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1 平 成 17 年 度 農 林 水 産 省 食 品 製 造 工 程 管 理 情 報 高 度 化 促 進 事 業 平 成 17 年 度 病 原 微 生 物 データ 分 析 実 験 作 業 成 果 報 告 書 腸 炎 ビブリオ 血 清 型 O3:K6 株 の 増 殖 に 関 する 基 礎 データ 構 築 - 低 温 域 におけるデータ- 平 成 18 年 1 月 国 立 大 学 法 人 東 京 海 洋 大 学 藤 井 建 夫 教 授 木 村 凡 助 教 授

2 平 成 17 年 度 食 品 製 造 工 程 管 理 情 報 高 度 化 促 進 事 業 病 原 微 生 物 データ 分 析 実 験 報 告 書 平 成 18 年 1 月 16 日 東 京 海 洋 大 学 藤 井 建 夫 木 村 凡 腸 炎 ビブリオ 血 清 型 O3:K6 株 の 増 殖 に 関 する 基 礎 データ 構 築 低 温 域 におけるデータ 目 的 : 1996 年 のインドにおける 腸 炎 ビブリオ O3:K6 株 による 食 中 毒 の 発 生 を 契 機 に 日 本 を 含 む 東 アジアおよび 米 国 において 本 血 清 型 の 腸 炎 ビブリオによる 食 中 毒 が 広 域 的 に 発 生 している パルスフィールド 電 気 泳 動 などを 中 心 とした 遺 伝 子 型 解 析 の 結 果 腸 炎 ビブリ オ O3:K6 株 は 単 一 クローンが 世 界 中 に 広 がって 食 中 毒 を 引 き 起 こしている 可 能 性 が 高 い と 考 えられるが 遺 伝 子 型 と 増 殖 力 の 関 係 はまだ 明 らかではない なぜ 血 清 型 O3:K6 株 の みが 世 界 的 に 食 中 毒 原 因 菌 となっているのかは 不 明 であるが 考 えられる 可 能 性 を 整 理 す ると (1) 本 株 は 他 の 血 清 型 の 株 (TDH 陽 性 陰 性 を 問 わず)と 食 品 中 での 増 殖 力 が 異 なる (2) 本 株 が 他 の 血 清 型 の 株 よりヒトへの 感 染 力 が 強 い の 2 点 に 整 理 できる この うち 水 産 加 工 業 者 にとっては 前 者 の 情 報 すなわち 食 中 毒 原 因 菌 の 本 株 がどのような 条 件 で 増 殖 しやすいのかについて 知 ることは 重 要 である 昨 年 度 の 本 事 業 では 腸 炎 ビブ リオ O3:K6 株 およびその 他 血 清 型 各 20 株 について 各 種 温 度 (15~30 ) ph(5.0~8.0) 塩 分 (0.5~7%) 条 件 下 での 増 殖 特 性 を 調 べた その 結 果 15 において 両 血 清 型 株 間 の 増 殖 速 度 に 違 いがあることが 認 められた しかし この 温 度 領 域 ではデータのばらつきが 大 きかった 一 方 腸 炎 ビブリオの 低 温 域 (5~10 )における 増 殖 特 性 は 低 温 保 持 が 最 重 要 な 手 段 である 本 菌 の 食 中 毒 対 策 においても 重 要 な 課 題 であり 水 産 加 工 業 者 に 対 しても 温 度 管 理 を 行 う 上 で 大 変 有 効 な 情 報 提 供 が 可 能 である そこで 今 年 度 は 低 温 域 (5~15 ) における 本 菌 の 増 殖 特 性 を 調 査 した 実 験 設 計 : Vibrio parahaemolyticus 40 株 に 対 して 吸 光 度 測 定 により 240 通 りの 増 殖 曲 線 (40 株 3 温 度 2 回 測 定 )を 得 た その 後 吸 光 度 値 を 生 菌 数 に 換 算 し 微 生 物 増 殖 データ 分 析 ソフトウェア(MicroFit version 1.0)を 使 用 して ラグタイムおよびログタイムのデータ を 算 出 した 1

