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ああすふじた
4 years ago
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2 プロテオームプロファイリング ( タンパク質組成分析 ) は組織血液などのペプチドやタンパク質の検出を目指す技術です液体クロマトグラフィータンデム質量分析法に基づきタンパク質の混合物を質量分析法で同定しデータ解析が行われますトランスクリプトーム解析とともに生体システムにおけるダイナミックな変化を網羅的に解析できます高解像度と高精度 : 解像度は 10 5 超精度は 1ppm 未満高同定率 :3,000 種類以上のタンパク質を同定可能無制限 : 理論的にはどんな生物種も解析可能タンパク質抽出 SDS-PAGE 酵素カット酵素カット LC-MS/MS MS と MS/MS スペクトルピークのリストデータベースでの捜索品質管理とデータのフィルタリング信頼できるタンパク質の同定データの統計と品質管理タンパク質の同定タンパク質の機能アノテーションタンパク質の GO 解析タンパク質の COG 解析タンパク質の pathway 解析 HPLC

3 データの統計と品質管理タンパク質同定の結果タンパク質の GO 解析タンパク質の COG 解析タンパク質の代謝経路解析 1. サンプルサンプル量タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :SDS-PAGE-LC-MS/MS SCX-HPLC -LC-MS/MS 3. :Triple TOF TM 5600 LTQ OrbitrapVelos TM 納品データ例 Query number # of query Charge Pdeptide mass Ions score 1 Homology score Identity score Evalue Peptide sequence KTVTAM- DVVYALK Protein ID Modification Retention time IPI MLTELEK IPI % 2 約 40 営業日 % % % % % Charge # of fragmentions 7e+05 6e+05 5e+05 4e+05 3e+05 2e+05 1e+05 0e+00 Fragment lons Mass delta/da Oxidation (M)@6 Oxidation (M)@ significant not significant

4 定量プロテオミクスはプロテオームを構成するすべてのタンパク質を精確に同定した上でタンパク質の差異発現をスクリーニングすることができ細胞生理や細胞病理の機能解明に利用されています研究方法は安定同位体標識法 (itraq SILAC ICAT 他 ) と非標識定量法 (label-free) があります柔軟性 :label-free と itraq の二つの定量法を柔軟に選択可能高解像度と高精度 :LTQ Orbitrap Velos TM プラットフォームでは解像度は 10 5 超精度は 1ppm 未満ハイスループット :itraq では 8 サンプルを 1 ランで label-free では大規模サンプルを同時に解析可能タンパク質抽出酵素カット itraq 標識標識なし HPLC 分離 LC-MS/MS MS と MS/MS スペクトルデータベースでの捜索品質管理とデータのフィルタリングタンパク質の定量タンパク質の機能アノテーション Differentially expressed proteins GO 解析 (DEPs) のスクリーニング COG 解析 DEPs のクラスター分析 Pathway 解析 DEPs の GO 解析 DEPs の pathway enrichment 解析

5 1. データ統計タンパク質同定の結果タンパク質定量の結果タンパク質の GO 解析タンパク質の COG 解析タンパク質の代謝経路解析異なるタンパク質の GO 解析異なるタンパク質の代謝経路解析マルチサンプルの発現パターンのクラスター分析 2. itraq プロテオミクスとトランスクリプトームデータの比較分析プロテオミクスとトランスクリプトーム解析結果の比較分析異なるタンパク質と遺伝子の比較分析プロテオミクスとトランスクリプトームのクラスター分析タンパク質相互作用ネットワークの解析お客様のご要望に合わせデータ解析をカスタマイズします 1. サンプルサンプル量タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :itraq Label-free 3. :Triple TOF TM 5600 LTQ OrbitrapVelos TM 納品データ例 0% 2% 3% 70%-100%(0) 7% 60%-70%(0) 7% 50%-60%(2) 40%-50%(9) 45% 30%-40%19) 11% 20%-30%(41) 15%-20%(39) 10%-15%(63) 5%-10%(134) 24% 0%-5%(252) 1 itraq: 約 40 営業日 Label-free: 約 60 営業日 Number of peptides Peptide Ratios(117/119)Distribution Peptide ratios

