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1 Thermo Fisher Connect 簡易操作ガイド - キャピラリー電気泳動のアプリケーション - 使用には事前登録が必要になります 画面は予告なく変わることがあります The world leader in serving science

2 キャピラリ電気泳動のアプリケーション シーケンス解析用アプリケーション Quality Check Variant Analysis フラグメント解析用アプリケーション Peak Scanner シーケンスデータの閲覧および再解析 相補鎖変換表示も可能 リファレンス配列とデータを比較して変異検出 変異のアノテーション機能付き フラグメントデータのサイジングおよび閲覧 プロットの表示 ピークの数値情報を出力 2

3 Thermo Fisher Connect シーケンスデータ閲覧 再解析方法 使用には事前登録が必要になります 画面は予告なく変わることがあります The world leader in serving science

4 アカウント登録およびサインイン Web Browser Microsoft Internet Explorer Minimum version Latest verified version OS Compatibility 10.x 10.x Windows 7.1+ Google Chrome 25.x 36.x Windows XP+ OSX クリック Apple Safari (OSX) 5.x 7.x 6: OSX : OSX Mozilla Firefox 16.x 31.x Windows XP SP2+ OSX 最初にご登録が必要 メールアドレスのみの登録で利用可 ご登録後はユーザー名とパスワードを記入しサインインします 4

5 Thermo Fisher Cloud のメイン画面 (Dashboard) Dashboard を表示するボタン アップロード / 作成したファイルの一覧の表示ボタン ファイルのアップロード プロジェクトの作成 ( ストレージを 10 GB まで無償で提供 ) 利用可能なアプリケーションが表示されています シーケンス解析用アプリケーション Quality Check シーケンスデータの閲覧および再解析 相補鎖変換表示も可能 Variant Analysis リファレンス配列とデータを比較して変異検出 変異のアノテーション機能付き Next-generation Confirmation VA モジュールの機能 + 次世代シーケンサとのデータ比較 次世代シーケンサの.vcf ファイルに対応 5

6 Quality Check の使用方法 過去のプロジェクトにデータを閲覧することができます Create project をクリックして 新規プロジェクトを作成します Type a project name にプロジェクト名を記入します ( 日付など ) My Apps を下にスクロールして App をクリック 6

7 サンプルファイルとプロジェクト設定の読み込み Import from をクリックし コンピューターまたは Thermo Fisher Cloud に保存されているデータファイル (.ab1 ファイル ) を読み込みます データを読み込んだら左側の QC ボタンをクリックします Yes を選択した場合は 過去のプロジェクトを選択して Import Settings をクリックします 過去の特殊なデータ解析設定と同じ設定を行いたい場合は Yes Default の設定で解析する場合は No ( 設定については次スライド ) 7

8 サンプルファイルのクオリティ評価の設定 ( 任意 ) Overview 画面からサンプルファイルのクオリティの確認ができます QC 設定が適切でない場合は Suspected や Failed として表示されるので 必要に応じて無視し そのまま閲覧へ進みます QC 設定を変更するには 画面右上の Actions から Quality Flag Settings を選択します 適用したい QC 設定のチェックボックスをチェックし 設定バーの境界を調整して値を変更し 最後に Save します 8

9 QC 設定の項目について Pure base 単一塩基のクオリティの色表示 : クオリティの高さに応じて色分けできる Mixed base 混合塩基のクオリティ別の色表示 : クオリティの高さに応じて色分けできる CRL 一定 QV 値以上の塩基が連続する領域長 QV20+ QV 値が 20 以上の塩基数 Signal to Noise シグナル / ノイズ比 9

10 QC 設定の項目について ( 続き ) Trace Score シーケンス全体の平均 QV 値 Median PUP ノイズレベルの中央値 Signal Strength 平均シグナル強度 OffScale 検出限界を超えるシグナルの有無 10

11 サンプルファイルの表示 サンプルファイルのチェックボックスをチェックし 画面右上の Actions から View Details を選択します サンプルファイルを一つ表示させた場合のみ Analyzed の波形データ以外に Raw, Sequence, EPT, Annotation が表示できます 複数のサンプルファイルを表示させた場合のみ 波形の枠内の左上にあるボタンをクリックすると相補鎖変換できます 波形を印刷する場合 Export Traces から pdf を出力します Remove Traces で Project からサンプルファイルを除外します Cancel をクリックすると画面が戻ります 11

