多能性幹細胞を利用した毒性の判定方法 教授 森田隆 准教授 吉田佳世 ( 大阪市立大学大学院医学研究科遺伝子制御学 )
これまでの問題点 化学物質の人体および環境に及ぼす影響については 迅速にその評価を行うことが社会的に要請されている 一方 マウスやラットなど動物を用いた実験は必要ではあるが 動物愛護や費用 時間的な問題がある そこで 哺乳動物細胞を用いたリスク評価系の開発が望まれる 我々は DNA 修復遺伝子の欠損したES 細胞を用いて 化学物質に対する生存率や染色体異常を定量的に測定することにより 化学物質の種々の毒性を測るリスク評価系ができると考え その開発を目的とした 防御遺伝子等の改変 種々の毒性の解析 マウス万能細胞のコロニー
化学物質と防御遺伝子 我々は 遺伝毒性のある発がん物質に対する毒性も DNA 損傷に対する DNA 修復作用 ( 右図 緑 ) により軽減すると考えた そこで DNA 修復遺伝子が欠損したマウスES 細胞を用いれば 化学物質に対する感受性が増すと考え その結果から化学物質と遺伝子の防御作用を推察することができると考えた DNA 損傷 発がん作用 DNA 修復能 閾値 化学物質濃度
DNA 二重鎖切断の修復 放射線や化学物質によってDNAが切断されると付近のヒストンH2AXがリン酸化される それをきっかけに NBS, MRE11, Rad50 等の分子が集合する その後 Ku70,Ku80, DNAPKcsなど非相同末端結合により修復するタンパク あるいは相同組換えにより修復するRad51, 52, 54タンパクなどがDNA 切断を修復する 化学物質による DNA 二重鎖切断 ATM P P ヒストン H2AX のリン酸化 H2AX H2AX P Ku80 Ku80 P H2AX H2AX Ku70 Ku70 P H2AX Rad52 Rad51 P H2AX Rad54 非相同末端結合による修復 相同組換え修復
DNA 修復遺伝子欠損と化学物質の細胞毒性 そこで 我々は 化学物質に対する防御機構に関する遺伝子 例えば ヒストンH2AXのようなDNA 修復遺伝子 p53のような細胞周期調節遺伝子などを欠損したes 細胞を作製し これらの細胞に種々な濃度の発がん性のある化学物質を添加して培養することにより 増殖をコロニー形成能で解析した
DNA 修復遺伝子欠損と化学物質の細胞毒性 化学物質濃度 0.000001 0.0001 0.01 1 10 化学物質濃度 0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 細胞の生存率 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001 MNU H2AX+/+ MNU H2AX-/- MMS H2AX+/+ MMS H2AX-/- DEN H2AX+/+ 細胞の生存率 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 MNU P53+/+ MNU P53-/- MMS P53+/+ MMS P53-/- DEN P53+/+ 0.000001 DEN H2AX-/- 0.00001 DEN P53-/-
化学物質の細胞毒性の実験結果 (1) マウスES 細胞は 化学物質により細胞毒性が異なる (2) さらに ヒストンH2AX 遺伝子の欠損により 感受性の変わるMNU,MMS と変わらないDENがあり それらの作用に違いがあることが示唆された (3) がん抑制遺伝子であるp53 遺伝子欠損 ES 細胞についても化学物質による毒性を比較した結果 MNUでは感受性が増大したのに対し MMSでは変化せずDENでは逆に感受性が減少し ヒストンH2AX 欠損とは異なるパターンを示した ES 細胞が化学物質の毒性を評価できると同時に その作用と防御遺伝子との関係の解明に利用できることを明らかにした メチルニトロソウレア (MNU) メチルメタンスルホン酸 (MMS) ジエチルニトロサミン (DEN)
ES 細胞を用いる理由 マウス ES 細胞には リスク評価細胞として以下のような利点がある (1) 哺乳動物であるマウス ヒト由来の ES 細胞が利用できる (2) 染色体が正常であり 外来遺伝子の導入による影響を考慮する必要がなく 染色体への影響, 発癌性などを正 確に解析できる (2) 遺伝子を改変することが可能であり 化学物質による作用と遺伝子の関係を解析でき 化学物質の作用機序と防 御遺伝子 解毒遺伝子との関係を推定できる (3) マウス ES 細胞を用いて 受精卵にマイクロインジェクションし 個体発生させることができるので化学物質に曝露 した ES 細胞の発生への影響を解析できる (4) 培養細胞として扱えるので 増殖性など 96 穴プレートなどを用いて大量 安価に解析ができる (5)ES 細胞を人工的に分化させることにより 神経系など 特異な細胞への影響を解析できる可能性がある (6)ES 細胞はマウスの受精卵から樹立することができるので 他の培養細胞株のような継世代的な変化はほとんど 考えられず 常に標準となる安定な ES 細胞を用意することができる (7) 現在 全遺伝子ノックアウトマウスの作成プロジェクトが完成しつつあり そのようなマウスの共同利用により 遺 伝子改変 ES 細胞のパネルの作成が可能である 万能細胞 ES 細胞 (+/+) 防御遺伝子 (-/ -) マイクロインジェクション 子宮移植 細胞毒性変異原性 ( 染色体異常 ) 胚盤胞形成ハッチング能 (in vitro) 出産帝王切開吸収胚 発生生育生殖性
