内 容 1. サンプル 抽 出 と 品 質 チェック mrna / mirna / gdna 2. アジレントアレイ 実 験 のポイント 3. アレイデータの 品 質 チェックと 性 能 評 価 法 アジレントQCレポートとGX9の 活 用 法

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1 マイクロアレイ 実 験 サンプル 調 整 データQC に 関 する 注 意 事 項

2 内 容 1. サンプル 抽 出 と 品 質 チェック mrna / mirna / gdna 2. アジレントアレイ 実 験 のポイント 3. アレイデータの 品 質 チェックと 性 能 評 価 法 アジレントQCレポートとGX9の 活 用 法

3 1. サンプル 抽 出 と 品 質 チェック -サンプル 抽 出 法 の 選 択 - 抽 出 サンプルの 確 認 法 -サンプル 品 質 のアレイデータへの 影 響

4 サンプル 抽 出 方 法 の 選 択 本 当 に 必 要 な 物 質 が 取 れて 不 要 なものが 除 去 できる 方 法 ですか? 比 較 対 象 サンプル 群 で 抽 出 方 法 は 統 一 されていますか?

5 サンプル 抽 出 方 法 の 選 択 Agilentで 実 績 のある 核 酸 抽 出 法 acgh 用 gdna Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit (69504または69506) mirnaアレイ 用 Total RNA Invitrogen TRIzol Reagent ( ) Qiagen mirneasy Mini kit (217004) Applied Biosystem mirvana RNA Isolation kit (AM1560) Total RNAの 抽 出 プロトコールを 使 用 し small RNAの 濃 縮 精 製 は 行 わないで 下 さい

6 サンプル 抽 出 方 法 の 選 択 ULSラベル 化 acgh 用 プロトコル 血 液 培 養 細 胞 組 織 FFPEサンプルに FFPEサンプルに 対 応 した した DNA DNA 抽 出 法 までカバー までカバー

7 核 酸 濃 度 純 度 の 確 認 UV 吸 光 度 測 定 測 定 する 波 長 : 230nm, 260nm, 280nm, 320nm A230 A260 A280 様 々なコンタミネーションの 確 認 核 酸 濃 度 測 定 1 = 40 ug/ml (RNA) 1 = 50 ug/ml (DNA) タンパク 質 フェノールの 混 入 を 確 認 A260/A280 = 1.8 ~ 以 下 : タンパク 質 フェノールの 混 入 2.0 以 上 : その 他 の 混 入 A320 異 常 な 吸 光 がないか 確 認 粒 子 等 の 混 入

8 核 酸 濃 度 純 度 の 確 認 RNAのUV 吸 収 スペクトル チェック 項 目 純 度 の 高 いRNA 260/ / 純 度 の 低 いRNA 260/ / λmaxが 260nmにある ベースラインが 安 定 してゼロの 位 置 にある 260nmの 吸 光 が 低 波 長 の 吸 光 に 影 響 されている 230nmに 谷 がある

9 核 酸 濃 度 純 度 の 確 認 RNAとDNAのUV 吸 収 スペクトル RNA DNA UV 吸 収 だけでは RNAとDNAは 区 別 して 検 出 できません!

10 核 酸 濃 度 純 度 の 確 認 選 択 的 な 核 酸 の 検 出 方 法 gdnaを 定 量 する 場 合 Quant-iT PicoGreen dsdna Assay Kitなどの 二 本 鎖 DNA 選 択 的 検 出 法 を 使 うと RNAのコンタミネーションの DNA 定 量 値 への 影 響 を 軽 減 することができます 分 解 が 進 んだDNAを 定 量 する 際 二 本 鎖 DNAの 濃 度 を 正 確 に 測 れない 傾 向 がある

11 Total RNAの 分 解 度 合 いの 確 認 分 解 されていないTotal RNA 分 解 の 進 んだTotal RNA RIN8.3 RIN2.2 吸 光 度 は 核 酸 の 分 解 具 合 についての 情 報 を 持 ちません! 電 気 泳 動 による 長 さのチェックが 必 須

12 BioanalyzerによるTotal RNAの 分 解 度 合 いの 確 認 Bioanalyzerを 使 ったのワークフロー 1. サンプルアプライ 1 チップ 調 製 とサンプルアプライ (5 分 ) 2 12/11サンプルの 分 析 (30 分 ) 3 データの 定 性 定 量 2. 分 析 開 始 Exchangeable cartridge for electrophoresis 16 pin electrodes connected to High Voltage source Chip holder with heater plate 3. データ 解 析

