[PDF] Biacore T200 取扱説明書 応用編

Instrument Handbook 71-3416-33

目 次 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング... 1 1-1. プログラムの 実 行... 1 1-2. データ 解 析... 10 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定... 20 2-1. プログラムの 実 行... 23 2-2. データ 解 析... 34 3. 濃 度 測 定... 43 3-1. 検 量 線 を 利 用 した 濃 度 測 定... 43 3-1-1. プログラムの 実 行... 44 3-1-2. データ 解 析... 54 3-2. 検 量 線 不 要 の 濃 度 測 定... 63 3-2-1. プログラムの 実 行... 68 3-2-2. データ 解 析... 85 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出... 93 4-1. プログラムの 実 行... 95 4-2. データ 解 析... 103 5. 結 合 アナライトの 回 収... 111 5-1. プログラムの 実 行... 112 6. 免 疫 原 性 試 験... 125

6-1. スクリーニング... 130 6-1-1. プログラムの 実 行 (Merged Inject 法 の 場 合 )... 130 6-1-2. プログラムの 実 行 (Double Mix 法 の 場 合 )... 137 6-1-3. データ 解 析... 139 6-2. 阻 害 法 を 利 用 した ADAs の 同 定... 144 6-2-1. プログラムの 実 行... 144 6-2-2. データ 解 析... 150 6-3. ADAs のアイソタイプの 同 定... 154 6-3-1. プログラムの 実 行 (Merged Inject 法 の 場 合 )... 154 6-3-2. プログラムの 実 行 (Double Mix 法 の 場 合 )... 160 6-3-3. データ 解 析... 162 6-4. ADAs の 成 熟 度 の 確 認... 165 6-4-1. プログラムの 実 行... 165 6-4-2. データ 解 析... 171

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 1 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 1-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Assay Binding Analysis を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダに 保 存 されてい るプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラムをハイライト にして Open をクリックします なお 低 分 子 化 合 物 のスクリーニングを 実 施 する 場 合 に は テンプレートのメソッドを 利 用 します 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します

2 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング Detection Flow path Chip Chip type 目 的 のフローセルを 設 定 します リファレンスの 差 し 引 き 機 能 を 利 用 してください キャ プチャー 法 を 利 用 する 場 合 差 し 引 き 機 能 として 2-1 または 4-3 のみの 選 択 となります 利 用 するセンサーチップを 選 択 します Capture アナライトの 添 加 前 に 固 定 化 したキャプチャー 分 子 に 対 して リガンドを 捕 捉 する 場 合 にチェックを 入 れます リガンドは フローセル 2 もしくはフローセル 4 にキャプチャーされます Sample アナライトの 添 加 複 数 サンプルの 連 続 添 加 は 補 足 1-1 を 参 照 してください Enhancement 2 次 抗 体 などを 添 加 する 場 合 にチェックを 入 れます Regeneration 再 生 が 必 要 な 場 合 にチェックを 入 れます 添 加 回 数 を 選 択 します (1 or 2) 入 力 後 Next >をクリックします ダミーランサイクルを 設 定 します Startup Solution 指 定 した 溶 液 で 相 互 作 用 測 定 と 同 様 の 工 程 をアナラ イト 測 定 前 に 実 施 します 通 常 は ランニング 緩 衝 液 を 用 います Number of cycles サイクル 数 3 回 以 上 を 推 奨 します

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 3 Next >をクリックします 補 足 1-1. 複 数 サンプルの 連 続 添 加 エピトープマッピング 等 多 段 階 の 相 互 作 用 を 検 証 する 場 合 は Sample 右 のカラムで 添 加 サ ンプル 数 を 選 択 します 最 大 4 サンプルまでの 添 加 が 可 能 です サンプル 3 サンプル 1 サンプル 2