染色体異常の解析 染色体が正常であり 外来遺伝子の導入による影響を考慮する必要がなく 転座 断裂など化学物質による染色体異常を定量的に解析できる
発生毒性 催奇性 生殖毒性の解析 マウスES 細胞は下図のように 正常胚にマイクロインジェクションすることにより 正常に発生する (ES 細胞はGFP 遺伝子を導入することで緑色に光る ) 胚盤胞まではin vitroで発生させることができるので 顕微鏡下で発生を追跡し 発生毒性を調べることができるかどうか検討する この解析には ヒトES 細胞は倫理的な問題から使用できないので マウスES 細胞で行う ES 細胞 マイクロインジェクション 桑実胚 胚盤胞 仮母への移植 による出産
子宮へ移植と発生毒性 催奇性の解析 マウスES 細胞を含む胚は 偽妊娠マウスの子宮に移植することにより その後の発生 出産を追跡できる 下図は申請者らが X 線照射したES 細胞について行った実験である 照射線量にしたがって 正常な出産が減少した 逆に帝王切開が必要なマウスや妊娠していない ( 着床ができない ) マウスが増加した 帝王切開した場合 吸収胚や奇形が認められた このように マウスES 細胞を導入した胚を偽妊娠マウスの子宮に移植することにより化学物質についても ES 細胞の発生 催奇性への影響を同様に解析できると考えられる 14 12 10 8 6 4 正常出産 帝王切開 妊娠なし 正常出産帝王切開妊娠なし 2 2 0 0 0 1 3 5 X 線照射線量 (Gy)
万能細胞を用いた化学物質の毒性の解析方法 多くの化学物質をハイスループットな方法を用いて ES 細胞でスクリーニングし 限られた化学物質についてのみ動物実験を行う評価の流れを示す 野生型 ES 細胞 代謝系 (-/ -) ES 細胞 修復系 (-/ -) ES 細胞 酸化系 ( - / - ) ES 細胞 化学物質 ( 例 C) 細胞増殖 濃度 細胞死 細胞毒性 MTT アッセイ 物質 A 物質 B 物質 C 物質 D 物質 E 物質 F 物質 G 物質 H 物質 I 物質 J 野生型 代謝系 修復系 酸化系
濃度万能細胞を用いた化学物質の毒性の解析方法細胞死 細胞毒性の見られた化学物質についてのみ 染色体 発生への影響解析を行い 細胞毒性 MTT アッセイ 動物実験をできるだけ少なくするよう努める 物質 A 物質 B 物質 C 物質 D 物質 E 物質 F 物質 G 物質 H 物質 I 物質 J 野生型 代謝系 修復系 酸化系 染色体異常 染色体正常 I n vitro 発生 催奇性 ES 細胞 マイクロインジェクション 桑実胚 胚盤胞 仮母への移植 による出産 動物実験 発がん性 神経毒性 免疫毒性 遺伝子との関係
特許出願 特許出願 特許番号 : 特願 2012-110115 発明者 : 森田隆 吉田佳世発明の名称 : 多能性幹細胞を利用した毒性リスクの判定方法出願人 : 大阪市立大学出願日 : 平成 24 年 5 月 11 日
社会への貢献 (1)ES 細胞を用いたリスク評価は 動物実験をできるだけ回避できると期待され 動物愛護の面から優れていると考えられる また 動物実験に比べ コストがはるかに少なく 迅速であることから 企業が予め化学物質の有害性について評価し 予測することにより 安全な製品を開発し 社会に送ることができると考えられ 経済的 社会的効果は大きい (2) 種々の遺伝子欠損したES 細胞パネルの作製と解析により 化学物質などに対する細胞の反応についての学術的な知見が得られ 化学物質に対する過敏反応など疾患の診断 治療など医療に応用できる可能性がある (3)ES 細胞を用いたリスク評価により 数多くの化学物質の中から細胞毒性を持つ物質を同定できる その中には 逆に 抗がん剤として使用できる物質が含まれている可能性があり 創薬の面からも有用である (4) この系は原子力関連や宇宙放射線などの影響に関する評価にも利用できる 実際に我々は本年 12 月 15 日予定で 国際宇宙ステーションにマウスES 細胞を打ち上げ 細胞への影響を解析する予定である
お問い合わせ先 大阪市立大学産学連携コーディネーター井上孝志 TEL 06-6605 -3550 FAX 06-6605 - 2058 e-mail: tinoue@ado.osaka-cu.ac.jp