3 測 定 条 件 として 温 度 3 区 分 [5, 10, 15 (NaCl 3.0%, ph 7.2 条 件 下 )]における 経 時 的 な 増 殖 データを 出 した 実 験 方 法 : 1. 供 試 菌 株 東 京 都 健 康 安 全 研 究 センターから 分 与 された 食 中 毒 患 者 由 来 の V. parahaemolyticus O3:K6 TDH 陽 性 株 20 株 同 所 から 分 与 された 環 境 ( 海 水 海 泥 ) 由 来 の O3:K6 TDH 陰 性 株 3 株 および 東 京 都 健 康 安 全 研 究 センター 多 摩 支 所 から 分 与 された 食 品 (カツオ ホタテ 等 の 魚 介 類 ) 由 来 の O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 17 株 の 計 40 株 を 使 用 した (Table 1) これらの 菌 株 は LB 寒 天 培 地 スラント [Bacto Tryptone (Difco, ベクト ンディッキンソン)1.0%(w/v), Bacto Yeast Extract (Difco, ベクトンディッキンソン) 0.5%(w/v), 塩 化 ナトリウム( 国 産 化 学 )1.8%(w/v) および 寒 天 末 ( 国 産 化 学 ) 1.5% (w/v)]に 30 で 6 時 間 培 養 し 15 下 で 1~2 ヶ 月 の 保 存 した 2. 使 用 培 地 前 培 養 および 本 培 養 の 実 験 には Trypticase Soy Broth(TSB) 培 地 (ベクトンディッ キンソン)[ 塩 化 ナトリウムを 塩 濃 度 3.0%(w/v)になるよう 添 加 ; ph 7.2( 未 調 整 )]を 使 用 した 使 用 培 地 は 121 で 15 分 間 高 圧 滅 菌 を 行 い 実 験 に 使 用 した 3. V. parahaemolyticus の 増 殖 曲 線 TSB 培 地 で 30 一 晩 静 置 培 養 した 定 常 期 の 供 試 菌 の 前 培 養 液 (8~9 Log cfu/ml)に ついて 紫 外 可 視 分 光 光 度 計 [UV-1700( 島 津 製 作 所 )]を 用 いて 吸 光 度 ( 以 下 すべて OD 660 で 計 測 )を 測 定 した その 培 養 液 を OD 660 =0.005~0.025(6.4~6.5 Log cfu/ml) になるように 各 塩 濃 度 ph 条 件 に 調 製 した 6mL TSB 培 地 [L 字 型 試 験 管 TN-5L (Advantec)を 使 用 ]に 接 種 した その 後 小 型 振 盪 培 養 装 置 [バイオフォトレコーダー TN-1506(Advantec)]を 用 いて 各 温 度 条 件 下 で 振 とう 培 養 (45 rpm)を 行 い 経 時 的 に 吸 光 度 により 増 殖 を 測 定 した 測 定 間 隔 は 温 度 区 分 15 下 では 30 分 毎 に それ 以 外 で は 15 分 毎 に 行 った この 実 験 を 2 回 行 った 4. 生 菌 数 への 換 算 吸 光 度 を 生 菌 数 (Log cfu/ml)に 換 算 するため 代 表 株 2 株 [V02-64(O3:K6 TDH 陽 性 )および T1(O2:KUT TDH 陰 性 )]を 用 いた 3. V. parahaemolyticus の 増 殖 曲 線 と 同 様 に 供 試 菌 株 の 前 培 養 液 を L 字 型 試 験 管 内 の 6mL TSB 培 地 に 接 種 し 小 型 振 盪 培 養 装 置 を 用 いて 30 下 で 振 とう 培 養 を 行 い 15 分 毎 に 吸 光 度 により 増 殖 を 測 定 した そ れと 同 時 に 平 板 塗 抹 法 による 生 菌 数 測 定 を 行 った 経 時 的 に OD 660 測 定 直 後 の L 字 型 試 験 管 を 小 型 振 盪 培 養 装 置 から 取 り 出 して 100μL を 分 取 し L 字 型 試 験 管 を 元 に 戻 して 振 と 2

4 う 培 養 を 再 開 させた その 後 分 取 した 菌 液 を 必 要 に 応 じて 希 釈 用 ペプトン 水 [Bacto Peptone(Difco, ベクトンディッキンソン) 0.1%(w/v)および 塩 化 ナトリウム 1.8% (w/v)] を 用 いて 段 階 希 釈 し Trypticase Soy Agar(TSA) 平 板 培 地 (ベクトンディッ キンソン) [ 塩 化 ナトリウムおよび 寒 天 末 をそれぞれ 終 濃 度 1.8%(w/v), 2.0%(w/v) になるように 添 加 ] にスパイラルプレーター [EDDY JET(IUL)] を 用 いてらせん 状 に 49.2μL 塗 抹 し 25 で 18~24 時 間 培 養 した 培 養 後 平 板 上 に 得 られたコロニーを スパイラルプレーターの 計 測 法 に 従 ってカウントし 生 菌 数 を 算 出 した この 実 験 を 2 回 行 い 吸 光 度 と 生 菌 数 の 相 関 曲 線 を Excel 2000(Microsoft)を 用 いて 描 き 近 似 式 とその 相 関 係 数 を 得 た(Fig. 1, 式 1) 式 1 を 用 いて 吸 光 度 の 生 菌 数 への 換 算 を 行 った 換 算 式 は Y= X X X X X X [R 2 =0.99; X= OD 660, Y= 生 菌 数 (Log cfu/ml)] ( 式 1) とした 5. 