役割を果たすことが明らかとなったそのため肝星細胞でのACAT1 活性調節は肝線維化の新たな治療戦略として期待されるものであるヒト検体を用いた検討で ACAT1 遺伝子多型が血清脂質レベルに影響を与えることが報告されている 11) 今後のヒト検体を用いた ACAT1 遺伝子多型と肝線維化進展 33

5 との相関解析により肝線維化が進展しやすい患者群の遺伝子診断が可能となるものと推察される我々は本研究で ACAT1が肝線維化病態に果たす新たな病態機序を明らかとした肝星細胞のACAT1 活性をターゲットとした新たな肝線維化治療戦略につながるものと期待される 1) 要約我々は近年肝星細胞の遊離コレステロール蓄積が肝線維化を進展させることを明らかとした Acetyl-CoA acetyltransferase(acat) は細胞内の遊離コレステロールをコレステロールエステルへ変換する酵素であるが ACAT1 はヒトでもマウスでも肝星細胞に優位に発現するアイソザイムであったその発現調節が肝線維化の治療標的となる可能性が示唆されたが ACAT1 欠損マウスを肝線維化モデルに供したところ野生型マウスに比して肝線維化が有意に進展した ACAT1 欠損により肝星細胞に遊離コレステロールが蓄積し TLR4 シグナルの増強を介して肝星細胞のTGFβ 感受性を増強することにより肝臓線維化病態が増悪する病態機序が明らかとなった今後 ACAT1 発現調節を介した肝星細胞の遊離コレステロール調節が非アルコール性脂肪肝炎などの肝臓病肝線維化の新規治療ターゲットとして期待される文献 1. Tomita, K., Teratani, T., Suzuki, T., et al. Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 1 mediates liver fibrosis by regulating free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells. J Hepatol 61, Teratani, T., Tomita, K., Suzuki, T., et al. A high-cholesterol diet exacerbates liver fibrosis in mice via accumulation of free cholesterol in hepatic stellate cells. Gastroenterology 142, e Chang, T.Y., Li, B.L., Chang, C.C., et al. Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferases. Am J Physiol Endocrinol Metab 297, E Husebye, H., Halaas, O., Stenmark, H., et al. Endocytic pathways regulate Toll-like receptor 4 signaling and link innate and adaptive immunity. EMBO J 25, Wang, Y., Chen, T., Han, C., et al. Lysosome-associated small Rab GTPase Rab7b negatively regulates TLR4 signaling in macrophages by promoting lysosomal degradation of TLR4. Blood 110, Tomita, K., Teratani, T., Suzuki, T., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology 59, Meuwese, M.C., de Groot, E., Duivenvoorden, R., et al. ACAT inhibition and progression of carotid atherosclerosis in patients with familial hypercholesterolemia: the CAPTIVATE randomized trial. JAMA 301,

6 8. Nissen, S.E., Tuzcu, E.M., Brewer, H.B., et al. Effect of ACAT inhibition on the progression of coronary atherosclerosis. N Engl J Med 354, Accad, M., Smith, S.J., Newland, D.L., et al. Massive xanthomatosis and altered composition of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice lacking acyl CoA:cholesterol acyltransferase 1. J Clin Invest 105, Fazio, S., Major, A.S., Swift, L.L., et al. Increased atherosclerosis in LDL receptor-null mice lacking ACAT1 in macrophages. J Clin Invest 107, Ohta, T., Takata, K., Katsuren, K., et al. The influence of the acyl-coa:cholesterol acyltransferase-1 gene -77G-->A polymorphisms on plasma lipid and apolipoprotein levels in normolipidemic and hyperlipidemic subjects. Biochim Biophys Acta 1682,

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No146三浦.indd 三浦光一秋田大学大学院医学系研究科医学専攻腫瘍制御医学系消化器内科特任講師非アルコール性脂肪性肝炎 ( 以下 NASH) はメタボリック症候群の肝臓での表現型とされ肝硬変や肝臓癌へ進展する可能性のある疾患である近年 NASH 患者数は増加傾向にあり今後重要な健康問題となると予想されるがいまだ有効な治療法は少ない NASH 発症メカニズムに関して不明な点が多いことからその解明が有効な治療法の開発につながると考えられる