6 ターゲットプロテオミクスでは多重反応モニタリング (MRM:Multiple Reaction Monitoring) 技術に基づき特別な機能を持つタンパク質を相対定量と絶対定量の二つの方法で解析できますターゲットプロテオミクスは特異性が高く高感度な質量分析法として低濃度タンパク質の同定翻訳後修飾されたタンパク質の同定バイオマーカーの検証ファミリータンパク質とオルソロガスタンパク質の差異検出などの研究で利用されています高解像度 : オルソロガスタンパク質の高感度検出が可能ハイスループット : 数十個のタンパク質を同時に定量可能高再現性 :MRM 技術に基づくターゲットプロテオミクスの結果は異なる実験室で再現可能短周期 : 抗体作成からの解析では半年必要だったものがターゲットプロテオミクスでは 10 週で解析可能広検出範囲 : 検出範囲は 1,000 ~ 10 万 MRM 技術開発サンプル解析タンパク質ターゲットタンパク質の情報 MRM トランジションのデザイン MRM トランジションの最適化 1. ターゲットタンパク質の選定トランジションの予測ターゲットタンパク質の同定ターゲットタンパク質の定量 2. お客様のご要望に合わせデータ解析をカスタマイズしますトリプシン消化 LC-MRM 生データターゲットタンパク質の同定ターゲットタンパク質の定量

1. サンプルサンプル量タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :MRM 3. :QTRAP 5500 納品データ例 4000 y11-1172.5906+ y7-758.4155+ Predicted 24.1 3000 Intensity 2000 1000 約 60 営業日 Measured Time 24.6 24.

7 1. サンプルサンプル量タンパク質 500µg ( 濃度 1mg/mL) 2. :MRM 3. :QTRAP 5500 納品データ例 4000 y y Predicted Intensity 約 60 営業日 Measured Time y y Retention Time 1 sample1 y y Replicate y sample

8 リン酸化プロテオーム解析ではタンパク質のリン酸化修飾情報を網羅的に解析できますリン酸化部位の識別と機能分析はもちろんのこと itraq や Label-free などの相対定量法を併用してリン酸化されたタンパク質の解析もできますこの技術はリン酸化部位の同定率を高めるだけでなく細胞内シグナル伝達ネットワーク中のリン酸化タンパク質も迅速に解析できますリン酸化プロテオーム解析は既にシグナル伝達ネットワークの研究疾患研究環境応答などの研究領域で利用されています高解像度 : リン酸化されたアミノ酸部位を精確に同定可能高効率 :1 ランで何千ヶ所ものリン酸化部位を同定可能ハイスループット :itraq では 8 サンプルのリン酸化タンパク質を同時に同定可能複数の断片化モデル :Collision-induced dissociation (CID) electron-transfer dissociation (ETD) Higher-energy C-trap dissociation (HCD) などのフラグメンテーションモデルを提供複数のスキャンモデル :MS2 や MS3 などのスキャンモデルを提供タンパク質抽出酵素カットリン酸化タンパク質の濃縮 LC-ESI-MS/MS ピークのリストデータベースでの捜索品質管理とデータのフィルタリング信頼できるタンパク質の同定タンパク質の機能アノテーションリン酸化タンパク質の Enrichment 解析タンパク質 GO 解析 GO Enrichment 解析タンパク質 COG 解析 Pathway Enrichment 解析タンパク質 Pathway 解析

1. データベースの検索データベース検索結果の統計解析データベース検索結果の品質管理リン酸化タンパク質の検出と同定タンパク質の GO COG 代謝経路解析リン酸化タンパク質の GO Pathway Enrichment 解析 2. お客様のご要望に合わせタンパク質相互作用ネットワークの解析等データ解析をカスタマイズします 1.

9 1. データベースの検索データベース検索結果の統計解析データベース検索結果の品質管理リン酸化タンパク質の検出と同定タンパク質の GO COG 代謝経路解析リン酸化タンパク質の GO Pathway Enrichment 解析 2. お客様のご要望に合わせタンパク質相互作用ネットワークの解析等データ解析をカスタマイズします 1. サンプルサンプル量タンパク質 5mg ( 濃度 1mg/mL) 2. :TiO 2 Enrichment LC-ESI-MS/MS 3. :LTQ Orbitrap Velos TM Triple TOF TM 5600 Number of proteins The number of peptides 1 Mascot Ion Score 約 60 営業日 Mass delta (ppm) 2 Number of Peptides Peptide Length