予 測 微 生 物 学 的 増 殖 モデル 式 1 により 得 られた 吸 光 度 の 生 菌 数 への 換 算 値 について 微 生 物 増 殖 データ 分 析 ソフト ウェアである MicroFit version 1.0 [ Institute of Food Research ( IFR ) ; より 供 与 ]を 用 いて 増 殖 曲 線 を 作 成 し ラグタイム(lag time) ログタイム(doubling time)のデータをそれぞれ 算 出 した MicroFit version 1.0 は Baranyi ら 1) の 予 測 式 に 基 づいてモデリングを 行 うソフトウェア である 増 殖 曲 線 作 成 の 際 には 測 定 値 (プロット)と 予 測 値 ( 増 殖 曲 線 )がフィットす るよう 誤 差 を 表 すパラメータ[error estimate, RSS(Residual Sum of Squares)およ び RSM(Root Mean Square Error)]が 0.00~0.10 の 範 囲 内 に 入 るように 測 定 値 の 適 用 範 囲 を 選 択 した ラグタイムおよびログタイムは 1 株 について 2 回 測 定 分 の 平 均 値 を 表 し た(Table 2) 結 果 : 腸 炎 ビブリオ 40 株 (O3:K6 TDH 陽 性 株 20 株, O3:K6 TDH 陰 性 株 3 株, O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 17 株 ) について 温 度 3 区 分 [5,10,15 (NaCl 3.0%, ph 7.2 条 件 下 )] におけるラグタイムおよびログタイム (2 回 測 定 分 の 平 均 値 ) を 表 した (Table 2) 昨 年 度 と 同 様 に 15 では 株 間 のばらつきが 大 きい 傾 向 が 確 認 されたが ラグタイムおよ びログタイムの 平 均 は 15 で および 1.50 時 間 10 では および 7.48 時 間 であった 5 では 2 回 の 実 験 とも 14 日 間 培 養 をしても 増 殖 せず その 後 37 で 培 養 し ても 増 殖 が 認 められなかったことから 死 滅 が 確 認 された 血 清 型 および TDH の 有 無 による 増 殖 挙 動 の 違 いを 調 べるために 各 条 件 下 における O3:K6 TDH 陽 性 株 20 株 および O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 17 株 のラグタイム 3

5 ログタイムの 平 均 値 をそれぞれ 算 出 し 総 合 的 に 比 較 した 15 では O3:K6 TDH 陽 性 株 のラグタイムおよびログタイムは 時 間 であるのに 対 し O3:K6 TDH 陰 性 株 および O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 は および 時 間 であ り ログタイムはあまり 違 いが 見 られないが ラグタイムについては O3:K6 TDH 陽 性 株 の 方 が 短 かった 10 では O3:K6 TDH 陽 性 株 はラグタイムおよびログタイムが 時 間 O3:K6 TDH 陰 性 株 では 時 間 O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 では 極 めて 大 きな 値 を 示 した 環 境 由 来 株 である T29 を 除 外 すると 時 間 であり 15 の 場 合 と 同 様 にラグタイムおよびログタイムには 大 きな 差 が 見 られなかった また 10 においては O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 の 半 数 が 10 日 培 養 で 増 殖 が 確 認 