AmpliSeqDataAnalysis

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あきとしにばし
5 years ago
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1 Ion AmpliSeq TM データ解析基礎 ~ 次世代シーケンサによる変異検出 ~ ライフテクノロジーズジャパンテクニカルサポート Oct 2013

2 アジェンダ Ion Torrent データ解析概略 Torrent Variant Caller - 変異の検出 - 実行手順 -パラメータの設定 - 実行結果リファレンスとターゲット領域の登録 Ion Reporter - 変異の絞り込みとアノテーション補足 2

3 3 Ion Torrent データ解析概略

4 ターゲットリシーケンスターゲット領域 - ゲノム全体ではなく特定領域のみ手法 -PCR 増幅系 - キャプチャ系 Ion AmpliSeq 利点 - 必要な領域だけシーケンス可能 - レアバリアント検出可能性が高まる変異の検出ゲノム ( リファレンス配列 ) 4 ゲノム上の特定部分特定部分にマッピング

5 5 Ion Torrent データデータデータデータ解析概要解析概要解析概要解析概要リアルタイムリアルタイムリアルタイムリアルタイム転送転送転送転送生データをデータをデータをデータを自動転送自動転送自動転送自動転送データデータデータデータ確認確認確認確認や出力出力出力出力データのデータのデータのデータの確認確認確認確認お使いのいのいのいの PC 上からからからから結果結果結果結果をダウンロードをダウンロードをダウンロードをダウンロード基本的基本的基本的基本的な解析解析解析解析ベースコールベースコールベースコールベースコールマッピングマッピングマッピングマッピング変異解析変異解析変異解析変異解析プラグインによるプラグインによるプラグインによるプラグインによる解析解析解析解析 Ion Reporter 変異解析変異解析変異解析変異解析アノテーションアノテーションアノテーションアノテーション Torrent Suite Software Ver 4.X 5

Torrent Suite Data Analysis Flow Incorporation for 1 Flow

flow (WELLS) 0.1 1.2 0.3 2.1 0.1 0.2 0.2 2.1 3.1 0.0 0.1 1.2 Signal Processing 0.

3 Base Calling FASTQ SFF Unmapped BAM file with processed

6 Torrent Suite Data Analysis Flow Incorporation for 1 Flow (DAT) Incorporation over many flows (DAT) Raw signals per flow (WELLS) Signal Processing Base Calling FASTQ SFF Unmapped BAM file with processed incorporation signals GATTGACCTCTTTTCGGTTAACGAAGAAGTCGGTTCATC 69,0,101,0,0,89,0,100,10,64,103,0,20 1,220,5,4,90,0,0,203,0,100,99,116,11 4,0,0,19,203,1,9,0,97,0,114,0,0,118 VCF BAM Alignment 6 Variant Call

7 7 Torrent Variant Caller : 変異の検出

8 Torrent Variant Caller 変異検出とアリルとアリル頻度頻度の定量化定量化を簡便簡便に実施簡単に設定実行が可能検索やソートができる変異の一覧表ワンクリックでの結果ファイル出力とゲノムビューアへリンク生殖細胞 (Germ Line)/ 体細胞 (Somatic) の指定が可能カスタマイズしたパラメータを保存再利用が可能 8

9 Torrent Variant Caller: 変異の検出リファレンス DNA リード DNA (BAM ファイル ) T T G G G G G T G G G G Torrent Variant Caller クオリティアリル頻度ストランドバイアス 9 T/G バリアントとして検出 (VCF ファイルエクセルファイル )

10 10 Torrent Variant Caller : 実行手順

11 Torrent Variant Caller: 手動実行 (1) レポート画面の下の方にある Select PluginsTo Run ボタンをクリック (2) インストールされているプラグインのリストから variantcaller をクリック 11

12 Torrent Variant Caller: 毎ランラン自動実行設定 (1) 歯車マーク >Plugins をクリック (2)Autorun のチェックボックスにチェックを入れると全てのランについてラン終了後に指定したプラグインが自動実行される 12 自動実行

13 Torrent Variant Caller: プラン毎の実行 (1) PLAN タブから新しくランの設定を行うアプリケーションを選択 (2) Plugins タブのインストールされているプラグインのリストから variantcaller をチェック (3) 画面下に現れる設定項目を入力 13

14 Torrent Variant Caller: 再解析時の実行 (1) Data タブのランデータの右にある歯車マークから Reanalyze を選択 (2) インストールされているプラグインのリストから variantcaller を選択し Start Analysis クリックサムネイルのみのチェックをはずす Proton の場合 14

