シ　ー　ズ　育　成　試　験　費

Size: px

Start display at page:

Download "シ　ー　ズ　育　成　試　験　費"

こうきさわい
5 years ago
Views:

1 平成 21 年 4 月 30 日独立行政法人科学技術振興機構 JST イノベーションプラザ福岡館長持田勲殿 ( 受託者 ) 住所名称契約者名印研究成果報告書の提出について平成 20 年度シーズ発掘試験 ( 発掘型 ) について契約書第 13 条の規定に基づき下記の課題について報告します記課題番号課題名代表研究者研究期間国際環境工学部機能性フラーレンを利用する自平成 20 年 7 月 15 日講師細胞評価チップの開発至平成 21 年 3 月 31 日礒田隆聡

2 絡先絡先絡先課題番号平成 20 年度シーズ発掘試験 ( 発掘型 ) 研究報告書技術分野 75 報告日 : 平成 21 年 4 月 30 日課題名 : 機能性フラーレンを利用する細胞評価チップの開発研究期間 : 契約締結日 ~ 平成 21 年 3 月 31 日 1. 担当コーディネータ氏名 ( 役職 ) 北井三正 ( 科学技術コーディネータ ) 所属機関名財団法人北九州産業学術推進機構連所在地 TEL/FAX 北九州市若松区ひびきの / m-kitai@ksrp.or.jp 2. 代表研究者 ( 代表研究者のみ記入してください ) 氏名 ( 役職 ) 礒田隆聡 ( 講師 ) 所属機関名北九州市立大学国際環境工学部連所在地 TEL/FAX 北九州市若松区ひびきの / isoda@env.kitakyu-u.ac.jp 3. 共同研究者 (JST と委託研究契約を締結した共同研究機関の場合のみ記入してください ) 氏名 ( 役職 ) 所属機関名連所在地 TEL/FAX

4. 試験研究の結果報告 (1) 試験内容 (1) 試験目的本研究は細胞から生産される極微量の抗体を測定し病態との関連を評価するための細胞評価チップの開発を目標としている抗原との特異反応を利用して試料に含まれる抗体量を測定する方法に Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ILISA: 酵素結合免疫吸着法 ) が広く行われているこのアッセイでは

3 4. 試験研究の結果報告 (1) 試験内容 (1) 試験目的本研究は細胞から生産される極微量の抗体を測定し病態との関連を評価するための細胞評価チップの開発を目標としている抗原との特異反応を利用して試料に含まれる抗体量を測定する方法に Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ILISA: 酵素結合免疫吸着法 ) が広く行われているこのアッセイではハンドリングに数時間 ~ 数日かかること測定装置を含めコストが高いこと試料量が数 100μl 以上必要であること検出には蛍光抗体や発色酵素等が別途必要であること等課題が多い一方本研究ではチップ平面に配列した微小電極に抗原を固相化できる絶縁感応膜を成膜し微量液滴中に含まれる抗体を反応させる ( 図 1) 反応前後では感応膜 / 液滴界面の誘電分極が変化するため電極間に電圧を負荷させるとこの変化量が電圧変化となって検出できるそのため試料量を 10μl 程度まで低減できること蛍光標識化処理が不要となること検出は数秒であり測定時間を緒幅に縮小できる等従来法での課題を克服できることが期待される図 1 細胞評価チップによる抗原 - 抗体反応の検出原理と開発課題しかし細胞から分泌される抗体は極めて微量であることからセンサの検出電圧の精度をいかにして向上させるかが課題となっているそのためには感応膜界面で誘電分極が安定に発現し抗体濃度に対して線形応答を示す感応膜の開発が必要である本研究では細胞評価チップのセンサ検出機能の精度の向上を目的として種々の材料の中からフラーレンの機能性に着目したフラーレンは炭素電極をアーク放電させる際電極上に生成する煤 ( スート ) 中に含まれるスート中には C60 の他に C70 巨大フラーレンまたカーボンナノチューブ等が混在している工業的には溶剤による分離精製を経て製品化されるため収率が低く高価であるまた表面化学修飾等の二次加工を行わないと水溶性が発現しないそのため医療やバイオ分野への用途が限定されているのが現状であるそこで本研究ではフラーレンの溶剤中での相変化に着目した ( 図 2)