されないものが 半 数 あったが これらの 株 は その 後 37 で 培 養 をすると 増 殖 が 見 られ 死 滅 していないことが 確 認 された 考 察 : 腸 炎 ビブリオは 海 洋 に 広 く 存 在 するグラム 陰 性 桿 菌 であり 魚 介 類 を 原 因 食 品 とする 食 中 毒 の 原 因 菌 としてよく 知 られている 本 菌 の 特 徴 として 増 殖 がきわめて 早 いことが 挙 げられ 至 適 増 殖 条 件 下 (37 NaCl 1~3% ph 7.5~8.5 BHI 液 体 培 地 ) 2) ではログ タイムが 8 分 あることが 示 されている したがって 至 適 条 件 下 においては 2 時 間 程 度 で 食 中 毒 発 生 菌 量 に 達 する 恐 れがあり それを 防 ぐためにも 増 殖 予 測 モデルの 構 築 が 望 まれ ている 今 年 度 は 昨 年 度 の 結 果 を 踏 まえて 15~5 の 低 温 域 (NaCl 3.0%, ph 7.2) に おける 増 殖 特 性 を 確 認 した 増 殖 モデリングに 使 用 した 生 菌 数 については 昨 年 度 と 同 様 に 直 接 平 板 培 養 法 により 測 定 したものではなく 吸 光 度 と 平 板 培 養 法 による 生 菌 数 の 相 関 曲 線 の 近 似 式 ( 式 1) をも とに 吸 光 度 から 間 接 的 に 求 めている 実 際 に 生 菌 数 測 定 した 値 ではないが 近 似 式 の 相 関 係 数 が 高 く (R 2 =0.99) 近 似 式 により 換 算 が 可 能 であると 判 断 した 腸 炎 ビブリオの 増 殖 特 性 であるが 15 および 10 においてはログタイムの 違 いはあま り 見 られないが ラグタイムについては O3:K6 TDH 陽 性 株 の 方 が 短 い 傾 向 が 見 られた また 10 では O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 ( 食 品 由 来 )は 10 日 間 で 増 殖 が 確 認 されない 株 が 半 数 あり 相 対 的 に O3:K6 株 は 低 温 に 強 いことが 示 唆 された O3:K6 TDH 陽 性 株 の 低 温 増 殖 性 の 高 さについて 仁 科 ら 4) の 実 験 および 昨 年 の 事 業 報 告 で 同 様 の 結 果 が 得 られているが 10 でも O3:K6 TDH 陽 性 株 は 他 に 比 べて 低 温 において 増 殖 性 が 強 いことが 示 された ただし 低 温 域 は 本 菌 にとって 増 殖 に 不 利 な 環 境 であるためか 2 測 定 間 や 菌 株 間 の 誤 差 が 大 きい 点 は 留 意 するべきである また 5 では 全 ての 株 が 14 日 間 培 養 で 増 殖 せず 死 滅 が 確 認 された このことから 本 菌 の 生 育 限 界 は 10 から 5 の 間 であると 推 察 された 日 本 では 腸 炎 ビブリオ 食 中 毒 を 防 止 するため 生 食 用 水 産 加 工 品 について 冷 蔵 保 存 下 4

6 を 出 てから 可 能 な 限 り 速 やか ( 最 大 2 時 間 以 内 ) に 消 費 するよう 提 言 されている 3) 本 研 究 の 結 果 から 流 通 や 保 管 時 に 冷 蔵 庫 などに 保 存 しても O3:K6 TDH 陽 性 株 は 緩 やかに 増 殖 することが 懸 念 され また 10 でも TDH 陽 性 の 腸 炎 ビブリオが 死 滅 しないという ことは 冷 蔵 庫 から 移 動 した 場 合 温 度 不 備 が 起 これば 一 気 に 増 殖 し 食 中 毒 を 引 き 起 こ す 可 能 性 はある したがって 食 中 毒 予 防 の 三 原 則 である 付 けない 増 やさない 殺 す の 付 けない を 徹 底 することが 望 まれる 要 約 : 腸 炎 ビブリオ O3:K6 株 および O3:K6 以 外 の 血 清 型 株 ( 全 40 菌 株 ) を 用 いて 温 度 条 件 ( )を 変 えて TSB 培 地 で 培 養 し ラグタイムおよびログタイムを 調 査 した 低 温 域 においては 近 年 世 界 的 に 流 行 を 見 せている O3:K6 TDH 陽 性 株 の 増 殖 特 性 が O3:K6 TDH 陰 性 株 や O3:K6 以 外 の 血 清 型 株 に 比 べて 高 