目次 Ion Reporter 概要とメタゲノム解析 Ion16S Metagenome Kit データ解析概略 解析実行手順 解析実行結果 カスタムプライマー利用時のWorkflow 作成 サポート情報 p.3 p.9 p.14 p.19 p.26 p.35 2

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1 IonReporter メタゲノムデータ解析 サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパンテクニカルサポート The world leader in serving science

2 目次 Ion Reporter 概要とメタゲノム解析 Ion16S Metagenome Kit データ解析概略 解析実行手順 解析実行結果 カスタムプライマー利用時のWorkflow 作成 サポート情報 p.3 p.9 p.14 p.19 p.26 p.35 2

3 3 Ion Reporter 概要とメタゲノム解析

4 IonReporter Software シーケンサとのダイレクトな統合 簡便なグラフィカルユーザインタフェース (GUI) ユーザのニーズに合わせて ローカル (Local) 版とクラウド (Hosted) 版を提供 4

5 IonReporter が対象にする解析 単一サンプルの解析 リファレンス配列との相違 ペアサンプル解析 二つのサンプル間の変異箇所の差異と共通性 癌の体細胞変異ペアサンプル解析 正常細胞と共通する変異を除外して 癌細胞特異的な変異を抽出 遺伝性疾患のトリオ解析 家族内の変異解析 CNV (Copy Number Variation) 解析 単一サンプル / ペアサンプルの CNV の検出 融合遺伝子解析 癌細胞特異的な融合遺伝子を検出可能 カスタムデザインにも対応 16S メタゲノム解析 細菌の属 / 種レベルでの分類 5

6 IonReporter の画面構成 タブ : 機能の選択 主な機能へのショートカット 使用データ容量 Help 資料 Password の変更など サポートへのリンク フィードバックなど 6

7 トレントサーバから直接データデータアップロード ランの完了後 専用のプラグインからデータを安全にクラウドに送信 共同研究者と解析データのシェアも可能 自動もしくは手動でデータアップロード BAM ファイル IonReporterUploder プラグイン VARIANTS and ANNOTATIONS 共同研究者と結果のシェア 7

8 手元の PC からデータアップロード 解析結果の BAM ファイルが自 PC のみにしかない場合に有効 (BAM ファイルの転送には IonReporterUploader スタンドアローン版とコマンド操作が必要 ) VARIANTS and ANNOTATIONS ファイルの手動アップロード可能 User PC 8

9 9 Ion16S Metagenome Kit データ解析概略

10 Ion16S Metagenomics Kit& データ解析 16S メタゲノムのライブラリ作製 ~ 解析をトータルサポート プライマーセット & 増幅試薬 メタゲノム解析パイプライン & データベース サンプル調製 : チューブ 2 本で複数の可変領域を増幅 (V2,4,6 & V3,6,9) データ解析 : IonReporter による専用パイプラインと 2 つのデータベースとの連携 メタゲノム解析のポイントとなる 2 プロセスのソリューションを提供 V 1 V2 V3 V4 V 5 V6 V 7 V 8 V

11 データセットとの連携 2 つの参照配列データセットを提供 キャピラリーで実績のある MicroSEQ ID 公的データベースの GreenGenes 1. MicroSEQ ID 2. GreenGenes Trusted gold-standard Full length 16S sequences > 15,000 Organisms Manually curated for Sequence quality Length Annotation Phylogeny Taxonomy updates Public 16S data resource Commonly used in 16S studies Minimal curation Over 1.2 million entries Ion Reporter leverages a two-step mapping process to manually-curated and public content 11

12 IonReporter 16S メタゲノム解析機能 Krona によるパイチャート作成機能 分類法の各階層における割合の表示 (class,order,family など ) 解析データのダウンロード 全領域またはまたは 領域領域ごとのごとの細菌細菌の同定存在比率の結果結果を表示 [ 領域ごと ] [ 全領域 ] 12

13 Ion IonReporter Software S メタゲノムワークフロー結果出力例メタゲノム解析機能 2015/10- QIIME の解析アルゴリズムの利用 各プライマー別の結果の出力が可能に Alpha diversity Species, Genus, Family レベルでの希薄化曲線 (rarefaction curve) 作成 Beta diversity 複数サンプル間の相対比較 Primer set-specific results export Ion 16S Metagenomics kit における各プライマー別の結果の出力 13