12 ( 任意 ) クオリティレポートの確認 ワークフローの Results を選択します クオリティレポートを閲覧する場合 QC 設定が適切に設定されている必要があります レポートを印刷する場合 Generate PDF Report から pdf を出力します 12

13 ( 任意 ) サンプルファイルの再解析 サンプルファイルのチェックボックスをチェックし 画面右上の Basecall* を選択します コンピューターに再解析したファイルを保存する場合 画面右上の Actions の Export Traces から ab1 を出力します 必要に応じて 変更したい解析設定をクリックして展開し 調整します Analyze をクリックし サンプルファイルの再解析を実行します 13

14 解析設定の項目について Mobility File ピークの移動度補正の設定 Ending base and calling Ns ベースコールの終了方法の設定 N 表示の設定 Mixed Bases Threshold ミックスベースコールの設定 Analyzed Data Scaling ピークの高さ補正の設定 Clear Range Methods クリアレンジの設定 ( 低クオリティ領域のグレーアウト表示 ) 14

15 テキストファイルへの変換方法 テキストファイルへ変換したい場合は 画面右上の Actions の Export Traces から.seq を選択し出力します 15

16 トラブルシューティング ブラウザのキャッシュの状態によって Thermo Fisher Cloud の結果が正しく表示されないことがあります この場合 1. シークレットウィンドウ (Google Chrome) プライベートウィンドウ (Mozilla Firefox) InPrivate ウィンドウ (Microsoft Internet Explorer) を開き エラーが表示されたウィンドウの URL をペーストします 2. キャッシュをクリアします. それでも改善しない場合 ブラウザの設定をリセットします 3. 1 と 2 でも改善しない場合 ブラウザの種類を変更します ( 例 : Google Chrome Mozilla Firefox) 16

17 Thermo Fisher Connect シーケンスデータ変異解析方法 使用には事前登録が必要になります 画面は予告なく変わることがあります The world leader in serving science

18 Variant Analysis モジュール キャピラリシーケンサデータの変異解析 シーケンスデータをリファレンス配列と比較 ワークフロー Traces: サンプルファイルのクオリティ評価 Reference: リファレンス配列の作成 Organize: サンプルファイルをアンプリコンと検体ごとにグループ化 Settings: 解析条件の設定 Analysis: 解析 Results: 結果確認 18

19 Variant Analysis モジュールの使用方法 過去のプロジェクトにデータを閲覧することができます Create project をクリックして 新規プロジェクトを作成します Type a project name にプロジェクト名を記入します ( 日付など ) My Apps を下にスクロールして App をクリック 19

20 サンプルファイルの読み込み Import from をクリックし コンピューターまたは Thermo Fisher Cloud に保存されているデータファイル (.ab1 ファイル ) を読み込みます データを読み込んだら左側の VR ボタンをクリック 20

21 リファレンスの設定 1 ウィンドウ上部にある Reference( または Setup) を選択します Create reference より Name に新規リファレンスの名前を記入します リファレンス情報を 染色体の位置情報 (Enter Chromosome position) テキスト情報 (Import.fasta file in.fasta format) GenBank ファイル (Import GenBank file in.gb format) のいずれかで設定します 21

22 リファレンスの設定 2 Target Species から生物種を選択し 染色体番号 (Number) 位置情報 ( Start/Stop Position) を記入します 解析を行うアンプリコンが複数ある場合は + ボタンをクリックします テキスト情報 GenBank ファイルの場合 リファレンスのファイルを読み込みます 必要に応じてアンプリコン名とプライマーの位置情報 ( 配列情報 ) の Primer File を読み込みます.txt と.primer ファイルのファイル形式については.txt と.primer のハイパーリンクをクリックします Save ボタンをクリックしてリファレンス情報を保存します 22

