低分子抗体の高密度配向固定化技術の開発と免疫測定の高感度化 京都工芸繊維大学分子化学系 准教授熊田陽一
タンパク質を固定化した新しい材料設計 ( インタラクティブバイオ界面 ) 生体分子の機能 反応を触媒する力 分子を認識する力 + 様々な材料 有機材料 無機材料 複合材料 固定化 新しいバイオ材料 医療材料 医療診断材料 バイオ電池 抗菌材料 固定化触媒 アフィニティ分離材 エンジニアリングとしての課題 ( 製造コスト 安定性 パフォーマンス ) タンパク質 ( バイオ分子 ) 材料基板
抗原抗体反応を利用した免疫診断 (ELISA) 固定化 Washing Washing リガンド ( 抗体 ) の固定化 Washing 酵素標識抗体の結合 ブロッキング Washing シグナルの検出 検体の結合 PS plate 単位操作的特徴固液間の吸脱着操作物質移動律速平衡 非平衡操作 試薬的特徴抗体の特異性抗体の親和定数 (K a ) 抗体の速度定数 (k on, k off ) 抗体の固定化密度抗体の安定性抗体の生産コスト
従来技術とその問題点 免疫検査には 抗体を固定化した担体 ( プレートやラテックス粒子 ) が用いられているが 抗体の密度が低く 配向が不均一 不適当 担体との接触によって活性が大きく低下する 抗体の製造コストが極めて高い 等の問題があり 慢性的な感度不足と検査コストの高騰を引き起こしている
抗体固定化材料のパフォーマンス パフォーマンス = 密度 X 配向性 X 親和性 X 残存活性 生産コスト 特異性 親和性の高い抗体か? 高密度に固定化できるか? 安定に固定化できるか? 配向はどの程度均一か? 製造コストは安価か? これまで重要視されてきた因子 これらの因子をいかに厳密に制御できるかが研究のカギ 物理吸着 リガンド ( 抗体 ) の固定化 抗体固定化プレート ( 販売価格 :5~10 万円 )
材料親和性ペプチドを導入した単鎖抗体を設計 抗原認識部位 低分子化一本鎖化 診断に必要な部分 単鎖抗体 診断に不必要な部分 タグ導入 完全長抗体 ( 従来の抗体 ) タグ付き単鎖抗体
タグ付き単鎖抗体の高密度配向固定 従来の抗体 残存活性 高 固定化密度 低 生産コスト 高 プラスチック基板 ペプチドタグ 変性 単鎖抗体 ( タグなし ) 残存活性 低 固定化密度 中 生産コスト 低 タグ付き単鎖抗体 残存活性 高 固定化密度 高 生産コスト 低
独自技術 材料親和性ペプチドを利用したタンパク質の固定化 材料親和性ペプチド : 固相表面の構造を認識し高親和的に付着するペプチド PS-tag, PC-tag, PMMA-tag, SiN-tag 特徴 : ペプチドの導入によってタンパク質を高密度に固定化できる ペプチドの導入によってタンパク質の配向性を制御できる ペプチドを介して固定化を行うことで高い生理活性を維持できる 目的タンパク質 親和性ペプチド プラスチック基板
ペプチドタグ融合グルタチオン S トランスフェラーゼ GST のアミノ酸配列 MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEH LYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGD VKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEIS MLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLS KLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFML YDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAI PQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPP KSDLIEGRGIPGNSS PS-tag: RIIIRRIRR PC-tag: NSNFFGLVDGLNFAVQYLGK PMMA-tag: DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK SiN-tag: GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIE N-terminus C-terminus
材料親和性ペプチド融合 GST の調製 GST の DNA Vector 構築 pgex-3x 形質転換 親和性ペプチドの遺伝子 親和性ペプチドの DNA 親和性ペプチド融合 GST 発現 Vector 本培養 37 2 YT 培地 ( 抗生物質 :Amp) IPTG 1mM 発現 精製 GSTrap HP column Elution : 20mM GSH 100mM Tris 30 7h 2 YT 培地 ( 抗生物質 :Amp) 親和性ペプチド融合 GST
PS-tag 融合 GST の高密度配向固定 Quartz Crystal Microbalance (QCM) 0-200 タンパク質が付着すると振動数が減少する PS-tag 融合酵素 vs phi-ps 表面 Frequency, Hz -400-600 -800-1000 -1200 wt-gst GST-PS19-6 -1400 0 250 500 750 1000 1250 1500 Incubation time, sec PS-tag を導入することで迅速かつ高密度な固定化が可能