14 14 IonReporter メタゲノム解析実行手順

15 解析の実行 ( 複数通りの実行方法あり ) 1 Home タブの画面から Analyses の Launch analysis をクリック 2 Analyses タブ Launch を選択 または Launch Analysis Manual 3 Workflows タブ 対象の Workflow を選択 Actions Launch Analysis 15

16 メタゲノム解析ワークフローの選択 Application>Metagenomics で検索 絞り込みを行い Metagenomics 16S ワークフローを選択して Next をクリック 16

17 対象サンプルの選択 解析の対象にするサンプルのチェックボックスをオンにして Next ボタンをクリック 複数サンプルの比較する場合 複数個にチェックをいれる 17

18 解析の開始 Analysis Name を入力し 設定を確認して Launch Analysis をクリック 解析スタート 18

19 19 解析実行結果

20 進捗の確認 解析の進捗は Analyses タブの Overview で確認可能 ( 解析が完了するとメールで通知 ) Abort を選択することで 処理を中断することが可能 20

21 結果の参照 Analyses タブの Overview で 解析の Status が Successful になっていることを確認し Analysis 名をクリック 21

22 結果の参照例 22

23 結果の参照例 FAQ Slash call : 複数種に割り当てられて区別できないリードの数 Valid read: リードの長さが十分にあり リードの量が十分にあると判断できるリード Read Length Filter :default 150 と the Read Abundance Filter :default 10 の 2 つのパラメータの処理に関連しています 23

24 結果の参照例 α diversity X 軸 : 出力リード数 Y 軸 : 各分類階層での検出数 リード数と検出数の関係性から十分な量のデータかを評価します 24

25 結果の参照例 β diversity 主な算出値が出力されます (4 サンプル間解析の場合の出力例 ) Eigvals( 固有値 ) e-08 Proportion explained( 寄与率 ) e-17 Site( 各成分のスコア ) S S S S 各サンプルで得られたリード情報を元に 主成分分析により サンプル間の特徴の違いを評価します 参考資料 ; 主成分分析とは

26 カスタムプライマー利用時の Workflow 作成 26

27 Workflow の作成とコピー 以下のような場合に Workflow の作成やコピーを行う Workflowの作成 - カスタムプライマー利用時やAmpliSeqカスタムパネルの解析するとき - パラメータを変更した新規のWorkflowを作成したいとき Workflowのコピー - 既存のWorkflowの設定を利用したいとき 作成 コピーしたWorkflowの設定は後で編集が可能 Workflow の管理は Workflows タブから行う 27

28 Workflow の作成 (1) (1) Workflows タブから Create Workflow をクリック (2) Metagenomics を選択し Next をクリック 28

29 Workflow の作成 (2) (3) リファレンスを選択し Next をクリック (2 種類を選択の場合は Ctrl ボタンを押しながら選択ください ) 始めは両方を選択して実行を推奨 29

30 Workflow の作成 (3) (3) 利用したプライマー情報を入力し Next をクリック この際 FASTA ファイルの Upload か直接入力のどちらかの方法で入力します Forward と Reverse をセットで入力してください それらのヘッダー部分で **_Fwd **_Rev などと明記してください 30

31 Workflow の作成 (4) (7) メタゲノム解析におけるパラメータ設定を確認したら Next をクリック 始めはデフォルトパラメータでの実行を推奨 31

32 Workflow の作成 (5) (8) Workflow 名を入力し Save Workflow をクリック 新規の Workflow が作成される 32

33 Workflow の編集 (1) 編集したい Workflow 名を選択し Actions Edit をクリック (2) 以降 Workflow の新規作成と同様の操作で 設定の編集が可能 33

34 Workflow のコピー (1) コピーしたい Workflow 名を選択し Actions Copy をクリック (2) 以降 Workflow の新規作成と同様の操作で 設定の編集が可能 34

35 35 サポート情報

36 IonReporter Help 資料 ログイン画面の右上にある Help から IonReporter の詳細な操作手順書を閲覧可能 参考となる画像と共に操作方法を解説 36

37 日本語サポートコンテンツ 37

38 ご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまでお問い合わせください Technical Support The Chip is the Machine Call 営業時間 : 午前 9 時から午後 6 時まで 38

39 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. 39