23 サンプルファイルの設定 Reference(Setup) の設定が完了したら Organize を選択します サンプルファイルをアンプリコン (Amplicon) と検体 (Specimen) ごとにグループ化します アンプリコン名は自動または.fasta ファイルに従って命名されます 検体を作成するには + ボタンをクリックし 名前を入力して Enter キーを押します検体が複数ある場合は この手順を繰り返します アンプリコンを選択し 検体を選択します 選択したアンプリコンと検体に対応するサンプルファイルを選択し ドラックして Grouped Traces の欄にドロップします 23

24 ( 任意 ) 解析条件の設定 必要に応じて Setting を選択します 詳細な条件を設定したい場合に変更します 変更しなくても解析可能です 24

25 解析の開始 Reference(Setup) および Organize が完了したら Analysis を選択します Run Analysis をクリックすると解析を開始します 25

26 データの閲覧 Results 画面にて 左上のボタンから閲覧方法を切り替えることができます Overview: リファレンスに対して変異のある位置を確認できます 変異塩基 Variant: 変異の位置情報 詳細情報がリストアップされます 26

27 Thermo Fisher Connect フラグメントデータサイジング解析方法 使用には事前登録が必要になります 画面は予告なく変わることがあります The world leader in serving science

28 アカウント登録およびサインイン Web Browser Microsoft Internet Explorer Minimum version Latest verified version OS Compatibility 10.x 10.x Windows 7.1+ Google Chrome 25.x 36.x Windows XP+ OSX クリック Apple Safari (OSX) 5.x 7.x 6: OSX : OSX Mozilla Firefox 16.x 31.x Windows XP SP2+ OSX 最初にご登録が必要 メールアドレスのみの登録で利用可 ご登録後はユーザー名とパスワードを記入しサインインします 28

29 Thermo Fisher Cloud のメイン画面 (Dashboard) Dashboard を表示するボタン アップロード / 作成したファイルの一覧の表示ボタン ファイルのアップロード プロジェクトの作成 ( ストレージを 10 GB まで無償で提供 ) 利用可能なアプリケーションが表示されています フラグメント解析用アプリケーション 29

30 Peak Scanner の使用方法 過去のプロジェクトにデータを閲覧することができます Create project をクリックして 新規プロジェクトを作成します My Apps を下にスクロールして App をクリック Type a project name にプロジェクト名を記入します ( 日付など ) 30

31 サンプルファイルとプロジェクト設定の読み込み 1Import From をクリックし コンピュータまたは Thermo Fisher Cloud に保存されているデータファイル (.fsa1 ファイル ) を読み込みます 2 データを読み込んだら左側の PS ボタンをクリックします 過去のプロジェクトをテンプレートにして解析設定を呼び出す場合 適切なプロジェクトを選択して Import Settings をクリックします 必要に応じて過去のプロジェクトの解析設定を呼び出します 解析設定に関しては後半スライドを参照 31

32 サンプルファイルとプロジェクト設定の読み込み サンプルデータが読み込まれます 32

33 解析結果の検証 解析後の SQ OS のカラムで データの状態を確認できます OS(Off Scale): 各サンプルの検量線の範囲内で 検出限界を超えるピークがある場合が表示されます SQ(Sizing Quality): サイズスタンダードによる検量線のクオリティの評価です の場合 データのサイズ値の精度が低下する恐れがあります 33

34 ピークのサイズ値の確認 1Results タブに切り替えます データの拡大縮小ができます 2 データを選択します スクロールバー 3 ピークをクリックすると Size 値が確認できます プロット画面でカーソルをドラッグして画面を移動させますプロット画面でカーソルをドラッグして画面を拡大縮小します拡大縮小をリセットします複数サンプルを同時に拡大縮小します 34

35 Size Standard の確認方法 1 データを選択します 2Action より View Size Match Editor を選択します 1 サンプルずつ表示します > ボタンで次のサンプルへ移行します 35

36 解析結果の出力 プロットデータ サイズ値を出力することができます 1Actions より Export Sizing Table もしくは Export Plot を選択します Export sizing table: Sizing table を csv ファイルでエクスポートします Export Plot: プロットデータを PNG もしくは JPEG でエクスポートします 36