4 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング Sample Contact time アナライトの 添 加 時 間 (s) Flow rate 流 速 (μl/min) Dissociation time 解 離 時 間 (s) Regeneration Solution 再 生 溶 液 の 名 称 High viscosity solution 粘 性 の 高 い 溶 液 (40% エチレングリコール 以 上 )の 場 合 は 選 択 します Contact time 再 生 溶 液 の 添 加 時 間 (s) Flow rate 流 速 (μl/min) Stabilization period 添 加 後 のベースラインの 安 定 化 時 間 (s) 設 定 後 Next >をクリックします Sample id アナライトの 名 称 を 入 力 します 入 力 した 順 番 で 測 定 します コントロールサンプルを 定 期 的 に 添 加 する 場 合 は Control Samples をクリックします

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 5 Repeat control sample(s) every 何 サンプルごとにコントロールサンプルを 測 定 するか 入 力 します 入 力 後 OK をクリックします Next >をクリックします 補 足 1-2. Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 の 入 力 Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 を 移 行 するには Excel での 保 存 時 タブ 区 切 りのテ キストファイル( 拡 張 子 は.txt)を 選 択 します タブ 区 切 りで 保 存 したデータを 上 記 画 面 で 開 き コピーペーストで 入 力 してください 測 定 を 始 める 前 の Prime before run および Normalize detector の 実 施 を 選 択 します Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25

6 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング サイクルの 測 定 順 番 を 確 認 したい 場 合 には Cycle Run List をクリックします Next >をクリックします 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 7 補 足 1-3. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます 補 足 1-4. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れている( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 はプ ーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します

8 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 設 定 をおこなうことができます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next をクリックし ます 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 9 Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 が 開 始 されます 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます 補 足 1-5. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

10 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 1-2. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 されます 補 足 1-6. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします ただし リガンド 名 の 変 更 はできません

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 11 補 足 1-7. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

12 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング Binding level ファイルを 利 用 したランキングとピックアップ Evaluation Explorer 中 の Plot フォルダの Binding level をクリックします 全 測 定 サイクル 分 (ダミーランによる 緩 衝 液 添 加 コントロールサンプル 測 定 を 含 む)に ついて サンプル 添 加 終 了 直 前 の 結 合 レスポンスのプロットとテーブルが 表 示 されます プロット 上 部 の の もしくは をクリックし 評 価 したいデー タを 選 択 します プロット 内 のポイントにマウスを 移 動 すると サンプル 情 報 が 表 示 され ます プロットの 並 び 替 えをおこなう 場 合 は 右 側 のテーブルの をクリックします カラムタイトルが に 変 更 され 結 合 レスポンスが 低 い 順 に 並 び 替 えられます 引 き 続 き をクリックすると カラムタイトルは に 変 更 され 高 い 順 に 並 びます 結 合 量 別 にピックアップをおこなう 場 合 は 右 テーブル 上 部 の をクリックしま す

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 13 Ranking をクリックします 評 価 基 準 となる 結 合 レスポンス(RU) 非 結 合 レスポンス(RU) 等 を 設 定 します One Ranking Boundary 境 界 基 準 を 1 つ 設 定 します First value:に 評 価 基 準 となる 数 値 を 入 力 します ( 例 )ネガティブコントロールサンプルの 結 合 レスポンス 2(RU) Two Ranking Boundaries 境 界 基 準 を 2 つ 設 定 します First value:および Second value:に 評 価 基 準 となる 数 値 を 入 力 します ( 例 )ポジティブコントロールサンプルの 結 合 レスポンス 50(RU) Finish をクリックします 設 定 した 結 合 レスポンスの 値 にラインが 引 かれます 同 時 に 右 表 には First value 値 より 結 合 レスポンスが 低 いサイクルには Low Second value 値 より 高 いものには High その 中 間 に 属 するものには Medium の 表 示 が 入 ります( 次 ページ 図 )

14 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 補 足 1-8. コントロールサンプルによる 結 合 量 補 正 経 時 的 にリガンドが 失 活 する 場 合 や 再 生 条 件 が 不 十 分 な 場 合 には サイクルごとにリガ ンドの 結 合 キャパシティーが 低 下 しています コントロールサンプルを 定 期 的 に 測 定 して いる 場 合 には コントロールサンプルの 結 合 量 低 下 が 確 認 できます この 場 合 結 合 量 の ランキングを 正 確 に 把 握 することができません 正 確 にランキングするためには コント ロールサンプルの 結 合 量 に 基 づき リガンドの 最 大 結 合 量 を 考 慮 した 結 合 量 の 補 正 を 行 い ます 分 子 量 補 正 をおこなっていないプロットで リガンドの 最 大 結 合 量 を 補 正 してください 補 正 をおこないたいプロットを 表 示 します の Adjustment for controls をクリッ クします