PC-tag および PMMA-tag 融合 GST の高密度配向固定 Quartz Crystal Microbalance (QCM) タンパク質が付着すると振動数が減少する 0 PC-tag 融合 GST vs PC 表面 0 PMMA-tag 融合 GST vs PMMA 表面 Frequency, Hz -100-200 -300-400 -500 wt-gst GST-PC-MLT8 GST-PC-OMP6 0 250 500 750 1000 1250 1500 Incubation time, sec Frequency, Hz -100-200 -300-400 -500-600 -700 wt-gst GST-PM-OMP25 0 250 500 750 1000 1250 1500 Incubation time, sec PC-tag PMMA-tag を導入することで迅速かつ高密度な固定化が可能
反射干渉分光 (RIfS) センサー センサーチップ 光源分光器光源 分光器 干渉 センサーチップ 相互作用による膜厚変化 干渉 反射率 (%) ボトム 膜厚変化によりボトムがシフト 反射率 (%) λ 波長 (nm) ボトム波長のシフト量を吸着量とみなす 波長 (nm)
RIfS センサチップ上への GST の選択的固定化 2.5 2.0 試料注入 GST-SiN-tag (ELN-V821) 波長シフト量 (nm) 1.5 1.0 20 倍以上高密度な固定化に成功 センサの大幅な高感度化に期待 0.5 wt-gst 0.0 0 100 200 300 400 500 600 時間 ( 秒 ) 本研究で開発された SiN-tag は SiN 基板に対して広い汎用性を有している
材料親和性ペプチドを導入した単鎖抗体を設計 抗原認識部位 低分子化一本鎖化 診断に必要な部分 単鎖抗体 診断に不必要な部分 タグ導入 完全長抗体 ( 従来の抗体 ) タグ付き単鎖抗体
材料親和性ペプチドを導入した様々な低分子化抗体を調製可能 マウス抗体 (150 kda) 低分子化 Fab (50kDa) 汎用性大 結合活性大 scfv (30 kda) 発現が容易 リフォールディングが簡便 ラクダ抗体 (75kDa) 低分子化 VHH (13kDa) 世界最小 熱安定性大
これまでに開発したタグ付き低分子抗体 抗体 由来 対象 Anti-RNase A scfv, Fab, VHH (3) マウス ラクダ モデルタンパク質 Anti-CRP scfv, Fab (4) マウス 炎症マーカー Anti-AAT scfv マウス 肝がんマーカー Anti-CEA scfv, Fab マウス 大腸がんマーカー Anti-CA19-9 scfv マウス 膵がんマーカー Anti-hIgG scfv マウス モデルタンパク質 Anti-hIgA scfv マウス 腎臓病マーカー Anti-TSH scfv, Fab マウス バセドウ病マーカー Anti-TF scfv, Fab (2) マウス 様々なガンのマーカー Anti-AFP scfv, Fab (2) マウス 肝がんマーカー Anti-NP scfv, Fab マウス インフルエンザマーカー Anti-hCG VHH リャマ 妊娠検査マーカー Anti-Lysozyme VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 Anti-Ovalubmin VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 Anti-α-amylase VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 タグ付き低分子抗体の広い汎用性を検証中 今後も検査項目を追加していく予定
低分子抗体の大量生産技術
glucose(g) Yeast extract(g) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 glucose Yeast extract 溶存酸素濃度 (DO 値 ) 24 22 20 18 16 低分子抗体の生産濃度 VHH:1g~10g/L scfv: 1g~4g/L 0 0 20 40 60 80 100 120 培養時間 (H) 14 12 10 8 6 4 2 DO 値 (-) ( 工業生産に十分通用するレベル ) SDS-PAGE の結果 200k 116k 66k 45k 31k 21k 14k MW 精製後 scfv 培養上清
PS-tag 融合単鎖抗体を用いる低コストかつ高感度な医療診断 (CEA ( 大腸がんマーカー ) の検出 ) Absorbance at 450 (ref. 650 nm), - 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 scfv-ps / phi-ps plate Whole Ab/Maxisorp 0 20 40 60 80 100 CEA concentration, ng/ml scfv-ps をリガンドに用いることで 10 倍の高感度化に成功!
