1 皮膚細胞が乳酸菌を取り込むと 多能性細胞になる 熊本大学大学院生命科学研究部 准教授太田訓正
2 幹細胞とは 人間では一つの受精卵から 200 種類以上 約六〇兆個の細胞が作られる 多種多様な細胞にも もとをたどると親の細胞に行き当たり それを幹細胞 (stem cell) と呼び 体性幹細胞 ES 細胞 ips 細胞がある
3 従来の幹細胞の特徴とその問題点 細胞体性幹細胞 ES 細胞 ips 細胞 作製法体中に存在胚を壊して作製遺伝子を導入して作製 移植時の拒絶 自己細胞を利用すれ ば拒絶が起きない 移植の際に免疫拒絶 の可能性がある 自己細胞を利用するの で拒絶が起きない? 腫瘍化の恐れ可能性は低い可能性がある可能性がある
4 新技術の特徴 従来技術との比較 従来からの問題点であった 腫瘍形成の危険がない多能 性細胞を作製することに成功した 従来は生きた乳酸菌を用いたことで限られていたが 乳酸菌由来リプログラム因子を用いれば 大量に多能性細胞を作製することが可能となる 本技術の適用により 乳酸菌は無限に増殖させることができるため コストを大幅に削減できることが期待される
真核細胞誕生のモデル eubacteria ( 真正細菌 ) 古細菌真正細菌 ( 乳酸菌など ) archaebacteria ( 古細菌 ) eucaryotes ( 真核細胞 ) 遺伝子 35 億年前 真正細菌の古細菌への感染 共生関係 Endosymbiotic theory (Margulis L., 1970) 真正細菌の遺伝子移動 核 核の出現 DNA の増幅 ミトコンドリア 真核細胞の誕生 20 億年前 (Science ZERO) 5
6 乳酸菌 [Lactic Acid Bacteria (LAB)] のバックグラウンド 私達のからだの細胞数 : 60 兆個 (6 x 10 13 ) 腸における腸内細菌数 : 1,000 兆個 (1 x 10 15 ) 1,000 種類以上の腸内細菌が棲息. 1857 年 パスツール博士が世界で最初に乳酸菌を発見 現在までに 約 280 種類の乳酸菌が同定されている Lactobacillus Bifidobacterium Lactococcus Streptococcus Enterococcus
7 ロシアの生物学者イリヤ メチニコフ (1845-1916 年 ) ヨーグルト不老長寿説 老化とは 腸内細菌の生成する腐敗物質による自家中毒 ヨーグルトに含まれる乳酸菌で腸内環境を改善すれば良い インフルエンザ ピロリ菌の撃退 癌 アレルギー 睡眠 ダイエット etc 腸内細菌は現代医療のトップランナー (PNAS 2011) 乳酸菌が細胞に直接作用し どのような影響を持つかはほとんど 乳酸菌と細胞の研究は価値有り! 研究されていない
バクテリアが宿主細胞の遺伝子発現を制御する 8
乳酸菌による細胞塊形成 ヒト皮膚細胞 (Cell Applications 社 ) 乳酸菌 0.1% Trypsin 1mM EDTA 皮膚細胞用培養液 (Cell Applications 社 ) (5 x 10 5 / 2ml) 3 cm シャーレ アルカリフォスファターゼ染色 300 µm ( 直径 : 100 ~ 500 µm ~30 spheres / 5 x 10 5 ) 9
取り込まれた乳酸菌はヒト皮膚細胞の細胞質に局在する 核 ミトコンドリア 小胞体 16S ribosomal RNA vacuole 細胞膜細胞間隙乳酸菌 caveolar LAB-incorporated (LAB-in) cells 抗ー細胞壁抗体 DAPI 10
11 LAB-in cells は自己増殖を持たない 解離 Dissociation Medium for ES cells Trypsin, 10 mg/ml Collagenase IV, KSR, 1M CaCl 2 37, 5~20 min ES 細胞や ips 細胞は無限の増殖能を持つ腫瘍化?