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 15 Adjustment settings の Use adjustment for controls にチェックを 入 れます Positive control: 利 用 するポジティブコントロールを 選 択 します Negative control: 利 用 するネガティブコントロールを 選 択 します なお ネガティブコントロールを 選 択 しない 場 合 には Y=0(RU)をネガティブコントロールとして 補 正 します Fitting function: フィッティングに 利 用 する 式 を 選 択 します Linear( 線 形 式 )または Polynomial( 多 項 式 )を 選 択 します ウインドウ 右 側 に 補 正 後 のプロットが 表 示 されます ポジティブコントロールのフィッテ ィングラインが Y 軸 =100 で ネガティブコントロールのフィッティングラインが Y 軸 =0 で 表 示 されます OK をクリックすると 補 正 後 のプロットが 表 示 されます

16 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング レポートポイントテーブルを 用 いたランキングとピックアップ Evaluation Add Report Point Table をクリックします Evaluation Explorer に Report Point Table フォルダとファイルが 追 加 され Work area には 全 測 定 サイクル 分 のデータが 表 示 されます 各 カラム 上 部 のフィルター を 使 用 し 必 要 データを 抽 出 します Fc リファレンス 差 し 引 きデータ Report Point binding( 結 合 レスポンスのレポートポイント 名 ) Assay Step Sample( 緩 衝 液 添 加 サイクル 等 を 除 きます) 抽 出 終 了 後 を 2 回 クリックします 結 合 レスポンスが 高 い 順 に 並 びます

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 17 補 足 1-9. クオリティーチェック コントロールサンプルのレスポンスチェック リガンドの 安 定 性 評 価 が 目 的 で 定 期 的 にコントロールサンプルを 添 加 している 場 合 Evaluation Explorer 中 の Plot フォルダに 存 在 する controls: binding データでチェックします リファレンスセルへの 非 特 異 的 吸 着 量 チェック Evaluation Explorer の Plot フォルダの Binding to reference データでチェックします

18 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 補 足 1-10. レポートポイントの 追 加 Tools Custom Report Points をクリックします Add をクリックします Id にレポートポイントの 名 前 を 入 力 します 追 加 する 位 置 を 設 定 し Cycles でどのサイクル で 記 録 するか 設 定 します OK をクリックします 初 期 画 面 に 追 加 したレポートポイントが 表 示 されます

1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニング 19 補 足 1-11. 結 合 量 のグラフ 化 結 合 量 を 棒 グラフとして 表 示 する 場 合 には Toolbar の をクリックします 結 合 量 が 棒 グラフとして 表 示 されます Curve でグラフ 化 するセンサーグラムを 選 択 します 複 数 選 択 も 可 能 です 表 示 方 法 色 カラムラベルの 表 示 を 変 更 する 場 合 には Tools をクリックして 変 更 したい 項 目 を 選 択 します