どの場合も高純度に C60 が含まれまた溶剤に均一に溶解あるいは分散した状態であるためバインダーに添加して薄膜状態に成型することが可能である (2) 実施内容と数値目標図 3 実施年度における開発の数値目標図 3

4 図 2 フラーレンの溶剤中での相変化図 2 Case1 ではフラーレンが特定の溶剤に可溶化する性質を利用してその可溶成分 ( 以下 C60(S)) を分別し溶液形態で利用する方法であるフラーレンを可溶化する溶媒としてはトルエンジクロロベンゼン等が知られているいずれも可溶化率は 10wt% 前後である図 2 Case2 では C60(S) にフラーレンを可溶化しない溶媒を混入させてフラーレン結晶の集合微粒子を形成させるこの場合は微粒子が溶剤に分散した形態で利用する方法であるどの場合も高純度に C60 が含まれまた溶剤に均一に溶解あるいは分散した状態であるためバインダーに添加して薄膜状態に成型することが可能である (2) 実施内容と数値目標図 3 実施年度における開発の数値目標図 3 に当該年度における開発の実施内容と数値目標を示す実施項目は以下の 3 段階で行った (1) C60(S) 成分をドーピングしたセンサ感応膜成型方法の確立 (2) C60(S) 成分ドーピングセンサ感応膜の Na イオン検出精度試験 (3) C60(S) 成分ドーピングセンサ感応膜のイムノグロブリン抗体 ( 以下 IgG) 検出精度試験

(2) 得られた成果 (1)C60(S) 成分をドーピングしたセンサ感応膜成型方法の確立図 4 細胞評価チップの概観と構造図 4 に細胞評価チップの概観と構造を示すガラス基板上に Cr/Au を積層させフォトリソグラフィー法にて電極をパターニングしたさらに光感応性樹脂を積層させ同様に電極上部にウェル開口部をパターニング形成した膜作製均一溶解膜 C60( 純度 99%) :10

5 (2) 得られた成果 (1)C60(S) 成分をドーピングしたセンサ感応膜成型方法の確立図 4 細胞評価チップの概観と構造図 4 に細胞評価チップの概観と構造を示すガラス基板上に Cr/Au を積層させフォトリソグラフィー法にて電極をパターニングしたさらに光感応性樹脂を積層させ同様に電極上部にウェル開口部をパターニング形成した膜作製均一溶解膜 C60( 純度 99%) :10 30mg ( 株 ) 製 :nanom purple C60 中 :500μ l 混合溶解遠分離可溶分抽出 :C60(S) 分離孔 :100nm 成分添加 : 系樹脂含有溶剤成分 :C60(S)=1:1 混合液滴下 C60(S) 均溶解膜形成図 5 C60 ドーピング膜の作製 1( 均一溶解膜 ) 図 5 に溶剤に均一に溶解した C60(S) ( 図 2 Case1 に対応 ) をドーピングしたセンサ感応膜の作製方法を示す ( 以下均一溶解膜と記載 ) 市販 C60 にジクロロベンゼンを混合溶解させ遠心分離で可溶成分を分離したこの C60(S) をポリイミド系樹脂含有溶剤と 1:1 比で混合した溶液を図 4 で作製したセンサチップに滴下しスピンコーティング法で電極上に薄膜を成型させた図 6 に溶剤に均一に分散した C60 結晶微粒子 ( 図 2 Case1 に対応 ) をドーピングしたセンサ感応膜の作製方法を示す ( 以下微粒子分散膜と記載 )Case1 と同様に C60(S) 溶液を調製したこの C60(S) を塩化ビニル系樹脂含有溶剤と 1:1 比で混合した溶液を図 4 で作製したセンサチップに滴下しスピンコーティング法で電極上に薄膜を成型させた