15 15 Torrent Variant Caller : パラメータの設定

16 Torrent Variant Caller: パラメータの設定 (1) (1) VariantCaller のパラメータを設定 ( 手動実行時の例 ) ライブラリーの種類種類を指定 Full Genome Ion AmpliSeq Ion TargetSeq Germ Line 1 倍体又は 2 倍体の生殖細胞系の変異を検出 Somatic 体細胞変異を想定して頻度の低いものも検出 High Stringency 厳しい条件で変異を検出 LowStringency 緩い条件でより多くの変異を検出ターゲット領域領域の指定 HotSpot 領域の指定ターゲット領域以外のトリム 16 最新またはまたは保存済保存済のパラメータセットをアップロードのパラメータセットをアップロード可能 (Json ファイル形式 )

17 Germ Line /Somatic の選択選択オプション Germ Line または Somatic の選択が可能 Germ Line アリル頻度の高い (20% 以上の ) 変異を検出する場合 - Recommended coverage is 100x 200x coverage min Somatic アリル頻度の低い (20% 以下の ) 変異を検出する場合 - Recommended coverage is 500x coverage min High Stringency または LowStringency の選択が可能 High Stringency 厳しい条件で変異を検出 LowStringency 緩い条件でより多くの変異を検出 17

ダウンロード 1VariantCaller 結果レポートの Parameters File から Json

18 パラメータファイルのアップロード VariantCaller のパラメータ設定画面設定画面からから Json ファイルをアップロードご使用の PC アップロード完了後完了後自動的自動的に Custom が選択選択されるされるダウンロード 1VariantCaller 結果レポートの Parameters File から Json ファイルをダウンロード 2 AmpliSeqDesigner から Panel の情報として Json ファイルをダウンロード [ 18

19 Torrent Variant Caller: パラメータの設定 (2) (2)VariantCaller の詳細なパラメータを設定可能カーソルを合わせるとパラメータ変数の説明を表示より詳細なパラメータ設定 (3) Submit ボタンをクリックして処理のスタート 19

20 20 Torrent Variant Caller : 実行結果

21 Torrent Variant Caller: レポート VCF ファイル変異の一覧エクセルファイルを取得可能変異の一覧を表示バーコード毎の VCF ファイル変異の一覧エクセルファイルを取得可能 21

22 Torrent Variant Caller: 結果の参照 (1) (2) 解析結果ファイルのダウンロード用リンク (1) (3) (1) 解析に使用使用した BED ファイルや設定設定したパラメータをしたパラメータを記述記述したファイルをダウンロードしたファイルをダウンロード可能 (2) マッピング結果結果の BAM ファイルや変異検出結果変異検出結果の VCF ファイルをダウンロード可能 (3) VariantCaller バージョン 3.6の形式形式で結果結果を表示 22

23 Torrent Variant Caller: 結果の参照 (2) 様々な条件で検索絞り込みが可能閲覧情報の切り替えが可能 23 ローカスの SNP の情報 SNP の頻度 SNP の種類

24 Torrent Variant Caller:IGV による表示例 SNP 検出箇所 (vcf ファイルから ) マウスでポイントすると詳細情報を表示アラインメント (bam ファイルから ) 遺伝子情報 (IGV に予め登録されているリファレンスの場合 ) 24

25 25 リファレンスとターゲット領域の登録

26 リファレンスの登録 Torrent BrowerのReferencesタブからリファレンスの登録が可能 (FASTA 形式 ) リファレンスを登録するとシーケンサ本体でリファレンスの選択が可能になる Add Reference Sequence をクリックして登録 26 登録されたリファレンス

27 リファレンスの登録登録と注意事項主な注意点 (1) 染色体別の複数ファイルとなっている場合はマルチFASTA 形式の1ファイルにマージする必要あり (2)2GB までのアップロード容量制限 Zip ファイルでもアップロード可能 (1 つの FASTA ファイルのみ ) TorrentServerがインターネットに接続されている場合以下のリファレンスのダウンロード & 自動登録が可能 mm10( マウス ) hg19( ヒト ) AmpliseqRNA 用 hg19 リファレンス Get Ion Reference をクリック 27

edu/) Guide for TargetSeq Custom Enrichment Kit Orders(PN:4471870) 参照 Target Regions BED file Hot Spot