20 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 低 分 子 化 合 物 の 溶 解 性 の 問 題 で 有 機 溶 媒 を 利 用 する 場 合 には 一 般 的 なタンパク 質 -タンパ ク 質 相 互 作 用 測 定 と 異 なり ランニング 緩 衝 液 およびサンプル 調 製 に 注 意 が 必 要 です ま た 測 定 結 果 を 評 価 するにあたり 溶 媒 効 果 の 補 正 が 必 要 となります アナライトの 調 製 アナライト 溶 液 の DMSO の 終 濃 度 をランニング 緩 衝 液 と 合 わせます 化 合 物 濃 度 は 結 合 ス クリーニングが 目 的 の 場 合 親 和 性 にもよりますが 数 十 nm~ 数 μm で 調 製 します 反 応 速 度 定 数 の 算 出 が 目 的 の 場 合 K D ( 解 離 定 数 ) 値 濃 度 の 1/10~10 倍 の 濃 度 範 囲 で 5 濃 度 以 上 調 製 します ランニング 緩 衝 液 PBS や HEPES 緩 衝 液 が 広 く 利 用 されます HEPES は ヒト 血 清 アルブミンへの 結 合 が 見 ら れるので 注 意 してください 有 機 溶 媒 を 利 用 する 場 合 には DMSO 含 有 緩 衝 液 を 使 用 することが 多 いです DMSO 濃 度 は 5% 程 度 以 下 を 推 奨 します DMSO 濃 度 はリガンドの 活 性 や 化 合 物 の 溶 解 性 を 考 慮 し 決 定 し ます ランニング 緩 衝 液 に 使 用 できる DMSO 濃 度 は 10%までとなります 非 特 異 的 吸 着 を 抑 える 目 的 で 終 濃 度 0.05% 程 度 の 界 面 活 性 剤 (Surfactant P20 など)を 添 加 することもあります 補 足 2-1. ランニング 緩 衝 液 調 製 の 注 意 事 項 弊 社 販 売 の PBS 10X バッファー(1 x 1000 ml, BR-1006-72)は ph 調 製 済 みです 0.1M phosphate Buffer, 27 mm KCl, 1.37 M NaCl 超 純 水 で 10 倍 希 釈 後 DMSO を 加 えます 0.01 M phosphate Buffer, 2.7 mm KCl, 0.137 M NaCl, 5% DMSO, ph7.4 ランニング 緩 衝 液 は 用 事 調 製 してください DMSO を 扱 う 際 には 耐 性 材 質 の 容 器 を 使 用 します (プラスチック 容 器 は 使 用 不 可 ) DMSO を 含 む 緩 衝 液 をろ 過 する 際 には フッ 素 樹 脂 製 またはナイロン 製 のフィルター(0.22 μm)を 用 います 酢 酸 セルロース 製 のものは 避 けてください DMSO 溶 液 中 の 混 合 物 も 測 定 に 影 響 をおよぼす 場 合 があるのでグレードの 高 いもの(UV spectrometry 用 等 )を 使 用 し てください なお DMSO 混 合 による ph 変 動 は 大 きいため DMSO 混 合 後 の ph を 考 慮 し てください きれいなガラスボトルに 保 存 し 装 置 にセットする 直 前 までキャップはしっかり 閉 めてく ださい 装 置 のボトルポジションにセットする 際 は 必 ず 付 属 のスクリューキャップを 使 用 してください

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 21 溶 媒 補 正 SPR のシグナルはセンサーチップ 表 面 での 様 々な 屈 折 率 (RI)の 変 化 を 反 映 しています セ ンサーチップ 表 面 での 結 合 反 応 だけでなく ランニング 緩 衝 液 とサンプルを 溶 解 している 溶 媒 の 屈 折 率 の 差 すなわち 溶 媒 (バルク) 効 果 レスポンスが 含 まれます 溶 媒 効 果 が 小 さい(100 RU 以 下 ) 実 験 では リガンド 固 定 化 セルからリファレンスセルの レスポンスを 差 し 引 くだけでこのバルクレスポンスは 排 除 できます しかし 厳 密 には リガンド 固 定 化 セルに 添 加 した 溶 液 は リガンド 分 子 の 占 有 体 積 分 排 除 されるため リファレンスセルのバルクレスポンスは リガンド 固 定 化 セルよりも 高 く なります DMSOのバルクレスポンス 差 リファレンスセル リガンド 固 定 化 セル ランニング 緩 衝 液 とアナライト 溶 液 中 の DMSO 濃 度 1%の 違 いは 約 1,500 RU のバルクレスポ ンスに 相 当 します 複 数 あるサンプルを 個 々に 調 製 する 際 DMSO 濃 度 の 誤 差 が 無 視 できな いバルクレスポンスの 差 を 生 む 可 能 性 があります このように 溶 媒 効 果 が 大 きい DMSO を 用 いる 実 験 では 単 純 に 差 し 引 くだけではバルク レスポンスの 差 を 十 分 に 排 除 することはできません 実 際 このバルクレスポンスの 差 は 小 さくても( 通 常 10 RU 以 下 ) 低 分 子 化 合 物 が 結 合 した 際 に 得 られる 結 合 レスポンスと 同 程 度 であるため バルクの 差 を 補 正 する 必 要 があります 溶 媒 補 正 は 以 下 の 3 つの 要 因 が 重 複 した 際 必 要 となります 期 待 されるアナライトの 結 合 レスポンスが 小 さい(100 RU 以 下 ) 場 合 リガンドを 高 密 度 (10,000 RU 以 上 )に 固 定 化 した 場 合 サンプル 溶 液 に DMSO が 含 まれるなど バルクレスポンスが 大 きく(3000 RU 以 上 ) サンプル 間 で 値 が 異 なる 場 合 (DMSO 濃 度 の 誤 差 も 含 めて)