く 流 行 株 は 低 温 において 増 殖 性 が 強 いことが 示 された したがって 冷 蔵 下 の 食 品 において O3:K6 TDH 陽 性 株 が 非 病 原 性 株 (O3:K6 以 外 の 血 清 型 TDH 陰 性 株 ) よりも 増 殖 しやすく 低 温 貯 蔵 後 も 至 適 温 度 におかれれば 増 殖 する 可 能 性 は 高 いと 予 想 された このことから O3:K6 についてはそ の 他 の 株 と 区 別 して 増 殖 の 危 険 性 を 評 価 し その 対 策 を 進 める 必 要 があると 示 唆 された また 昨 年 度 の 結 果 と 合 わせて 総 合 的 に 考 察 すると 腸 炎 ビブリオ O3:K6 株 の 温 度 ph 水 分 活 性 に 対 する 増 殖 特 性 は 大 きなばらつきがなく 今 後 増 殖 予 測 モデル 構 築 に 向 けた 代 表 株 の 選 定 が 可 能 であると 判 断 された ただし 低 温 における 本 菌 の 挙 動 は 株 ごとにばら つきが 大 きく 低 温 貯 蔵 時 の 増 殖 予 測 モデルの 構 築 は 困 難 であると 考 えられる 文 献 : 1) Baranyi, J., T. A. Roberts A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. Int. J. Food Microbiol ) 加 藤 博 各 種 食 品 細 菌 の 増 殖 速 度 に 関 する 研 究. 第 1 報 Vibrio parahaemolyticus の generation time について. 日 本 細 菌 学 雑 誌. 20: ) 厚 生 労 働 省 医 薬 局 食 品 保 健 部 長 通 知 食 品 衛 生 法 施 行 規 則 及 び 食 品, 添 加 物 等 の 規 格 基 準 の 一 部 改 正 について 平 成 13 年 6 月 7 日, 食 発 第 170 号 (2001). 4) 仁 科 徳 啓. 和 田 正 道. 小 澤 宏 和. 工 藤 由 紀 子. 小 沼 博 隆. 長 谷 川 順 子. 熊 谷 進 各 種 ph, 塩 濃 度 および 温 度 条 件 による Vibrio parahaemolyticus O3:K6 の 増 殖 動 態. 食 品 衛 生 学 雑 誌. 45: ) Sanyal, S.C., P.C. Sen Human volunteer study on the pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus. Saikon, Tokyo, pp

7 Table 1. Vibrio parahaemolyticus strains used in this study Year of Virulence gene Origin Name Isolate tdh trh Serotype Clinical V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 Environ. V O3:K6 V O3:K6 V O3:K6 Food T O2:KUT T O2:KUT T O10:K52 T O5:K17 T O5:K17 T O10:KUT T O3:KUT T O5:K17 T O2:K28 T O4:K34 T O11:KUT T O1:K32 T O2:K28 T O7:KUT T O11:KUT T O1:KUT T O3:KUT

8 Table 2. Derived parameters of lag- and doubling-time of V. parahaemolyticus Lag time [hour] Doubling time [hour] Strain O3:K6 TDH + V * V V V V V V V V V V V V V V V V V V V Average Max Min SD O3:K6 TDH - V V V Average Max Min SD non-o3:k6 TDH - T T T T T T T29 * T T T T T T T T T T Average Max Min SD Average Max Min SD *1 -: No increase of optical density in 10 days. *2 Abnormal value at 10 was excluded from evaluation.