6 膜作製微粒子分散膜 C60( 純度 99%) :10mg ( 株 ) 製 :nanom purple C60 中 :500μ l 混合溶解遠分離可溶分抽出 :C60(S) 分離孔 :100nm 成分添加 : 塩化系樹脂含有溶剤成分 :C60(S)=1:1 沈殿滴下 C60(S) 微粒分散膜形成図 6 C60 ドーピング膜の作製 2( 微粒子分散膜 ) 均一溶解膜顕微鏡画像可溶分均一溶解膜不均一膜中心点図 7 C60 ドーピング膜の顕微鏡画像 1( 均一溶解膜 ) 図 7 に均一溶解膜の顕微鏡写真を示す左は C60(S) をドープした膜である右は比較のために不溶分 (C60(IS)) を混入させたものである C60(S) は感応膜中に均一にドーピングされていることが明白である微粒子分散膜顕微鏡画像可溶分再結晶分散膜比較中心点図 8 C60 ドーピング膜の顕微鏡画像 2( 微粒子分散膜 )

7 図 8 に微粒子分散膜の顕微鏡写真を示す左は C60(S) をドープした膜である右は比較のためにドープ無の場合である画像中の白色微粒は抗体を固相化させるための添加成分である膜中に粒径 10~20μm の黒点が観察された ( 図中矢印 ) 図 9 に図 8 の低倍率画像を示す C60(S) の再結晶微粒子はウェル内部の感応膜に広範囲に分散して存在していることが明らかである再結晶分散膜顕微鏡画像図 8 C60 ドーピング膜の顕微鏡画像 2( 微粒子分散膜 ) (2) C60(S) 成分ドーピングセンサ感応膜の Na イオン検出精度試験膜評価検出精度感度補正機構株図 9 センサ測定機器概観 ( バイオセンサモジュール 2006 モデル : アーズ ( 株 )) 図 9 にセンサ測定機器を示す測定はセンサチップを子機端末 ( 画面左 ) に装着しチップ上に所定濃度の生理食塩水 ( 以下 PBS N:N= 規定濃度 1 に対する濃度比 ) を所定量滴下したセンサ検出電圧 ( アナログ信号 ) は子機中の信号回路でデジタル変換され無線回路によって親機 ( 画面右 ) へ常時送信される親機で受信した信号は PC へ転送され時間 vs 電圧のグラフが表示保存される図 10 に C60(S) ドーピング量を変えた均一溶解膜のセンサチップを用いて各ウェルに蒸留水 4μl を滴下した場合の C60(S) ドーピング量 ( 注 : 分離前の C60 の総量 ) と検出電圧の関係を示す比較のため C60 不溶分 (C60(IS)) を混入させた場合のセンサチップでの結果も示す蒸留水測定の場合検出電圧は 700mV と小さくまた C60(S) ドーピング量に関係なくほぼ一定値を示して