13 BioanalyzerによるTotal RNAの 分 解 度 合 いの 確 認 RIN RNA 品 質 確 認 のためのツール RNA Integrity Number ソフトウェアのアルゴリズムは エレクトロフェログラム 全 体 から 自 動 的 に 品 質 を 分 類 *サンプルの 客 観 的 な 基 準 を 設 けることができる

14 BioanalyzerによるTotal RNAの 分 解 度 合 いの 確 認 RIN RNAの 分 解 の 進 行 に 応 じて 1~10 に 分 類 RIN: 1 RIN: 2 RIN: 3 RIN: 4 RIN: 5 Degraded RIN: 6 RIN: 7 RIN: 8 RIN: 9 RIN: 10 Intact

15 RINを 使 ったTotal RNAの 分 解 度 合 いの 確 認 参 考 文 献 1 -Electropherogramを 目 で 見 る/rRNAの 比 /RINの3つの 判 断 法 を 比 較 -さらにマイクロアレイの 結 果 とそれぞれの 結 果 も 比 較

16 RINを 使 ったTotal RNAの 分 解 度 合 いの 確 認 参 考 文 献 2 -RIN4.6 以 下 で 相 対 量 の 大 幅 な 減 少 が 見 られたが その 程 度 は 遺 伝 子 によって 異 なる RIN GAPDH HPRT1 YWHAZ mrnaの3 側 mrnaの5 側

17 アガロースゲル 電 気 泳 動 によるgDNA 分 解 の 確 認 ULS Labelingの 場 合 実 験 の 前 に gdnaの 分 解 具 合 を 知 ることが 必 要 Agilent CGH ULS labeling protocol v.2.0 gdna 平 均 塩 基 長 10kb 以 上 7kb 以 上 7kbより 短 い 断 片 化 時 間 10 分 間 加 熱 5 分 間 加 熱 加 熱 なし 分 間 加 熱 加 熱 なし ~ 500 ~ 分 間 加 熱 1.2% agarose gel, 20 ng DNA, Sybr Gold stain

18 アガロースゲル 電 気 泳 動 によるgDNA 分 解 の 確 認 Enzymatic Labelingの 場 合 Agilent CGH Enzymatic labeling protocol v.5.0 増 幅 をしないDirect 法 では 多 少 の 分 解 は アレイデータに 影 響 しない WGAを 使 った 増 幅 法 では 500bp 以 上 の 長 さが 必 要 増 幅 法 におけるgDNAの 分 解 具 合 の 影 響 control DNA (Female) Intact 分 解 HT29 Intact分 解

19 サンプル 抽 出 と 品 質 チェック まとめ アレイ 実 験 の 目 的 に 沿 った 適 切 な 核 酸 抽 出 方 法 を 選 択 する 抽 出 してきたサンプルの 純 度 品 質 をチェック し それらがアレイデータに 与 える 影 響 を 理 解 す る 必 要 がある

20 2. アジレントアレイ 実 験 のポイント -Washのアーティファクトについて -アレイデータに 与 えるオゾンの 影 響 について

21 Agilentが 提 供 する マイクロアレイ 実 験 プロトコル のマークが 付 いているものは 日 本 語 プロトコル 対 応

22 Wetの 実 験 を 成 功 から 遠 ざける 要 因 は? サンプルのQualityの 問 題 バックグラウンドによるS/N 比 の 低 下 実 験 環 境 中 のオゾンによる 褪 色

23 オゾン 暴 露 による Cy-Dye の 選 択 的 分 解 Ozone:~2-4 ppb Branham et al., BMC Biotechnology2007 Feb 12;7:8. Cy5のシグナルは 経 過 時 間 に 応 じて 減 衰 していった このオゾン 濃 度 では Cy3のシグナルは 有 意 には 変 化 しなかった

24 オゾンによる 色 素 の 分 解 がアレイデータに 与 える 影 響 スポット 内 のシグナル 不 均 一 スライド 内 のシグナル 不 均 一 より 空 気 に 曝 されやすい

