MB-lecture12.pptx

Transcription

1 タンパク質の発現精製方法 目的遺伝子 タンパク質発現に用いる生物種のプロモーター例 )Lac (E. coli) ADH1 (S. cerevisiae) Promoter STOP タンパク発現用プラスミド マーカー遺伝子 ( 薬事耐性など ) 複製開始点 198 培地中のラクトース E. coli lac promoter E. coli でのタンパク質発現の例 pet system T7 RNA polymerase gene 株 :BL21(DE3) 他 T7 promoter 目的遺伝子 T7 RNA polymerase E.coli ゲノム DNA Cam R plys S plasmid T7 Lysozyme Amp R pet plasmid T7 lysozyme が T7 RNA polymerase に結合して活性を阻害 199 1

2 IPTG 発現誘導 pet system E. coli lac promoter T7 RNA polymerase gene T7 promoter 目的遺伝子 大量の T7 RNA polymerase mrna 翻訳 mrna 翻訳 E.coli ゲノム DNA T7 Lysozyme Amp R pet plasmid Cam R plys S plasmid 目的タンパク質 200 融合タンパク質を用いたアフニティー精製 (1) ヒスチジン タグ (His) 6 tag promoter-atg(his コドン ) 6 ( 目的タンパク )- 転写 mrna 翻訳 (His) 6 tag 目的タンパク質 201 2

3 His-tag の融合したタンパク質が Ni-agarose と結合 (His) 6 ニッケル (Ni) のついた担体 (Ni- agarose 等 ) 担体 ( アガロースビーズ等 ) 202 Ni- 担体を用いた (His) 6 tag タンパク質の精製 細胞の抽出液 イミダゾール (imidazol) Ni-agarose (His) 6 - protein が吸着 Ni-agarose (His) 6 - protein が溶出 H バツッ あっれ H 203 3

4 融合タンパク質を用いたアフニティー精製 (2) グルタチオン タグ GST-tag promoter-atg-[gst] ( 目的タンパク )- 転写 mrna 翻訳 GST 融合タンパク質 GST-tag GST (26 kda) グルタチオン S- 転移酵素 Glutathione S-transferase 目的タンパク質 204 グルタチオン担体を用いた GST 融合タンパク質の精製 GST( グルタチオン S- 転移酵素 ) はグルタチオンと結合 細胞の抽出液 グルタチオン (Glutathione) Glu-Cys-Gly 抗酸化物質 過酸化物から細胞を守る働き 還元型グルタチオン グルタチオン セファロース GST- protein が吸着 グルタチオン セファロース G GST GST- protein が溶出 G 還 G GST 205 4

5 遺伝的多型 Genetic Polymorphism 同一生物種内の個体間に認められる違い ( 多様性 ) その固体間の違いには遺伝的優劣はない 例 ) 血液型 A, B, O, AB 糖転移酵素遺伝子の幾つかの塩基置換により生じているが A, B, O, AB 型の間の遺伝的な優劣はない 遺伝的多型をマーカーとして利用する 生物固体間の違い ( 人では個人差 ) 生物種間の違い 株間の違い 206 制限断片長多型 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ゲノム DNA や特定の遺伝子 DNA を制限酵素で切断してその DNA 断片の長さの違いから生物種等の違いを大まかに判定する A 種 X 遺伝子 PCR 産物 新種 X 遺伝子 PCR 産物 制限酵素で切断 制限酵素で切断 異なる種である可能性が高い 207 5