12 LAB-in cells の多能性マーカー発現 ICC RT-PCR Quantative-PCR LAB-in ips LAB-in ips LAB-in ips
シャーレ内における細胞分化誘導 (1) 2 週間 2 週間 α-fetoprotein Tuj1 浮遊状態 DMEM/F12 containing 1% FCS 5 ng/ml basic FGF α-fetoprotein: ( 内胚葉 ) Tuj1: ( 外胚葉 ) vimentin: ( 外胚葉 ) desmin: ( 中胚葉 ) vimentin desmin 100µm 13
14 シャーレ内における細胞分化誘導 (2) 2 週間 2 週間 接着状態 (laminin+pll) DMEM/F12 containing 1% FCS 5 ng/ml basic FGF α-sma: ( 中胚葉 ) Desmin: ( 中胚葉 ) Tuj1: ( 外胚葉 ) GFAP: ( 外胚葉 )
シャーレ内における細胞分化誘導 (3) 2 週間 3 週間 adi ost cho 脂肪細胞 骨細胞 軟骨細胞 LAB-in cells clusters were cultured for 3 weeks in STEMPRO Adipogenesis, Chondrogenesis, or Osteogenesis Differentiation Medium (GIBCO). 脂肪細胞 : Oil Red O 染色骨細胞 : Alizarin Red 染色 軟骨細胞 : Alcian Blue 染色 15
16 LAB-in cells を移植しても腫瘍は形成されない 免疫不全マウス精巣 3 ヶ月後 解析 (5 x 10 5 / 20 µl) control LAB-in cells LAB-in cells control ES 細胞や ips 細胞は腫瘍を形成
17 LAB-in cells の生体内における細胞分化誘導 α-fetoprotein: ( 内胚葉 ) NF: ( 外胚葉 ) α-sma: ( 中胚葉 ) LAB-in cells は in vivo & in vitro において 三胚葉由来の細胞に分化できる
遺伝子発現プロファイルの比較 (A) (B) NANOG x7.6 ヒト皮膚細胞 & ヒト皮膚細胞 + 乳酸菌 c-myc x1.7 OCT3/4 x2.9 4,099 遺伝子 > 2 倍 3,481 遺伝子 < 2 倍 ヒト皮膚細胞 & ヒト皮膚細胞 + 乳酸菌 125 遺伝子 > 30 倍 156 遺伝子 < 30 倍 KLF4 x1.0 SOX2 x2.9 25,909 遺伝子 Whole Human Genome Microarray 4 x 44K (Agilent) 多能性に関わる 37 遺伝子 18
LAB-in cells では HOX 遺伝子の発現が劇的に減少する 1 no ProbeName UniGeneID GeneSymbol GeneName Description Homo sapiens homeobox C8 (HOXC8), 1 A_24_P124558 HOXC8 Hs.664500 homeobox C8 mrna [NM_022658] Homo sapiens homeobox A9 (HOXA9), 2 A_23_P500998 HOXA9 Hs.659350 homeobox A9 mrna [NM_152739] Fold change Regulation [Bala-HGF]vs[C-HGF] [Bala-HGF]vs[C-HGF] 594.18225 down 592.35516 down HOXC8 : 594 倍 156 遺伝子 < 30 倍 3 A_23_P70968 HOXA7 Hs.660918 homeobox A7 Homo sapiens homeobox A7 (HOXA7), mrna [NM_006896] 547.446 down 4 A_23_P363316 HOXB5 Hs.654456 homeobox B5 5 A_23_P66682 HOXB6 Hs.98428 homeobox B6 6 A_33_P3300965 HOXC6 Hs.549040 homeobox C6 Homo sapiens homeobox B5 (HOXB5), mrna [NM_002147] Homo sapiens homeobox B6 (HOXB6), mrna [NM_018952] Homo sapiens homeobox C6 (HOXC6), transcript variant 2, mrna [NM_153693] 489.89343 down 385.91574 down 247.46118 down 発生に関わる遺伝子 :43 遺伝子 7 A_24_P77904 HOXA10 Hs.110637 homeobox A10 Homo sapiens homeobox A10 (HOXA10), transcript variant 1, mrna [NM_018951] 212.5776 down Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 1, mrna 8 A_23_P7313 SPP1 Hs.313 secreted phosphoprotein 1 170.12749 down [NM_001040058] Homo sapiens TEK tyrosine kinase, 9 A_23_P374695 TEK Hs.89640 TEK tyrosine kinase, endothelial 168.16338 down endothelial (TEK), mrna [NM_000459] Homo sapiens homeobox A11 (HOXA11), 10 A_33_P3264528 HOXA11 Hs.249171 homeobox A11 135.72766 down mrna [NM_005523] Homo sapiens homeobox C4 (HOXC4), 11 A_33_P3300975 HOXC4 Hs.549040 homeobox C4 131.16129 down transcript variant 1, mrna [NM_014620] Homo sapiens cartilage oligomeric matrix 12 A_24_P264943 COMP Hs.1584 cartilage oligomeric matrix protein 126.96592 down protein (COMP), mrna [NM_000095] Homo sapiens homeobox C9 (HOXC9), 13 A_23_P25150 HOXC9 Hs.658823 homeobox C9 122.49983 down mrna [NM_006897] Homo sapiens homeobox C10 (HOXC10), 14 A_24_P218805 HOXC10 Hs.44276 homeobox C10 116.495 down mrna [NM_017409] Homo sapiens homeobox B7 (HOXB7), 15 A_23_P55281 HOXB7 Hs.436181 homeobox B7 98.938225 down mrna [NM_004502] Homo sapiens alpha-fetoprotein (AFP), 16 A_33_P3421243 AFP Hs.518808 alpha-fetoprotein 91.343994 down mrna [NM_001134] Homo sapiens homeobox B8 (HOXB8), 17 A_23_P370588 HOXB8 Hs.514292 homeobox B8 76.56639 down mrna [NM_024016] Homo sapiens cyclin B2 (CCNB2), mrna 18 A_23_P65757 CCNB2 Hs.194698 cyclin B2 71.749176 down [NM_004701] Homo sapiens asp (abnormal spindle) asp (abnormal spindle) homolog, 19 A_33_P3288159 ASPM Hs.121028 homolog, microcephaly associated 71.65447 down microcephaly associated (Drosophila) (Drosophila) (ASPM), mrna [NM_018136] 21/43 遺伝子が HOX 遺伝子 HOX 遺伝子群 cho.6 Homo sapiens insulin-like growth factor 20 A_23_P215634 IGFBP3 Hs.450230 insulin-like growth factor binding protein 3 binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 1, mrna [NM_001013398] Homo sapiens homeobox B3 (HOXB3), 21 A_23_P316511 HOXB3 Hs.654560 homeobox B3 mrna [NM_002146] Homo sapiens asp (abnormal spindle) asp (abnormal spindle) homolog, 22 A_23_P52017 ASPM Hs.121028 homolog, microcephaly associated microcephaly associated (Drosophila) (Drosophila) (ASPM), mrna [NM_018136] Homo sapiens homeobox B2 (HOXB2), 23 A_33_P3271273 HOXB2 Hs.514289 homeobox B2 mrna [NM_002145] Homo sapiens homeobox A4 (HOXA4), 24 A_33_P3377529 HOXA4 Hs.533357 homeobox A4 mrna [NM_002141] Homo sapiens transforming, acidic coiledcoil containing protein 3 (TACC3), mrna transforming, acidic coiled-coil containing 25 A_23_P212844 TACC3 Hs.104019 protein 3 [NM_006342] Homo sapiens integrin, alpha 6 (ITGA6), 26 A_23_P210176 ITGA6 Hs.133397 integrin, alpha 6 transcript variant 2, mrna [NM_000210] Homo sapiens sarcoglycan, gamma (35kDa sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophinassociated glycoprotein) 27 A_23_P423237 SGCG Hs.37167 dystrophin-associated glycoprotein) (SGCG), mrna [NM_000231] Homo sapiens dickkopf homolog 1 28 A_23_P24129 DKK1 Hs.40499 dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) (Xenopus laevis) (DKK1), mrna [NM_012242] Homo sapiens sphingomyelin sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral phosphodiesterase 3, neutral membrane 29 A_23_P163567 SMPD3 Hs.368421 membrane (neutral sphingomyelinase II) (neutral sphingomyelinase II) (SMPD3), mrna [NM_018667] Homo sapiens homeobox B4 (HOXB4), 30 A_24_P416370 HOXB4 Hs.664706 homeobox B4 mrna [NM_024015] 67.36516 down 65.995636 down 65.810745 down 60.374454 down 57.784496 down 53.95437 down 53.341675 down 50.23103 down 49.39177 down 49.283035 down 48.990253 down cho.11 cho.15 cho.2 31 A_33_P3330149 PAX6 Hs.270303 paired box 6 Homo sapiens paired box 6 (PAX6), transcript variant 1, mrna [NM_000280] 46.525337 down 32 A_24_P30557 TBX5 Hs.381715 T-box 5 33 A_23_P146274 STMN2 Hs.521651 stathmin-like 2 34 A_23_P122197 CCNB1 Hs.23960 cyclin B1 35 A_23_P100127 CASC5 Hs.181855 cancer susceptibility