The Science of Western Blotting

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いぶきたけはな
7 years ago
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1 メンブレンメーカーだから知っているウェスタンブロッティングのコツラボジャパン事業本部バイオサイエンス営業部間瀬久

2 Contents 1 ウェスタンブロッティングの概要 2 電気泳動 & 転写 3 免疫検出 4 トラブルシューティング 5 吸引ろ過を用いた免疫反応 2

3 ウェスタンブロッティングの概要 3

4 ウェスタンブロッティングの概要サンプル調製電気泳動転写免疫検出タンパク質精製分離濃縮タンパク質の分離分離したタンパク質のブロッティング膜への転写特定のタンパク質の有無を検出化学的サンプル調製 / 細胞オルガネラ溶解液アフィニティビーズ ( アガロース & 磁気 ) 濃縮 / 脱塩電気泳動ゲルローディングバッファーポジティブコントロール分子量マーカー泳動槽ブロッティング装置転写バッファーメンブレンブロッティング用ろ紙タンパク質染色試薬ブロッキング洗浄液 1 次抗体 2 次抗体検出試薬 4

5 ウェスタンブロッティングを成功に導くために - タンパク質のメンブレンへの結合 + 抗体反応孔径 0.45mm/0.2mm + 疎水結合による吸着 5

6 6 電気泳動 & 転写

7 電気泳動 SDS によってタンパク質の表面荷電を負電荷で打ち消されることでタンパク質は分子量に依存してゲルの電場中を移動電気泳動の Tips 目的タンパク質が適切に解析できるアクリルアミドゲル濃度を選択一定電圧低電圧で泳動するとバンドのゆがみ防止に 7

8 転写 ~ 転写において重要なこと ~ 1 バッファー 2 電流電圧 3 メンブレン溶出メタノール SDS 電流電圧吸着メタノール SDS 電流電圧メンブレンの孔径保持メンブレンの材質 8

9 転写 ~ 転写バッファー ~ メタノールゲルのサイズ保持膨潤を防止する脱水効果によりゲルを収縮させるため過剰の添加は溶出効率を低下させる高分子タンパク質は溶出しにくいためメタノール濃度を下げる ( 10%) ことで溶出効率が改善するメンブレンへの吸着力の向上バッファーやゲル中に含まれる SDS を除去しタンパク質の疎水性を高めタンパク質とメンブレンとの相互作用を強める低分子タンパク質は吸着力が低いため 15~20% に濃度を上げると吸着力が向上する 9

10 転写 ~ 転写バッファー ~ SDS 溶出効率の向上タンパク質の溶解性を高めることでアクリルアミドゲルからのタンパク質溶出促進メンブレンとタンパク質の相互作用を阻害アミノ酸の疎水基と疎水結合を起こすことでメンブレンとタンパク質の疎水性相互作用を阻害する 10

11 転写 ~ ゲルの平衡化 ~ 平衡化ゲルを転写バッファー中で分平衡化することで SDS が除かれタンパク質がメンブレンへ結合しやすくなる 11

12 転写 ~ 転写装置 ~ Wet Tank System タンク式とセミドライ式セミドライ式とタンク式では転写スピードサンプルへの熱の影響が異なる Semi-Dry Tank System タンク式セミドライ式転写スピード遅い速い熱の影響受けにくい受けやすい 12

13 転写 ~ メンブレンの材質 ~ Nitrocellulose 初めてウェスタンブロッティングに使用された材質プレウェッティング不要強度が弱い結合容量が低い PVDF (polyvinylidene fluoride) メタノールなどによるプレウェッティングが必要複数回のストリッピングリプロービング可能長期間保存可能結合容量が高い 13

転写 ~ メンブレンの孔径 ~ 0.45 µm 低バックグラウンドを実現する低い表面積率 ( 内部表面積 ) 20kDa のタンパク質で最も使用される 0.2 µm タンパク質吸着容量をもたらす高い表面積率 ( 内部表面積 ) <20kDa の低分子タンパク質少量タンパク質のブロッティングに注意!! 0.2mm 孔径のメ孔径厚さンブレンはバッ内部表面積 * タンパク質結合量 ** クグラウンドが Immobilon-P 0.

14 転写 ~ メンブレンの孔径 ~ 0.45 µm 低バックグラウンドを実現する低い表面積率 ( 内部表面積 ) 20kDa のタンパク質で最も使用される 0.2 µm タンパク質吸着容量をもたらす高い表面積率 ( 内部表面積 ) <20kDa の低分子タンパク質少量タンパク質のブロッティングに注意!! 0.2mm 孔径のメ孔径厚さンブレンはバッ内部表面積 * タンパク質結合量 ** クグラウンドが Immobilon-P 0.45µm 140 µm 高くなりやすい Immobilon-P SQ 0.2 µm 200 µm * 内部表面積 (m 3 )/ 外部面積 (m 3 ) **mg BSA/cm 2

15 転写 ~ メンブレンの孔径 ~ 吸着力の低い低分子タンパク質は0.2mmのメンブレンを使用することで吸着力を補うことができる A 0.45mm B 0.2mm C 0.2mm C 0.2mm A 0.45mm B 0.2mm 15

16 16 免疫検出

17 検出 ~ 検出方法 ~ 化学発光検出発色検出蛍光検出主流な検出法検出感度が複数感度が低い ( 化学発光のおよそ 1/10) シグナルが安定定量的 17

検出 ~ 抗体濃度 ~ 抗体希釈により全体的なバックグラウンドが低減するサンプル量を減らすことによりエキストラバンドが低減するヒト血清からのトランスフェリンの検出 1:1/1000 2:1/5000 3:1/25000