6 単純配列長多型 Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) 生物ゲノム中にある同じ配列の繰り返しを回数により固体を識別する tandem repeat ( 縦列反復 ) ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC ATTCC 同じ配列が何回も繰り返される固体間 ( 個人間 ) により繰り返しの数が異なるものがある (Variable number of tandem repeat: VNTR) 同じ配列の単位 208 SSLP の種類 tandem repeat ( 縦列反復 ) 反復配列全体の長さ 繰り返し単位の長さ メガサテライト (Megasatellite) サテライト (satellite) 繰り返し単位の長さ 数 k base (3~5 kbp) 5~171 bp 反復配列全体の長さ 数百 kbp 100 kbp~ 数 M bp ミニサテライト (minisatellite) マイクロサテライト (maicrosatellite) 6~64 bp 0.1 kbp~20 kbp 1~4 bp 150 bp 以下 個人によって異なり 繰り返し数は遺伝するため 親子鑑定や犯罪捜査 (DNA 鑑定 ) に用いられる 209 6

7 病気に関連した繰り返し配列 トリプレットリピート (Trinucleotide repeat) ヒトの脳 神経 筋肉に関する遺伝病の原因の一つ CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG または CCG または GGA の繰り返し ( リピート ) 正常の人にもあるが 患者はリピート数が多い伸長の原因 : 不明 伸長のメカニズム :DNA 複製に関連 正常の人のリピート数は世代を通じてほとんど変化しないが患者は世代を通じてリピート数が増加し 減少することはない 正常 -CAGCAGCAGCAGCAGCAG- (30 回以下の繰り返し ) 子供 -CAGCAGCAGCAGCAGCAG- 変化無し 患者 -CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG- (40 回以上の繰り返し ) 子供 -CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG- 世代を経る毎にさらに増える Dynamic mutaoon 210 トリプレットリピート病 CAG/CTG repeat ハンチントン舞踏病 (HD) 歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症 (DRPLA) マカド-ジョセフ病 (MJD) 脊髄小脳変性症 (SCA1, 2, 6, 8) 球脊髄性筋萎縮症 ( ケネディー病 ) (SBMA) 筋緊張性ジストロフィー (DM) CCG/CGG repeat 脆弱 X 症候群 (FRAX) 翻訳領域内 CAG グルタミン ( ポリグルタミン ) ポリグルタミンの蓄積 アポトーシス 3 末端非翻訳領域 ( 転写されるが翻訳されない ) 5 末端非翻訳領域 ( 転写されない ) 1 世代で100から1000リピートに増幅することもある GAA/TTC repeat フリードライヒ遺伝性脊髄性運動失調症 (FRDA) イントロン内 211 7

8 1 塩基多型 スニップ single nucleotide polymorphism (SNP) pint mutation を塩基配列の決定をせずに判別する ( 病気の診断等 ) SSCP 法 (single-strand conformation polymorphism Gene Chip (DNA chip micro array 法 ) 212 SSCP 法 正常 A T 遺伝子 PCR 産物 患者 G C 片方の鎖を標識 T A 一本鎖に熱変性 G C 急冷一本鎖 DNA が二次構造 (secondary structure) を形成 二次構造のわずかな違い ポリアクリルアミドゲル電気泳動 正常 患者 泳動開始点 泳動方向 213 8

9 マイクロアレイ (Micro Array) オリゴ DNA シリコン 1cm ACGT 1cm 1cm 2 に約 100 万のスポットが可能各スポットにそれぞれ異なるオリゴ DNA が付いている シリコン上に DNA が吸着しているので DNA chip や gene chip と呼ばれる SNP (1 塩基置換 ) 解析では DNA 断片を蛍光標識して Gene chip のオリゴ DNA と hybridize すると 1 塩基の違いから結合の強弱をコンピューター解析して判定する 214 マイクロアレイを用いた遺伝子発現の解析 多数の遺伝子の発現を定量的に同時に解析する 細胞周期や臓器の違いによる遺伝子発現 病気の診断 ( がんの遺伝子マーカー診断 ) マウス脳の Cy5-mRNA( 緑 ) と腎臓の Cy3-mRNA( 赤 ) 腎臓で多く発現している遺伝子 チップ上に特定の病気で発現してくる遺伝子をスポットしておけば 患者からの mrna を解析して病気の診断などに利用できる 細胞工学別冊 DNA マイクロアレイと再審 PCR 法 より 215 9