candidate 5 heart and neural crest derivatives 36 A_23_P373521 HAND2 Hs.388245 expressed 2 37 A_23_P167159 SCRG1 Hs.7122 stimulator of chondrogenesis 1 Homo sapiens T-box 5 (TBX5), transcript variant 1, mrna [NM_000192] Homo sapiens stathmin-like 2 (STMN2), mrna [NM_007029] Homo sapiens cyclin B1 (CCNB1), mrna [NM_031966] Homo sapiens cancer susceptibility candidate 5 (CASC5), transcript variant 1, mrna [NM_170589] Homo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2), mrna [NM_021973] Homo sapiens stimulator of chondrogenesis 1 (SCRG1), mrna [NM_007281] 45.041744 down 43.262432 down 42.742027 down 42.700485 down 41.600903 down 39.337242 down 38 A_23_P215454 ELN Hs.647061 elastin Homo sapiens elastin (ELN), transcript variant 1, mrna [NM_000501] 37.867306 down 39 A_23_P157136 SCIN Hs.655515 scinderin 40 A_23_P58321 CCNA2 Hs.58974 cyclin A2 Homo sapiens scinderin (SCIN), transcript variant 2, mrna [NM_033128] Homo sapiens cyclin A2 (CCNA2), mrna [NM_001237] 35.781925 down 33.80436 down 43 Homo sapiens homeobox A3 (HOXA3), 41 A_23_P501538 HOXA3 Hs.659337 homeobox A3 33.353687 down transcript variant 2, mrna [NM_153631] Homo sapiens homeobox B2 (HOXB2), 42 A_23_P107283 HOXB2 Hs.514289 homeobox B2 31.19959 down mrna [NM_002145] Homo sapiens keratin 17 (KRT17), mrna [NM_000422] 43 A_23_P96158 KRT17 Hs.2785 keratin 17 乳酸菌を取り込んだ細胞は 位置情報を失い 多能性を獲得する 30.959732 down HOXB2 : 31 倍 19
外胚葉 20 ヒト皮膚細胞 Trypsin EDTA 乳酸菌 内胚葉 中胚葉 (Ohta et al., PLoS ONE 2012) (Cell, 152, 51-67, 2013) ほんまか? ほんまや!
21 乳酸菌由来リプログラム因子による細胞塊形成 ヒト皮膚細胞 0.1% Trypsin 1mM EDTA 乳酸菌由来リプログラム因子? 皮膚細胞用培養液 (5 x 10 5 / 2ml) 500 µm
22 乳酸菌由来因子によるヒト皮膚細胞のリプログラミング (A) 脂肪細胞骨細胞軟骨細胞 (B) (C) (D)
23 乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング 1 肺がん細胞 A549 Trypsin EDTA 乳酸菌由来 リプログラム因子 A549 細胞 2 週間 A549 細胞 + 乳酸菌成分 A549 細胞 + 乳酸菌成分 A549 細胞 Oct3/4 Sox2 β-actin Nanog GDF-3 Rex1 ECAT FGF4 p15 p16 ARF Oct3/4 Sox2 β-actin Nanog GDF-3 Rex1 ECAT FGF4 p15 p16 ARF
24 乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング 2 肺がん細胞 A549 Trypsin EDTA 乳酸菌由来 リプログラム因子 A549 細胞 2 週間 A549 細胞 + 乳酸菌成分 脂肪細胞 骨細胞
25 乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング 3 肺がん細胞 乳酸菌由来 A549 Trypsin EDTA リプログラム因子 接着状態 (laminin+pll) DMEM/F12 containing 1% FCS bfgf (5 ng/ml ) DAPI α-fetoprotein merge DAPI Neurofilament merge
26 乳酸菌由来因子による肝がん細胞のリプログラミング 肝がん細胞 HepG2 Trypsin EDTA 乳酸菌由来 リプログラム因子 HepG2 細胞 2 週間 HepG2 細胞 + 乳酸菌成分 脂肪細胞 骨細胞
27 乳酸菌由来因子による乳がん細胞のリプログラミング 乳がん細胞 MCF7 Trypsin EDTA 乳酸菌由来 リプログラム因子 MCF7 細胞 2 週間 MCF7 細胞 + 乳酸菌成分 脂肪細胞 骨細胞
28 想定される用途 本技術の特徴を 癌化しない多能性細胞の作製に適用できる 乳酸菌由来リプログラム因子を癌細胞に作用することにより 細胞増殖が抑えられることから 安全 安心な抗がん剤の開発に展開することも可能と思われる
29 実用化に向けた課題 乳酸菌由来リプログラム因子の同定について HPLC によるピークが同定できたが 個々の分子同定が未解決 細胞塊形成活性
30 企業への期待 未解決の乳酸菌由来リプログラム因子の同定については マススペクトロ解析の技術により克服できると考えている 抗がん剤として 動物試験による評価 ( 毒性試験 有効性 ) の技術を持つ 企業との共同研究を希望 また 癌制御因子の探索を考えている企業には 本乳酸菌由来リプログラム因子の導入が有効と思われる
本技術に関する知的財産権 31
32 産学連携の経歴 2013 年 7 月現在 民間 3 社と共同研究に向けて 研究内容等を検討中
33 お問い合わせ先 熊本大学コーディネーター松本泰彦 TEL 096-342 - 3209 FAX 096-342 - 3239 e-mail y-matsumoto@jimu.kumamoto-u.ac.jp