網羅的定量プロテオミクス解析ソフトウェア DIAデータ用プロテオミクス解析ソフトウェア TM フィルジェン株式会社
データ独立取得 (DIA) は ディスカバリープロテオミクスワークフローにおいて必要な手法となってきています Spectronaut は 統合された検索エンジンPulsarを含む最先端のデータ解析アルゴリズムにより タンパク質のカバレッジとデータの完全性を最大限に引き出すことができました Spectronaut Pulsar Xは 研究アプリケーションの数を大幅に増やすための新しいワークフローを提供します ハイブリッドライブラリーの生成コアプロテオームライブラリー (project specific libraryまたは resource library) とサンプル特異的ライブラリー (directdia) を組み合わせることにより 定量可能なタンパク質の数を増やすことができます Spike-inワークフロー Biognosysの新しい PQ500 reference peptide kit と組み合わせることで 濃度 5 桁にもわたる包括的なリファレンスキャリブレーションカーブを使い 標的タンパク質のラベルフリーによる定量を行うことができます Spectronaut Pulsar Xには パフォーマンスとビジュアライゼーションの向上によるデータ解析を容易にする新機能も含まれています 広範なスペクトルライブラリーパフォーマンスとメモリ効率の向上により 非常に大きな実験を処理できます Data match plot 視覚化するマッチングしたイオンを選択できるフィルター機能があります Protein-coverage plot 簡単なoverviewを実行することでアノテーション付けされたタンパク質をより多く分類することが可能です Temporary storage 複数のインスタンスでSpectronaut を動作させることで生じる衝突を防ぐ強力なフレームワークを提供します 宿主細胞由来タンパク質 キャリブレーションキャリーオーバーにより 高い精度で低量の宿主 細胞由来タンパク質の同定および定量化が可能です 1
TECHNICAL INFORMATION 対応している質量分析装置 Thermo Scientific Q Exactive Series Thermo Scientific Orbitrap Fusion Series SCIEX TripleTOF Series (5600, 5600+, 6600) Bruker Q-TOF Series Waters Xevo G2-XS QTof 推奨するコンピュータのシステム要件 OS: Windows 7 (64bit) 以降 CPU: Intel Core i7 4770, 3.4 GHz (8コア) 以上 HDD: 500 GB 以上の空き容量 Memory: 16 GB 以上 Software:.NET 4.5 以上 対応している分析手法 Spectronaut Pulsar Xは 様々な手法の生データに対応しています DIA WiSIM-DIA SWATH SWATH 2.0 SONAR 上記手法のMS1とMS2スキャンデータ またはMS2スキャンデータのみが必要となります 分析法のサイクルタイムは 平均ピーク幅に応じて1-3 秒の範囲でなければなりません 気相分画にも対応しています 2
データ独立取得 (DIA) は データ中のペプチド断片を抽出するためにスペクトルライブラリーを必要とするような非常に複雑なデータです ライブラリーは 実際に解析で使用されるサンプル (project specific library) または 異なるサンプルや異なる測定装置で生成されたデータ (resource library) から直接作成することができます 2017 年にBiognosysは DIAデータ (directdia) によって擬似的な第 3のライブラリーを生成する手法を導入しました スペクトルライブラリーのクオリティは 結果のクオリティに影響するため 非常に重要です Hybrid Library 優れたライブラリーの主な基準 深度 : DIAデータは ライブラリーに含まれているペプチドのみを同定することができます より大きなライブラリーはより多くのペプチドの同定を可能にし より多くのタンパク質が同定されます 精度 : スペクトルライブラリーの保持時間とフラグメント強度は実際のDIAデータと一致する方がより正確にペプチドを同定できます 精度はライブラリーの内容に関係し 癌組織ライブラリーで血漿タンパク質を探索しても すべての可能性のある血漿タンパク質を同定することはできません 課題 :3つのライブラリーそれぞれが異なる特性を持ちます project specific libraryは非常に精度が高いですが 深いライブラリーを生成するための測定時間が実現できない場合があるため 深度には限りがあります さらに これらのライブラリーは 一般的に プールされたサンプルまたは個々のサンプルで作成されます したがって 少数のサンプルにのみ存在するタンパク質は 見逃される場合があります これは 特に生物学的分散が大きいサンプルセットの場合に当てはまります resource libraryは深度が高いですが 精度はそれほど高くありません ライブラリー作成に使用したサンプルが実際に解析されるサンプルと全く同じではない場合 それは精度を限定してしまい 関連するタンパク質を見逃す可能性があります また 異なるサンプル調製方法 ( 消化時間 抽出バッファーの違いなど ) は 大きな resource libraryにもかかわらず 3