25 環 境 中 の 光 化 学 オキシダントが100ppbを 超 えることも 環 境 GIS

26 Agilentが 推 奨 するオゾン 対 策 活 性 炭 フィルターで 実 験 環 境 からオゾンを 除 去 する オゾンクリーンブース 内 で 洗 浄 と 乾 燥 スキャンを 行 う アズワン 株 式 会 社 製 品 番 号 : 2-M005-01B ( mm) 製 品 名 : オゾンフリーブース フィルターは 定 期 的 に 交 換 が 必 要 です アレイ 実 験 の 規 模 実 験 室 環 境 によっては 空 調 にフィルターを 組 み 込 み 部 屋 全 体 をオゾンフリーにする 選 択 肢 も

27 アジレントアレイ 実 験 のポイント まとめ TritonX-102をWash Bufferに 添 加 することで バックグラウンドを 低 く 抑 えることができる 2カラー 実 験 を 行 なう 場 合 オゾンの 対 策 を 取 る 必 要 がある Agilentアレイユーザー 向 けに Agilent DNAマイクロアレイカストマニュース で 最 新 サポートニュースを 配 信 中

28 3. アレイデータの 品 質 チェックと 性 能 評 価 法

29 アレイデータの 品 質 をどのように 確 認 しますか?

30 Agilentが 提 供 する 実 験 データの 品 質 確 認 材 料 QC report

31 QC report 主 なチェックポイント1 グリッドのチェック お 使 いのグリッドファイルは アレイのデザインに 合 致 していますか? グリッドがずれていませんか?

32 QC report 主 なチェックポイント2 アレイ 上 の 分 布 のチェック Outlier( 外 れ 値 )はどの 程 度? 極 端 な 分 布 をしていませんか? Up regulatedとdown regulatedの Featureが 特 徴 的 な 分 布 を していませんか?(2colorのみ)

33 Agilent Spike-In Mix ( 遺 伝 子 発 現 アレイ 用 Option) -10 種 類 の 異 なる 配 列 のポリA 付 加 人 工 RNAが 6 桁 のダイナミックレンジに 渡 る 濃 度 範 囲 で 含 まれる -アレイ 実 験 データの 直 線 性 感 度 正 確 性 を 評 価 Spike-In Mix 1color Spike-In Mix 2color A B 1color spike-mixの 例 RNAサンプル RNAサンプル ラベル 化 ハイブリ

34 QC report 主 なチェックポイント3 Spike-In Mixの 結 果 のチェック 繰 り 返 しスポットの 再 現 性 は? シグナルの 正 確 性 は?

35 でも 1 回 の 実 験 でもQCレポートはたくさんできる 全 部 相 互 比 較 するのは 大 変 だ

36 GeneSpringGX9で 解 析 前 のデータの 一 括 品 質 チェック Quality Controlウィンドウ

37 複 数 データの 品 質 を 一 挙 にチェック 例.Agilent 遺 伝 子 発 現 1カラー Spike-In Controlの 直 線 範 囲 下 限 濃 度 非 コントロール 繰 り 返 しプローブの 変 動 係 数 Spike-In Control 繰 り 返 しプローブの 変 動 係 数 Spike-Inのシグナル 値 と 濃 度 のslope 値 Non Uniformity Outlierの 割 合 Negative ControlのSD 値 etc 外 れデータを 一 括 チェック!

38 Agilent 遺 伝 子 発 現 1カラー 用 Quality Control Metrics Quality Control Metrics は サンプルに 依 存 しない 項 目 を 集 めているため プロットがばらつく 場 合 実 験 上 問 題 が ある 可 能 性 がある

39 サンプルの 相 関 グループ 分 けなどをチェック Experiment 内 のSample 間 の 総 当 りの 相 関 係 数 を 計 算 事 前 の 知 見 と 合 致 していますか?

40 主 成 分 分 析 (PCA)の 結 果 から 外 れサンプルを 見 つける Biological Replicatesなのにひとつだけ 離 れている など 外 れ 値 の 可 能 性 があるものはありませんか?

41 アレイデータの 品 質 チェックと 性 能 評 価 法 まとめ AgilentのQC reportやspike-in Controlを 活 用 し アレイデータに 異 常 なことが 起 こっていない かをチェックする データ 解 析 の 前 に 解 析 に 使 えるデータかどう かをチェックする

42 Thank you for your attention!