10 タンパク質同定とは MALDI-TOF/TOF または LC-MS/MS 質量分析法を用いて電気泳動したゲルから切り出したタンパク質スポットやバンドを免疫沈降 (IP:immunoprecipitation) や精製してから同定を行う技術ですデータ解析はタンパク質同定の結果とデータ解析の結果 (GO と pathway 解析 ) を含みます高解像度と高精度 :LTQ Orbitrap Velos TM プラットフォームでは解像度は 10 5 超精度は 1ppm 未満高速スキャニング :Ultrafle Xtreme プラットフォーム (TOF と TOF/TOF モード ) のスピードは 1KHz 以上高感度 : 低濃度のタンパク質に対して優れた検出効果がありナノグラムレベルでも検出可能タンパク質抽出酵素カット MALDI-TOF/TOF LC-MS/MS MS/MS ピークのリストデータベースでの捜索信頼できるタンパク質の同定タンパク質同定の結果タンパク質の GO 解析タンパク質の COG 解析タンパク質の Pathway 解析データの統計と品質管理タンパク質同定の結果タンパク質の GO 解析 (LC-MS/MS 解析のみ ) タンパク質の COG 解析 (LC-MS/MS 解析のみ ) タンパク質の Pathway 代謝経路解析 (LC-MS/MS 解析のみ )

1. SDS-PAGE スライス 2D-PAGE ゲルスポット : 1.5mm 3 クマシーブルー染色や銀染色によってゲルを可視化させ電気泳動後一週間以内に弊社まで送付してください銀染色の場合グルタルアルデヒドを混入しないように注意してください 2. :LC-MS/MS MALDI-TOF/TOF 3.

11 1. SDS-PAGE スライス 2D-PAGE ゲルスポット : 1.5mm 3 クマシーブルー染色や銀染色によってゲルを可視化させ電気泳動後一週間以内に弊社まで送付してください銀染色の場合グルタルアルデヒドを混入しないように注意してください 2. :LC-MS/MS MALDI-TOF/TOF 3. MALDI TOF/TOF TM LTQ Orbitrap Velos TM Triple TOF TM 5600 納品データ例 IDs 90.00% Protein ID:gi/ Sequence Coverage:28.82% Matched peptides shown in Bold Red: 2 VGFKAGVKDY KLTYYTPDYE TKDTDILAAF RVTPQPGVPP EEAGAAVAAE SSTGTWTTVW TDGLTSLDRY KGRCYHIEPV AGEESQFIAY VAYPLDLFEE GSVTNMFTSI VGNVFGFKAL RALRLEDLRI PPAYVKTFQG PPHGIQVERD KLNKYGRPLL GCTIKPKLGL SAKNYGRAVY ECLRGGLDFT KDDENVNSQP FMRWRDRFLF CAEAIYKAQA ETGEIKGHYL NATAGTNEDM MKRAVFAREL ゲルスポット : 約 15 営業日ゲルバンド : 約 20 営業日 1 None IDs 10.00% Intensity M/Z 2 PMF

分析報告書の例分析課題名 : LC-MS/MS を用いたタンパク質バンドの同定弊社分析コード : P ( 株 ) メディカルプロテオスコープ分析報告書分析情報分析課題名 LC-MS/MS を用いたタンパク質バンドの同定弊社分析コード P* 分析の目的 SDS ゲルから切り

分析報告書の例分析課題名 : LC-MS/MS を用いたタンパク質バンドの同定弊社分析コード : P**** ( 株 ) メディカルプロテオスコープ分析報告書分析情報分析課題名 LC-MS/MS を用いたタンパク質バンドの同定弊社分析コード P***** 分析の目的 SDS ゲルから切り分析報告書分析情報分析課題名 LC-MS/MS を用いたタンパク質バンドの同定弊社分析コード P***** 分析の目的 SDS ゲルから切り出した染色バンドに含まれるタンパク質を同定する報告書提出日 20** 年 * 月 ** 日分析担当者 - 分析委託者機関名 - ご担当者名 - ご所属 - ご所属先住所 - - 分析施設 236-0004 横浜市金沢区福浦 3-9 横浜市立大学先端医科学研究センター産学連携ラボ内