調製特異的なペプチドを見逃してしまい 同定されるべきペプチドが同定されない可能性があります DirectDIAメソッドは 各単一サンプルから精度の高いライブラリーを作成します しかし 複数の分画されたサンプルから生成されるproject specific libraryと比較すると 深度は低くなります 解決策 : ハイブリッドライブラリーは 深度も精度も共に高く 最良の結果へと導きます Spectronaut Pulsar Xは すべてのライブラリータイプの長所を組み合わせ その制限を回避する新しいライブラリー生成方法をサポートしています 根本的な概念は コアプロテオームをresource library( またはproject specific library) でカバーし サンプル特異的なプロテオームをdirectDIAの同定でカバーすることでライブラリーを補完します Spectronaut Pulsar Xは 独立した両方のライブラリーを正確に統計処理することにより 最良の結果を導きます 我々はこの手法をハイブリッドライブラリーと呼んでいます ハイブリッドライブラリー技術の開発では 定量可能なタンパク質の数を最大限にすることが目的です また resource libraryと directdiaを組み合わせて使用する場合 ライブラリー生成のためのサンプル測定が必要ないため 実験的な作業にかかるコストも減少します 肺癌データセットにおけるハイブリッドライブラリーの性能 ハイブリッドライブラリワークフローの機能を紹介するために Thermo Scientific Q Exactive HF-Xを使用してDIAモードで取得した 12 検体 ( 癌性および健康な組織 ) のサンプルセットを解析しました 深度の高いproject specific libraryを作成するために プールされたサンプルフラクション (30ラン) をDDAモードで取得しました データは project specific library resource library そしてresource libraryとその時作成されたdiaベースのライブラリー (directdia) を組み合わせたハイブリッドライブラリーを使って解析されました 結果として ハイブリッドライブラリーの使用は 同定されたペプチドプレカーサーおよびタンパク質の数が この実験において他の2つのアプローチよりも優れていることを示しています Figure: DIAワークフローを使用して 肺癌組織で同定されたペプチドプレカーサーおよびタンパク質 Cumulative: すべてのランで同定されたユニークなペプチドプレカーサーまたはタンパク質の数 Average: 1 回のランで同定されたペプチドプレカーサーまたはタンパク質の平均 Complete: 毎ラン同定されたペプチドプレカーサーまたはタンパク質の数 Reference: Kim MS et al. A draft map of the human proteome. Nature. 2014 May;509(7502);575-81. 4
Library perspective: DDA DIAおよびハイブリッドライブラリーのためにBiognosys 独自のデータベース検索エンジンPulsarを備えています さらに MaxQuant Mascot Proteome Discoverer ProteinPilot Progenesis QIなどの外部検索エンジンもサポートしています 新たに 以前の検索に使用したランファイルから高速でスペクトルライブラリーを生成することができる Search Archivesが実装されました Analysis perspective: DIA データ解析は directdia またはHRM ワークフローのいずれかで実行されます 生データは 解析中または解析後に様々な可視化オプションで確認することができます (XIC(Extracted Ion Chromatogram), cross-run intensity alignments など ) 5
QC perspective: 統合されたクオリティーコントロールは サンプル中に添加するキャリブレーションペプチドに基づいています クロマトグラフィー マス スペクトルメーター データ解析結果は 様々なパフォーマンス インジケーターを使ってモニターできます Report perspective: データのエクスポートはとても柔軟で ユーザーのニーズに合わせて 列を指定してエクスポートすることができます スプレットシートで情報を保存した後 その結果をユーザー自身の統計ワークフローやパスウェイ解析に組み込むことができます Post-analysis perspective: 発現に差のあったタンパク質は 解析後にすぐに表示されます Spectronaut Pulsar Xは ユーザーの実験に設定されたすべての条件について t- 検定ペアワイズ比較を実行します 6
Spectronaut Pulsar X には 30 日間使用できるデモ版があ ります ご希望の方は biosupport@filgen.jp までお問い合わ せください 製造元 Biognosys AG Wagistrasse 21 / 8952 Schlieren Switzerland TEL:+(41) 44 738 2040 URL:www.biognosys.com 代理店輸入販売元フィルジェン株式会社バイオサイエンス部 459-8011 愛知県名古屋市緑区定納山一丁目 409 番地 TEL:052-624-4388 FAX:052-624-4389 e-mail:biosupport@filgen.jp URL:http://www.filgen.jp (18JUL)