22 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 補 足 2-2. 溶 媒 補 正 の 方 法 溶 媒 補 正 の 手 順 Evaluation Software では 自 動 で 以 下 の 補 正 を 実 施 します 測 定 の 際 に DMSO 溶 液 の 濃 度 シリーズ(ランニング 緩 衝 液 に 含 まれる DMSO 濃 度 ±1 % 程 度 )を リガンド 固 定 化 セルおよびリファレンスセルに 添 加 し 固 定 化 セルとリァレンス セルのバルクレスポンスの 差 を 記 録 します リファレンスセルのレスポンスを x 軸 固 定 化 セルとリファレンスセルのバルクレスポンス の 差 を y 軸 にプロットして 溶 媒 補 正 用 曲 線 を 作 成 します 低 分 子 化 合 物 を 添 加 した 際 リファレンスセルのレスポンス( 図 1)を 溶 媒 補 正 用 曲 線 に 代 入 して 補 正 値 を 算 出 します( 図 2) 相 互 作 用 測 定 で 得 られた 結 合 レスポンスから 補 正 値 を 差 し 引 きます( 図 3) 1 2 3 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 の 調 製 例 5 % DMSO 含 有 サンプルを 用 いる 場 合 の 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 の 作 成 方 法 を 記 載 します すべての DMSO 溶 液 は 用 事 調 製 します 11x PBS(no DMSO)を 調 製 します 2 溶 媒 補 正 用 曲 線 4 % 6% DMSO ストック 溶 液 を 調 製 します 4% DMSO ストック 溶 液 1x ランニング 緩 衝 液 9,600 μl 100 % DMSO 400 μl 10,000 μl 6% DMSO ストック 溶 液 1x ランニング 緩 衝 液 9,400 μl 100 % DMSO 600 μl 10,000 μl 3ストック 溶 液 を 下 記 表 の 割 合 で 混 合 して 4 %~6 %の 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 を 調 製 しま す 以 下 の 表 は 8 段 階 の 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 を 調 製 する 際 のプロトコールです 4% DMSO 100 200 300 400 500 600 700 6% DMSO 700 600 500 400 300 200 100 700 700 700 700 700 700 700 700 (μl)

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 23 2-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Assay Kinetics/Affinity を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダに 保 存 されてい るプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラムをハイライト にして Open をクリックします 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します

24 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 Detection Flow path 2-1 もしくは 4-3 を 選 択 します Chip Chip type 利 用 するセンサーチップを 選 択 します Capture アナライトの 添 加 前 に 固 定 化 したキャプチャー 分 子 に 対 して リガンドを 捕 捉 する 場 合 にチェックを 入 れます リガンドは フローセル 2 もしくはフローセル 4 にキャプチャーされます Sample アナライトの 添 加 コマンドです Regeneration 再 生 が 必 要 な 場 合 にチェックを 入 れます 添 加 回 数 の 選 択 が 可 能 です(1 or 2) Carry Over アナライトのキャリーオーバーを 確 認 する 場 合 にチェックを 入 れます Next >をクリックします Conditioning Solution contact time Number of injections Startup Solution 再 生 溶 液 または 緩 衝 液 の 名 称 添 加 時 間 (s) 添 加 回 数 指 定 した 溶 液 で 相 互 作 用 測 定 と 同 様 の 工 程 をアナラ イト 測 定 前 に 実 施 します 通 常 は ランニング 緩 衝 液 を

