上原記念生命科学財団研究報告集, 26 (2012) 3. 糸状菌の未利用遺伝子発現による天然物創出 大島吉輝 Key words: 糸状菌, 二次代謝物, 未利用遺伝子, エピジェネティクス 東北大学大学院薬学研究科医薬資源化学分野 緒言医薬品開発にとって重要な役割を果たしている糸状菌 ( カビ類 ) のゲノム解読が進むにつれ, 二次代謝物の生産に関わる多くの未利用生合成遺伝子の存在が明らかになってきた. ゲノム上のこれら 眠る遺伝子 を活用することができれば, 医薬品開発のシード化合物になりえる新規薬理活性物質の探索源が飛躍的に向上することが期待される. 最近, ヒストンや DNA のアセチル化やメチル化などのエピジェネティックな化学修飾を介したクロマチン構造変化による遺伝子発現調節機構が二次代謝物生産に及ぼす影響に関する研究が進展している. 例えば, ヒストンに多くのアセチル基が存在すると転写活性型クロマチン構造をとり, その周辺では DNA と転写因子の結合が容易になり遺伝子発現が上昇し, 二次代謝物が生産される. 一方,DNA がメチル化されると遺伝子発現は抑制される. 実際, ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤を添加して培養した糸状菌では二次代謝物生合成遺伝子の発現が上昇し, 既に網羅的な成分研究がなされていた菌種から新規化合物が単離された. 本研究では, エピジェネティックな化学修飾に対する酵素阻害剤である HDAC 阻害剤と DNA メチル化酵素阻害剤により糸状菌の未利用生合成遺伝子を発現させ, 多様な新規有用物質を創出させる. 方法 結果および考察 1. 昆虫寄生糸状菌によって生産される二次代謝物の酵素阻害剤による変化とその構造 1-4) 昆虫に寄生し昆虫を死に至らしめる特殊な生活環のなかで, 薬理活性物質を生産していると考えられる昆虫寄生糸状菌に, HDAC 阻害剤 (Zn 2+ 型 HDAC 阻害剤 :suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA),suberoyl hydroxamic acid (SBHA),valproic acid;nad + 依存型 HDAC 阻害剤 :nicotinamide,2-anilinobenzamide,sirtinol,splitomycin), DNA メチル化阻害剤 (RG-108,5-azacytidine,procaine) を添加して培養した. なお, 培養条件に関しては, 次の項目を検討した. 培地として YM,SDY,PDB,CDPY の4 種類を用いた. 液体培地, 固形培地, 半固形培地による二次代謝物の変化を確認した. 酵素阻害剤の添加方法 ( 単一の阻害剤 複数の阻害剤の同時添加, 添加時期, 回数, 濃度 ) による二次代謝物の生産への影響を検討した. その結果,HDAC 阻害剤である SBHA の 500μM,1 mm 添加, あるいは SBHA と DNA メチル化阻害剤 RG-108 の同時添加による Torrubiella luteorostrata,cordyceps indigotica,cordyceps annullata,gibellula formosana,isaria tenuipes の培養培地には, 無添加による培養に比べて多様な二次代謝物が生産されたことが明らかになった ( 図 1). 得られた二次代謝物の構造は,NMR 等の機器分析データおよび化学変換反応などにより決定された. その結果,destruxin A, E を含む9 種の既知化合物に加えて,28 種の新規化合物であることが判明した ( 図 2). 1
図 1 昆虫寄生糸状菌培養液の酢酸エチル抽出物の HPLC 分析. 図 2 昆虫寄生糸状菌の二次代謝物の構造. 2
２ 植物内生糸状菌によって生産される二次代謝物の酵素阻害剤による変化とその構造 植物内生糸状菌は タキソールなどの重要成分を生産し 他の糸状菌とは異なる生合成経路を有する可能性が示唆されて いる そこで 昆虫寄生糸状菌と同様に 植物内生糸状菌によって生産される二次代謝物の酵素阻害剤による変化を検討し た そ の 結 果 Chaetomium indicum Epicoccum purpurascens Chaetomium globosum Chaetomium mollipilium Pestalotiopsis sp.では SBHA 添加により生産される二次代謝物は質 量ともに明らかに増えた 図３ 得られた二次代謝物は 17 種の新規化合物と２種の既知化合物であり それらの構造は NMR 等の機器分析データおよび化 学変換反応などにより決定された 図４ 図 3 植物寄生糸状菌培養液の酢酸エチル抽出物の HPLC 分析. 図 4 植物寄生糸状菌の二次代謝物の構造. ３ 考察 エピジェネティックな化学修飾に関係する酵素阻害剤添加下での昆虫寄生糸状菌や植物内生糸状菌の培養は 糸状菌の二 次代謝を劇的に向上させ その結果 ポリケチド ステロイド アミノ酸誘導体など きわめて多様な構造を有する新規化合物 を生産させることが判明した なお CI-6, 7 や tenuipyrone は 分子間での[4+2]付加や Michael 付加によって生成されて くるものと考えられる 図５, ６ 3
本法はきわめて簡便な方法であり, 汎用性に富んでいる. したがって, 今後, 本法を様々な生物資源に適用することによ り, 医薬品開発において有用な新規薬理活性物質が生産されてくる可能性が高いと考えられる. 図 5. CI-6, 7 の推定生合成経路. 図 6. Tenuipyrone の推定生合成経路. 共同研究者 本研究の共同研究者は, 東北大学大学院薬学研究科の浅井禎吾である. 本稿を終えるにあたり, 本研究をご支援いただきま した上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます. 文献 1) Asai, T., Yamamoto, T. & Oshima, Y. : Histone deacetylase inhibitor induced the production of three novel prenylated tryptophan analogs in the entomopathogenic fungus, Torrubiella luteorostrata. Tetrahedron Lett., 52 : 7042-7045, 2011. 2) Asai, T., Yamamoto, T., Chung, Y.-M., Chang, F.-R. Wu, Y.-C., Yamashita, K. & Oshima, Y : Aromatic polyketide glycosides from an entomopathogenic fungus, Cordyceps indigotica. Tetrahedron Lett., 53 : 277-280, 2012. 4
3) Asai, T, Chung, Y.-M., Sakurai, H., Ozeki, T., Chang, F.-R., Yamashita, K & Oshima, Y. : Tenuipyrone, a novel skeletal polyketide from the entomopathogenic fungus, Isaria tenuipes, cultivated in the presence of epigenetic modifiers. Org. Lett., 14 : 513-515, 2012. 4) Asai, T., Dan, L., Obara, Y., Taniguchi, T., Monde, K., Yamashita K. & Oshima, Y. : Dihydrobenzofurans as cannabinoid receptor ligands, from Cordyceps annullata, an entomopathogenic fungus, cultivated in the presence of HDAC inhibitor. Tetrahedron Lett., 53 : 2239-2243, 2012. 5