18 検出 ~ 抗体濃度 ~ 抗体希釈により全体的なバックグラウンドが低減するサンプル量を減らすことによりエキストラバンドが低減するヒト血清からのトランスフェリンの検出 1:1/1000 2:1/5000 3:1/ :1/ :1/ 一次抗体の希釈 1/10,000 1/50,000 1/50,000 二次抗体の希釈 1/50,000 1/10,000 1/50,000

19 検出 ~ 抗体濃度と検出試薬 ~ 高感度試薬を用いて抗体濃度を調節することでより高感度のシグナルを得ることができる of ERK1 kinase in rat liver lysates. 低感度試薬高感度試薬高感度試薬 : 15μl 2 : 7μl 3 : 3.5μl 一次抗体の希釈 1/10,000 1/10,000 1/200,000 二次抗体の希釈 1/50,000 1/50,000 1/200,000 19

20 検出 ~ 適正な検出条件の選択 ~ 検出感度はサンプル量と抗体の親和性により変化 1 次抗体濃度 1:1000 1:5000 1:10,000 20

21 ブロッキング ~ オーバーブロッキング ~ 5%NFDM 0.5% NFDM 0.1% NFDM 0.05% NFDM NFDM 濃度の希釈によってオーバーブロッキングを防ぐことが可能 21

22 ブロッキング ~ 非タンパク質のブロッキング剤 ~ 蛍光検出リン酸化タンパク質の検出自家蛍光を抑制リン酸化タンパク質によるバックグラウンドを抑制 5% NFDM Bløk-FL 5% NFDM Bløk-PO 22

23 23 トラブルシューティング

24 転写 ~ 低分子タンパク質の転写 ~ 0.2 µm の転写メンブレンを使用転写バッファーに10-20% のメタノールを添加転写バッファーからSDS を除く転写時間の短縮メタノール SDS 転写時間メンブレン低分子タンパク質ペプチド高分子タンパク質 0.22 um 0.45 um 24

25 転写 ~ 高分子タンパク質の転写 ~ ゲルの平衡化時間を長く転写バッファーのメタノール濃度を下げる低電圧で長く転写をするメタノール SDS 転写時間メンブレン低分子タンパク質ペプチド高分子タンパク質 0.22 um 0.45 um 25

26 検出 ~ 抗体濃度の調製 ~ 問題 1 次抗体濃度 2 次抗体濃度バックグラウンドが高いバンドが薄い検出できないリバースウェスタン ( 目的バンドは白く他は黒い状態 ) 26

27 27 SNAP i.d. 吸引式免疫反応システム

28 SNAP i.d. ~ 反応 ~ 従来の振盪器を用いた分子拡散による反応 SNAP i.d. を用いた吸引ろ過による反応膜表面に比べて膜内部の反応効率洗浄効果が低下する溶液が膜を通過するため膜内部でも高い反応効率洗浄効果を維持 28

29 従来法と SNAP i.d. のウェスタンブロッティングの所要時間比較 1 次抗体の添加とインキュベーションブロッキング洗浄 2 次抗体の添加とインキュベーション洗浄 ~1 時間 1 時間 ~O/N ~15 分 >1 時間 ~15 分従来の免疫検出 20 秒 10 分 1 分 10 分 1 分 SNAP i.d hrs vs 22 min 吸引ろ過を使用することで所要時間が 30 分以内に! 29

30 従来法 vs SNAP i.d. ~ 試薬のレシピ ~ SNAP i.d. を効果的に使用するためには条件の最適化が必要 Step 従来法 SNAP i.d. ブロッキング 5% NFDM 0.5% NFDM 一次抗体濃度 1x 3~5x 洗浄 (3x) 1x 1x 二次抗体濃度 1x 3~5x 洗浄 (3x) 1x 1x 30

31 従来法 vs SNAP i.d.~ 洗浄効率 ~ 31

32 SNAP i.d. TM Works for Proteins of Different Molecular Weights 220 目的タンパク質の分子量 (kda) Akt 38 p38 Src Nestin 180 EGFR Hexon 70 rin Hsp70 Albumin Vimentin P53 42 Erk1/ Actin 36 SOX-2 Synaptophysin GAPDH 18 Cyclophilin A 低タンパク質の発現量高

33 Summary ウェスタンブロッティング転写メタノールと SDS の濃度確認ゲルの平衡化小さい分子の捕捉には0.2mm SNAP i.d. での免疫反応 22 分でブロッキングから 2 次抗体の反応まで反応条件の迅速確認に最適条件を最適化することでウェスタンをより有効な研究ツールにブロッキング検出 1 次抗体 2 次抗体の濃度の調製最適試薬選択抗体反応を妨害しないブロッキング試薬速いねん吸ったらウェスタンは最適な感度の検出試薬を選定 33

34 ご清聴ありがとうございました All information presented today can be found at this site 34

Western BLoT Rapid Detect

研究用 Western BLoT Rapid Detect 説明書 v201212 Western BLoT Rapid Detect は標識二次抗体の代わりに独自の IgG Detector(HRP labeled) を利用して一次抗体を検出するウェスタンブロッティング専用の検出試薬キットです本製品を利用することで標識二次抗体を用いて検出する従来法ではできなかった迅速検出高感度検出シグナルの増強