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 25 用 います Number of cycles サイクル 数 を 設 定 します 3 回 以 上 を 推 奨 します Solvent correction 溶 媒 補 正 を 実 施 する 場 合 にチェックを 入 れます Number of injections 溶 媒 補 正 の 測 定 点 を 選 択 します 何 サンプルごとに 溶 媒 補 正 を 実 施 するかを Repeat after Sample cycles で 指 定 します Next >をクリックします Sample contact time アナライトの 添 加 時 間 120 s Flow rate 流 速 30 μl/min Dissociation time 解 離 時 間 120 s Extra wash after injection with アナライト 添 加 後 に 指 定 した 溶 液 でフローセル 以 外 の 流 路 を 洗 浄 したい 場 合 にチェックを 入 れます セン サーチップ 表 面 には 流 れません Stabilization period 添 加 後 のベースライン 安 定 化 時 間 0 s ( 必 要 に 応 じて 設 定 します ) 入 力 後 Next >をクリックします

26 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 Sample id アナライトの 名 称 MW (Da) アナライトの 分 子 量 Concentration アナライトの 濃 度 ( 単 位 も 選 択 ) 分 子 量 と 濃 度 を 入 力 すると 自 動 的 に モル 濃 度 nm と 重 量 濃 度 μg/ml を 換 算 します コントロールサンプルを 定 期 的 に 添 加 する 場 合 は Control Samples をクリックします

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 27 Control Sample definition コントロールサンプルを 測 定 する 場 合 に Run control Samples にチェックを 入 れます Repeat control Sample(s) every 何 サンプルごとにコントロールサンプルを 測 定 するか 指 定 します Control Samples テーブルにコントロールサンプルの 情 報 を 入 力 します 入 力 後 Next >をクリックします 補 足 2-3. Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 の 入 力 Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 を 移 行 するには Excel での 保 存 時 タブ 区 切 りのテ キストファイル( 拡 張 子 は txt)を 選 択 します タブ 区 切 りで 保 存 したデータを 上 記 画 面 で 開 き コピーペーストで 入 力 します 測 定 を 始 める 前 の Prime および Normalize の 実 施 を 選 択 します Temperature settings Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 Cycle Run List をクリックすると 測 定 サイクルのリストが 表 示 されます

28 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 Next >をクリックします 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 と 容 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックするとそ れに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイアルお よびサンプルをラックにセットします 補 足 2-4. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 29 補 足 2-5. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 別 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 を 設 定 することが 出 来 ます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します

30 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックし ます 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 31 Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 します 補 足 2-6. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

32 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 補 足 2-7. レポートポイントの 設 定 溶 媒 (バルク) 補 正 を 必 要 とする 実 験 では 低 分 子 アナライトのバルクレスポンスを 測 定 するために アナライト 添 加 中 ( 添 加 終 了 直 前 )にレポートポイントを 取 得 する 必 要 があ ります 自 動 取 得 されるレポートポイントの 名 前 は binding と 付 いています 添 加 終 了 直 後 のレポートポイントは stability として 取 得 されます また 低 分 子 アナライト 特 有 のニード ル 流 路 等 へのキャリーオーバーチェックのために アナライト 添 加 終 了 後 ランニング 緩 衝 液 をアナライトと 同 等 のモードで 添 加 する 際 に 取 得 されるレポートポイントの 名 前 は 頭 に co-が 付 けられています binding stability co_binding co_stability Sample Carry-over control Regeneration