8 いるこれは蒸留水の場合センサ感応膜の界面で生じる誘電分極が小さいため膜の組成による影響が現れないことを示している実施例均一溶解膜特性添加量検出電圧実施例均一溶解膜特性添加量検出電圧蒸留水測定測定感度補正機構添加量電圧値関係測定感度補正機構生理食塩水測定添加量電圧値関係不溶分含有可溶分均一溶解膜不溶分含有可溶分電圧値不均一膜電圧値均一溶解膜不均一膜添加量添加量図 10 C60(S) ドーピング量と検出電圧の関係 1 図 11 C60(S) ドーピング量と検出電圧の関係 2 ( 測定試料 :4μl 蒸留水 ) ( 測定試料 :4μl PBS 1) 図 11 に C60(S) ドーピング量を変えた均一溶解膜のセンサチップを用いて各ウェルに PBS 1 溶液 4μl を滴下した場合の C60(S) ドーピング量 ( 注 : 分離前の C60 の総量 ) と検出電圧の関係を示す比較のため C60 不溶分 (C60(IS)) を混入させた場合のセンサチップでの結果も示す PBS 測定の場合検出電圧は C60(S) のドーピング量に大きく依存しノンドープで 1300mV であるのがドーピング 10mg で最大値 1800mVを示しているこれは感応膜に不溶分が含まれている場合は変化が緩慢になっているこのことから C60(S) をドーピングするとセンサ感応膜の界面で生じる誘電分極が顕著に増加することを示している実施例均一溶解膜特性濃度検出電圧精度測定感度補正機構系樹脂膜濃度平均電圧値実施例均一溶解膜特性濃度検出電圧精度測定感度補正機構均一溶解膜濃度平均電圧値実施例均一溶解膜特性濃度検出電圧精度測定感度補正機構不均一膜濃度平均電圧値平均電圧平均電圧平均電圧濃度濃度濃度図 12 感応膜の違いによる Na イオン応答性への影響 ( 感応膜 : ポリイミド系樹脂膜 ( バインダー ) のみ ( 左 ); C60(S) 均一溶解膜 ( 中央 );C60(S)+C60(IS) 不均一溶解膜 ( 右 ), 測定試料 :PBS N(N=0.2,1,2.3) 各 4μl)

9 図 12 に感応膜の種類を変えたセンサチップを用いて各ウェルに PBS 0.2,1,2.3 の濃度になるように PBS 溶液を 4μl ずつ滴下した場合の検出電圧と PBS 濃度の関係を示す図左は感応膜がポリイミド系樹脂膜 ( バインダー ) のみ図中央は C60(S) 均一溶解膜図右は C60(S)+C60(IS) 不均一溶解膜を成膜した場合の結果である図中のプロットは 5 センサで得られた検出電圧の平均値でありプロット上のバーはバラつきの最大値最小値を示しているまた図中には最小二乗法による一次近似直線と (R 相関係数 2 値 ) を示したグラフはバー表示が小さい程バラつきが小さいことを示すまた相関係数は理想直線では 1.0 となるため R 2 =1.0 に近い程濃度との相関が高いことを示す PBS 1 の主成分は Na イオンであり約 3% 含まれる各々の感応膜での相関係数はポリイミド系樹脂膜では C60(S) 均一溶解膜では C60(S)+C60(IS) 不均一溶解膜ではであり理想直線に極めて近い応答を示しているこのように PBS 濃度と検出電圧の間には良好な相関が見られ主成分である Na イオン量と感応膜の誘電分極量が線形的に応答していることが明らかであるしかしプロットのバラつきは大きい方から C60(S)+C60(IS) 不均一溶解膜 > ポリイミド系樹脂膜 >C60(S) 均一溶解膜の序列となっているこのことから C60(S) のドーピングは 5 センサの検出電圧のバラつきを減少させる効果があることが明らかである (3) C60(S) 成分ドーピングセンサ感応膜のイムノグロブリン抗体検出精度試験実施例微粒子分散膜特性抗抗体検出電圧精度測定感度補正機構塩化系樹脂膜抗体塗布解析解析電圧減少率電圧減少率図 13 感応膜の違いによるイムノグロブリン抗体応答性への影響 1 ( 感応膜 : 塩化ビニル系樹脂膜 ( バインダー ) のみ ; 同一センサチップの左側測定 ( 左図 ) および右側測定 ( 右図 ), 固相化物質 : マウス IgG, 測定試料 : マウス抗 IgG=0.5,1,4,7,10μg/ml) 各 12μl) 図 13 にバインダーを感応膜としたセンサチップにイムノグロブリン抗体 (IgG) を固相化し抗原 ( 抗 IgG) 試料を滴下した場合の抗原濃度とセンサ相対応答値の関係を示すバインダー組成は塩化ビニル系樹脂膜に抗体固相化剤を添加したセンサ試験に先立ち予め FITC 標識 IgG 抗体を用