37 サイズスタンダードの編集 ( オプション ) サイズスタンダード内のすべてのピークが存在しないもしくは正確に標識されていない場合は サイズスタンダードの編集後 再解析が可能です 1Setup を選択します 2Size Standard をクリックします Locked factory default の記載があるサイズスタンダードは編集できません 名前を変更し保存したサイズスタンダードは次回以降編集できるようになります 3Clone size standard to make changes をクリックします 37

38 サイズスタンダードの編集 ( オプション ) 4 名前を記入します 5 数値の削除などで編集できます Reanalyze all files with this size standard にチェックを入れて Apply ボタンをクリックすると すべてのデータを自動で編集したサイズスタンダードで再解析します 6Apply をクリックします 38

39 サイズスタンダードの編集 ( オプション ) 7Reanalyze をクリックします Reanalyze all files with this size standard( 全ページ左上 ) にチェックを入れた場合は 自動で再解析されます 39

40 Size Standard の編集 ( オプション ) サイズスタンダードのピークを選択し直接編集することが可能です 1 データを選択します 2Action より View Size Match Editor を選択します 40

41 サイズスタンダードの編集 ( オプション ) 3 ピーク拡大します 4 目的ピークをクリックしピークの数値を付け替えることができます Reanalyze all files with this size standard にチェックを入れて Apply ボタンをクリックすると すべてのデータを自動で編集したサイズスタンダードで再解析します 5Done をクリックします 41

42 プロット画面表示の変更方法 ( オプション ) Plot Settings よりプロット画面表示の変更ができます 表示する蛍光色素を選択できます Combine Dyes: サンプルごとのプロットが表示されます Separate Dyes: 蛍光色素ごとのプロットが表示されます Overlay samples: サンプルをすべて重ねたプロットが表示されます Analyzed: 解析後のデータが表示されます Raw:Raw データが表示されます Analyzed+Raw: 解析後と Raw データが同時に表示されます Basepairs: 横軸がベースペアで表示されます Scan: 横軸が Data point で表示されます 次ページへ続く Sizing Table の表示を切り替えます 42

43 プロット画面表示の変更方法 ( オプション ) 1 画面に表示させるデータ数を変更します Plot 画面の X 軸 Y 軸の Start Stop ポイントを変更します Plot 画面に表示させる注釈を変更します Plot 画面の X 軸 Y 軸の表示範囲を変更します Plot 画面に検量線 ピーク位置 オフスケールピークを表示させます 各ピークのシグナル強度を変更します 43

44 プロット画面表示の変更方法 ( オプション ) ラベル表記させるピークの変更ができます ラベル表記内容を変更できます ラベル表記の文字の大きさを変更できます ラベル表記の色を変更できます 44

45 Analysis Setting の詳細設定 ( オプション ) 必要に応じて解析パラメーターの設定の変更が可能です 1Setting をクリックします データの解析範囲を変更できます 検出するピーク高の範囲を変更できます 45

46 Analysis Setting の詳細設定 ( オプション ) ピークのクオリティ判定の設定を変更できます ピークのベースラインの設定を変更できます 3 サンプルを指定し Reanalyze をクリックします Reanalyze all files with Setting にチェックを入れて Done をクリックすると すべてのデータを自動で再解析します 2 解析設定変更後 Done をクリックします 46

47 トラブルシューティング ブラウザのキャッシュの状態によって Thermo Fisher Cloud の結果が正しく表示されないことがあります. この場合 1. シークレットウィンドウ (Google Chrome) プライベートウィンドウ (Mozilla Firefox) InPrivate ウィンドウ (Microsoft Internet Explorer) を開き エラーが表示されたウィンドウの URL をペーストします 2. キャッシュをクリアします. それでも改善しない場合 ブラウザの設定をリセットします 3. 1 と 2 でも改善しない場合 ブラウザの種類を変更します ( 例 : Google Chrome Mozilla Firefox) 47

48 アプリケーションサポートについて製品に関するアプリケーション情報 技術資料サイト テクニカルサポートへのお問い合わせは TEL: FAX: ( 受付時間 : 月曜日 ~ 金曜日 9:00-18:00 * 祝祭日除く ) メールでのお問い合わせは jptech@thermofisher.com までお願い致します 48

49 2017 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. For research use only. Not for use in diagnostic procedures. 49