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 33 補 足 2-8. キャプチャー 法 を 利 用 した 低 分 子 化 合 物 の 測 定 Wizard の Binding analysis および Kinetics / Affinity では 溶 媒 補 正 曲 線 の 測 定 を リガンド をキャプチャーせずに 実 施 します リガンドキャプチャー 後 のベースラインドリフトが 小 さく 一 度 リガンドをキャプチャーした 表 面 で 連 続 してアナライトの 測 定 を 実 施 する 場 合 には Wizard のキャプチャー 機 能 を 利 用 した 測 定 が 実 施 できます ただし キャプチャー 後 のベースラインドリフトが 大 きく アナライトごとにリガンドを キャプチャーする 場 合 は 溶 媒 補 正 曲 線 の 測 定 はリガンドキャプチャー 後 の 表 面 で 実 施 し てください この 際 測 定 プログラムはメソッドで 作 成 する 必 要 があります メソッド 作 成 については 基 本 操 作 編 -を 参 照 してください

34 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 2-2. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します ( 反 応 速 度 定 数 解 離 定 数 算 出 は 溶 媒 補 正 後 に 解 析 します 解 析 方 法 は 基 本 操 作 編 -を 参 照 してください ) 補 足 2-9. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします た だし リガンド 名 の 変 更 はできません

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 35 補 足 2-10. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

36 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 溶 媒 補 正 Evaluation Add Solvent correction をクリックします 測 定 サイクル 中 の 溶 媒 補 正 用 曲 線 が 表 示 されます リファレンス セルで 発 生 し ている 全 測 定 サンプルのバ ルク 幅 テーブルで 利 用 する 補 正 曲 線 にチェックを 入 れます OK をクリックすると 補 正 が 完 了 します 溶 媒 補 正 用 曲 線 は Evaluation Explorer 中 のフォルダに 追 加 保 存 されます

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 37 補 足 2-11. 測 定 ポイントの 削 除 エアーの 混 入 などの 理 由 で 溶 媒 補 正 用 曲 線 から 削 除 したい 測 定 ポイントがある 場 合 は その 測 定 ポイント 上 にカーソルを 移 動 し マウスを 右 クリックします Exclude point をクリックします 測 定 ポイントが 削 除 されます 同 時 に 改 めて 残 りの 測 定 ポイントで 溶 媒 補 正 用 曲 線 が 作 成 されます

38 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 補 足 2-12. 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 削 除 エアーの 添 加 などの 理 由 で 解 析 から 削 除 したい 溶 媒 補 正 用 曲 線 がある 場 合 目 的 の 溶 媒 補 正 用 曲 線 について Solvent correction 左 のボックスの Included カラムのチェックを 外 します 溶 媒 補 正 用 曲 線 は 削 除 されます

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 39 補 足 2-13. 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 延 長 サンプルもしくは 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 の 調 製 の 問 題 で 測 定 サンプルのバルクレスポン スが 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 の 範 囲 内 に 収 まらなかった 場 合 に 溶 媒 補 正 用 DMSO 溶 液 の 濃 度 幅 (=リファレンスセルに 対 するバルク 幅 )を 広 げることができます ただし 延 長 さ れた 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 領 域 での 補 正 は 実 測 値 とは 異 なるため 最 終 結 果 には 注 意 が 必 要 です Solvent correction 左 下 の Extrapolate をクリックします 延 長 する 幅 を 入 力 します 実 際 の 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 測 定 幅 の 10 %を 超 えないことが 望 まし いです OK をクリックします

40 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 データの 評 価 ヒット 化 合 物 のランキング 評 価 は 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニングを 参 照 してくだ さい 低 分 子 化 合 物 アナライトの 場 合 化 合 物 の 分 子 量 差 の 影 響 が 大 きいため 分 子 量 補 正 をすることにより 真 の 結 合 の 強 さを 評 価 します 分 子 量 補 正 結 合 レスポンスを 分 子 量 で 割 り さらに 100 を 掛 けた 値 が 補 正 値 です Evaluation Add Plot をクリックします Plot name Plot type Axis setting プロットデータの 名 称 ( 例 ;MW correction) プロット 様 式 の 設 定 (Report Point vs Variable) Y 軸 の 設 定 (Report Point:binding Response type:mw adjustedresponse) X 軸 の 設 定 (Variable:Cycle number) Finish をクリックします