28 ターゲット領域領域の指定 :2 種類の BED ファイル Browser Extensible Data file (.bed) 解析の領域を指定するために必要染色体上の位置情報を持つ UCSC Genome Browser で作成 ( Guide for TargetSeq Custom Enrichment Kit Orders(PN: ) 参照 Target Regions BED file Hot Spot Regions BED file ポジション Target ID 遺伝子名ポジション COSMIC ID * アノテーション Reference C T 28 *COSMIC:Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (

ターゲット領域領域の登録 (1-1) Torrent Brower の References タブから各リファレンス上で解析の対象にする領域を登録することが可能 AmpliSeqCancer Panel に関しては下記の Ampliseq Designer のサイトから BED ファイルをダウンロード https://www.

29 ターゲット領域領域の登録 (1-1) Torrent Brower の References タブから各リファレンス上で解析の対象にする領域を登録することが可能 AmpliSeqCancer Panel に関しては下記の Ampliseq Designer のサイトから BED ファイルをダウンロード Panels タブから既成のパネル情報の表示取得が可能 (1) 対応するリファレンスするリファレンス名をクリック (2) をクリック (1) Torrent BrowserのReferenceタブでターゲット領域を登録したいリファレンス名をクリック (2) Upload BED filesをクリック 29

30 ターゲット領域領域の登録 (1-2) 下記の 2 種類の BED ファイルを登録可能 Target Regions: プラグイン等で解析する対象領域を定義 Hotspot Regions: 既知の変異の情報を含む BED ファイルを登録し VariantCaller が検出した変異にアノテーションを付けて出力 (3) Hotspot Regions を登録する場合は Hotspot をチェック (4) アップロードする BED ファイル指定 (5) Upload ボタンをクリック (4) (3) (5) 30

31 ターゲット領域領域の登録 (2) (1) Torrent BrowerのReferencesタブから Target Regions または Hotspots を選択し Add Target Regionsをクリック (1) (2) (3) (2) BED ファイルの選択 (3) 紐付ける Reference を選択 (4) Upload Target Regions File をクリック (4) 31

32 32 Ion Reporter : 変異の絞り込みとアノテーション

33 Ion Reporter Software マッピング ~ 変異解析 ~ アノテーション ~ レポート作成シーケンサとのダイレクトな統合データの作成から変異のアノテーションまでをカバーバイオインフォマティシャンが不要な簡便な GUI ニーズに合わせてローカル (Local) 版とクラウド (Hosted) 版を提供 33

34 Ion Reporter が対象対象にするにする解析 34 単一サンプルの解析リファレンス配列との相違ペアサンプル解析二つのサンプル間の変異箇所の差異と共通性癌の体細胞変異ペアサンプル解析正常細胞と共通する変異を除外して癌細胞特異的な変異を抽出遺伝性疾患のトリオ解析家族内の変異解析 CNV (Copy Number Variation) 解析単一サンプル / ペアサンプルの CNV の検出 16S メタゲノム解析細菌の属 / 種レベルでの分類

結果の参照参照と絞り込み 35 20 種類以上のアノテーション P Value Gene Symbol Location Functional Impact Scores SIFT Poly-Phen Grantham

35 結果の参照参照と絞り込み種類以上のアノテーション P Value Gene Symbol Location Functional Impact Scores SIFT Poly-Phen Grantham Minor Allele Frequency Gene Ontology OMIM COSMIC Oncomine Variant Database Variant Type Zygosity Ingenuity との連携サービス

36 36 補足

37 Ion AmpliSeq による変異解析例 IonCommunity にてアプリケーションノートとして紹介プレイス > UserGroupJapan > アプリケーションノート 37

38 38

39 ご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまでお問い合わせください Technical Support Call 営業時間 : 午前 9 時から午後 6 時まで The Chip is the Machine 39

40 For Research Use Only. Not intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use Life Technologies Corporation. All rights reserved. The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. MS 3 digital is a registered trademark of IKA WerkeGMBH & Co. 40 TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. Do Not Duplicate

Microsoft PowerPoint - Ion Reporter?ソフトウェアを用いた変異解析4.6.pptx

Microsoft PowerPoint - Ion Reporter?ソフトウェアを用いた変異解析4.6.pptx Ion Reporter ソフトウェアデモンストレーション Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel を用いたがん部および非がん部の体細胞変異比較解析 1 Ion Torrent システムを用いた実験例 Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel を 2 サンプル実施ランレポートランレポートサンプル 1 サンプル 2 2