サンドイッチ ELISA による CRP の検出 (3 種類の PS-tag 融合 scfv の感度比較 ) scfv 3.0 scfv-ps scfv-(ps) scfv-psii * Whole Ab Absorbance at 405 nm, - 2.0 1.0 0.0 1 10 100 1000 CRP concentration (ng/ml) PS-tag 融合 scfv を用いることで高感度な抗原検出が可能
PS-tag 融合単鎖抗体を用いる低コストかつ高感度な医療診断 (TSH ( 甲状腺刺激ホルモン ) の検出 ) Absorbance at 450 nm (ref. 650 nm), - 4.0 3.0 2.0 1.0 scfv-ps (840) Whole Ab (840) 0.0 0.010 0.1 1 10 100 1000 TSH concentration, ng/ml scfv-ps (phi-ps plate), whole Ab (Maxisorp)
scfv-pm 固定化 PMMA plate による抗原検出 特注 PMMA 製プレート ABS at 450 nm (Ref. 650nm), - 3.0 2.0 1.0 0.0 scfv-d15 ( タグなし ) scfv-pm 0.01 0.1 1 10 100 1000 biotin-rnase, ng/ml PMMA-tag の導入によって単鎖抗体を PMMA プレート上に高密度 高活性に固定化できた
Anti-RNase Fab-PM-His(H+L) 固定化 PMMA plate の評価 2.5 特注 PMMA 製プレート Absorbance, - 2.0 1.5 1.0 0.5 Fab H-PM-His Fab L-PM-His Fab-PM-His (H+L) scfv-pm-his 0.0 0.1 1 10 100 biotin-rnase (ng/ml) Fab H-PM-His および Fab L-PM-His を単独で固定化した場合には抗原検出はできず Fab-PM-His (H+L) ならびに scfv-pm-his を固定化した際に高いシグナルが得られた Anti-RNase Fab-PM-His (H+L) は PMMA プレートへの付着力 と 抗原に対する結合活性 の両方を保持している
ラクダ由来 VHH 固定化 PMMA プレートによるヒト hcg の検出 4.0 3.5 3.0 VHH (45ug/ml) VHH-PMMA-tag (45 ug/ml) 特注 PMMA 製プレート Absorbance at 450-650 nm, - 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.01 0.1 1 10 100 1000 biotin-hcg concn, ng/ml PMMA-tag の導入によってラクダ抗体 (VHH) を PMMA 基板表面に高密度かつ高活性に固定化可能であり 高感度に抗原検出可能である
材料親和性ペプチドのまとめ PS-tag PMMA-tag PC-tag SiN-tag 認識可能な表面 phi-ps (+Tween20) PMMA その他 PC SiN タグ付き GST タグ付き scfv N.D. タグ付き Fab N.D. タグ付き VHH N.D. 固相 Refolding 液相 Refolding (+ polyd-tag) N.D. ( 検討予定 ) N.D. N.D. N.D. ( 検討予定 ) N.D. ( 検討予定 ) N.D. (+ polyd-tag)
新技術の特徴 従来技術との比較 材料親和性ペプチドを融合した低分子抗体によって免疫診断の高感度化が可能 従来はポリスチレンのみの使用に限られていたが 材料親和性ペプチドの種類を変えることで様々な表面に抗体を固定化可能となった 本技術の適用により 10 倍以上の高感度検出ならびに 抗体の製造コストを従来の1/10 以下に削減できる
実用化に向けた課題 現在 当研究室が保有している 15 種類の低分子抗体について本技術の有用性を実証している 一方で 本技術を臨床検査に利用するためには 実用化に見合った優良な低分子抗体を新たに取得する必要がある 長期間の保存安定性について 今後評価 検討していく必要がある