10 いて抗体濃度量ウェル滴下時間を変えた固相化条件の最適化を行ったその結果感応膜上への抗体固相化は 100μg/ml IgG 溶液 5μl を各々のウェルに滴下し 5 分間放置後蒸留水で洗浄することで条件を統一した各ウェルには予め PBS 0.2 溶液 4μl を滴下し一定時間後マウス抗 IgG=0.5,1,4,7,10μg/ml 溶液 ( 各 12μl) を各々のウェルに滴下したセンサ相対応答値は最小検出電圧と最大検出電圧の応答幅に対して抗原滴下後の平衡電圧の比とした図 13 の左右のグラフは同一センサチップの左側 5 センサ及び右側 5 センサを測定し 2 回の測定から再現性を確かめたものであるバインダーのみを感応膜とした場合相関係数は同一チップの左側測定で右側測定でであり抗原濃度とセンサ応答性の相関は低いまた再現性も乏しい実施例微粒子分散膜特性抗抗体検出電圧精度測定感度補正機構微粒子分散膜抗体塗布解析解析電圧減少率相対応答率図 14 感応膜の違いによるイムノグロブリン抗体応答性への影響 2 ( 感応膜 :C60(S) 微粒子分散膜 ( バインダー組成は図 13 と同一 ); 同一センサチップの左側測定 ( 左図 ) および右側測定 ( 右図 ), 固相化物質 : マウス IgG, 測定試料 : マウス抗 IgG=0.5,1,4,7,10μg/ml) 各 12μl) 図 14 に C60(S) 微粒子分散膜に IgG を固相化し抗 IgG 試料を滴下した場合の抗原濃度とセンサ相対応答値の関係を示すバインダー組成は図 13 の実施例と同一であるバインダー中に C60(S) が分散している感応膜での抗 IgG 測定では相関係数は同一チップの左側測定で右側測定でであるバインダーのみを感応膜とした場合と比較して高い精度が得られているまたチップ左右の側での測定で再現性が向上しているこのことから C60(S) の微粒子融合体のドーピングはセンサ検出のバラつきを低下させ再現性を高め抗原濃度測定における濃度と応答値の相関性を向上させる効果があることが明らかとなった

11 (3) 今後の展開本研究成果は現在 ( 財 ) 北九州市産業学術推進機構の知的財産部にて特許出願の審査中である平成 21 年度内には特許出願を 1 件予定しているその後海外専門誌へ論文投稿を予定している (4) 知的財産権について (3) の予定と同じ (5) 今後のフォローアップ等について ( コーディネータ記載 ) 本研究代表者は北九州学術研究都市で実施中の文部科学省知的クラスター II 期事業に平成 21 年度 ~23 年度の期間で参画することが決定している ( テーマ名 :MEMS センサデバイスの高感度化とシステム化技術の研究開発分担 : 抗原 - 抗体センサチップ Micro-ELISA の量産事業化初年度予算 7,837 千円 ) 本研究はその中で事業化の一要素技術として展開していく予定である同財団の知的クラスター事務局の科学技術コーディネーターおよび参与にフォローアップが継続される予定であり今後の展開が期待される

A3 携帯型センサによる抗原抗体反応の検出と化粧品アレルギー検査への応用北九州市立大学国際環境工学部准教授礒田隆聡新技術の概要半導体製造技術で手のひらサイズのバイオセンサを開発しましたこれは抗原抗体反応を容易に検出できます本講演では化粧品アレルギー検査への応用について紹介します従来技

A3 携帯型センサによる抗原抗体反応の検出と化粧品アレルギー検査への応用北九州市立大学国際環境工学部准教授礒田隆聡新技術の概要半導体製造技術で手のひらサイズのバイオセンサを開発しましたこれは抗原抗体反応を容易に検出できます本講演では化粧品アレルギー検査への応用について紹介します従来技術競合技術との比較既存のアレルギー検査は ELISA 法による血液検査が主流で高価なマイクロプレートと検出機器を必要とし

シ ー ズ 育 成 試 験 費

シ　ー　ズ　育　成　試　験　費