各種リアルタイムバイオセンサへの応用 センサー基板 コーティング 低分子抗体の配向固定 抗原の検出 厚み :20 ~ 50nm シグナル センサー上に固定化した scfv に抗原が結合するとリアルタイムにシグナルが検出される
表面プラズモン共鳴 (SPR) センサーへの応用 SPR センサーの原理 Biacore X-100 phi-ps film Gold Prism センサーチップ (Au 薄膜 ) lazer
高感度 SPFS センサの開発 SPR-SPFS 複合機による超高感度バイオセンサの開発 京都大学再生研 ( 岩田博夫先生 有馬祐介先生 ) との共同研究 (H21-23)
SPFS センサを用いる超高感度医療診断 (a) Adsorbed antibodies (ng/cm 2 ) 400 300 200 100 scfv whole antibody (b) Fluorescence intensity 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 scfv whole antibody 0 10 20 30 40 50 60 Antibody conc. (µg/ml) 抗体の固定化密度 0 1 10 100 CRP conc. (pm) SPFS センサの感度
リアルタイムバイオセンサ上への scfv の固定化 Quartz Crystal Microbalance (QCM) phi-ps film Gold Affinix QN (INITIUM)
scfv 固定化 QCM センサによる抗原検出 0 10 µg/ml BSA F (Hz) -100-200 0.1 µg/ml Antigen 1 µg/ml Antigen -300-400 0 2 4 6 8 10 Incubation time (min) 10 µg/ml Antigen 検出時間 3 分において 0.1 10 µg/ml の抗原溶液の検出が可能であった
反射干渉分光 (RIfS) センサ研究の背景 RIfS センサー開発機 (wacaris) RIfS センサーの原理 SiN Si センサ基板表面 センサチップの材料は窒化ケイ素 (SiN)
SiN-tag 融合 scfv の SiN 基板上への固定化と RIfS センサによる抗原検出 anti-rnase scfv-sin-d15 vs RNase anti-rnase scfv- SiN-D15 RNase antigen anti-rnase scfv-d15 vs RNase anti-rnase scfv-d15 RNase antigen SiN-tag 融合 scfv の方が 10 倍程度高感度な検出が可能であった
企業への期待 あらゆるタンパク質の材料表面における高密度化 配向制御 活性維持に本技術は有効 診断分野に関わらず 独自の材料 バイオ分子を有する企業との共同研究を希望 また 検査薬のみならず バイオセンシングや固定化酵素触媒を開発中の企業 アフィニティ分離分野への展開を考えている企業には 本技術の導入が有効と思われる
本技術に関する知的財産権 (1) 発明名 : 抗体のリフォールディング方法 リフォールディングされた抗体の製造方法 リフォールディングされた抗体 及びこれらの利用出願人 : 京都工芸繊維大学出願番号 : PCT/JP2014/052475 発明名 : 窒化ケイ素 (Si 3 N 4 ) 親和性ペプチド 及びその利用出願人 : 京都工芸繊維大学出願番号 :PCT/JP2013/053290 発明名 : 抗体固定化担体 抗体固定化担体の製造方法および当該抗体固定化担体の利用出願人 : 京都工芸繊維大学 デンカ生研出願番号 :PCT/JP2011/053157
本技術に関する知的財産権 (2) 発明名 : ポリカーボネートおよび / またはポリメタクリル酸メチル親和性ペプチド およびその利用出願人 : 京都工芸繊維大学出願番号 : 特許第 5655254 号 発明名 : 復元されたペプチドの生産方法およびペプチドが固定化された固相の生産方法出願人 : 京都工芸繊維大学 エンプラス出願番号 : 特許第 5582482 号 米国 中国でも権利化済 発明名 : 一本鎖抗体 固相 遺伝子 ベクター及び宿主出願人 : 京都工芸繊維大学 エンプラス出願番号 : 特許第 5582483 号 他 数件
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