2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 41 Evaluation Explorer の Plot フォルダに 反 映 されます ファイル 名 は 自 動 で Plot と 入 力 されるので 任 意 で 変 更 します Work area には 分 子 量 補 正 されたデータが 表 示 されます Y 軸 の 単 位 は 100 RU/Da となります 評 価 の 詳 細 は 1. 結 合 の 有 無 の 確 認 スクリーニングを 参 照 してください

42 2. 低 分 子 化 合 物 アナライトの 相 互 作 用 測 定 補 足 2-14. 測 定 結 果 の 正 当 性 の 評 価 Evaluation Explorer の Plot を 用 いて 得 られたデータの 信 頼 性 があるかどうかを 評 価 します ベースラインの 変 動 Baseline: Sample プロット 全 測 定 サイクルの baseline の 絶 対 値 に 対 するプ ロットが 表 示 されます 物 理 吸 着 しているリガ ンドがサイクルごとに 脱 離 している 場 合 右 肩 下 がりになりますが ポジティブコントロール サンプルのレスポンスが 確 認 できていれば 問 題 ありません ポジティブコントロールがない 場 合 全 サイクルの 総 変 動 量 (RU)が 固 定 化 量 の 10% 以 上 である 場 合 には それを 考 慮 して 評 価 する 必 要 があります キャリーオーバーチェック Carry Over プロット co_binding の co_baseline に 対 する 相 対 値 プロッ トが 表 示 されます ランニング 緩 衝 液 のレスポン ス( 画 面 では Startup サイクル)に 対 して レス ポンスの 大 きいアナライトはニードルや 流 路 等 に 吸 着 する 性 質 を 持 ちます キャリーオーバーが 激 しいアナライトの 次 のサイクルの 結 合 レスポ ンスは それを 考 慮 して 評 価 する 必 要 があります リファレンスセルへの 非 特 異 吸 着 の 確 認 Binding to reference プロット Stability の baseline に 対 する 相 対 値 のプロットが 表 示 されます ランニング 緩 衝 液 のレスポンスを 基 準 として 評 価 します ランニング 緩 衝 液 のレス ポンス 以 上 のサンプルは センサーチップ 表 面 へ 非 特 異 的 に 吸 着 している 可 能 性 があります それ を 考 慮 した 上 で 評 価 してください

3. 濃 度 測 定 43 3. 濃 度 測 定 3-1. 検 量 線 を 利 用 した 濃 度 測 定 結 合 レスポンス Biacore による 濃 度 測 定 では 定 量 したい 分 子 (A)に 対 して 親 和 性 を 持 つ 分 子 (B)が 必 要 となります B を 固 定 化 したセンサーチップ 傾 き 表 面 に A を 添 加 すると 添 加 した 濃 度 に 依 存 した 結 合 レスポンス(RU)が 得 られます 数 段 階 の 濃 度 既 知 の A を 添 加 し その 結 合 レス ポンスを 得 て 検 量 線 (RU vs C)を 作 成 しま す 濃 度 未 知 の A に 対 しても 同 様 に 添 加 し その 結 合 レスポンスを 検 量 線 にフィッティン グすることにより 濃 度 を 算 出 します また A 添 加 直 後 のセンサーグラムの 傾 き (Slope) も 結 合 レスポンス 同 様 に 添 加 している A の 濃 度 を 反 映 した 値 となるため Slope vs C の 検 量 線 からでも 定 量 をすることができます 直 接 法 と 阻 害 法 親 和 性 を 持 つ 分 子 (B)をセンサーチップ 表 面 に 固 定 化 し 定 量 分 子 A を 添 加 して 得 られる 結 合 レスポンスから 直 接 A の 濃 度 を 算 出 する 方 法 を 直 接 法 と 呼 びます それに 対 し 化 合 物 やペプチドなど 分 子 量 が 小 さい 分 子 を 定 量 する 場 合 は A もしくは A のアナログ(A )をセンサーチップに 固 定 し 定 量 分 子 A と A に 対 して 親 和 性 を 持 つ 分 子 B を 一 定 量 混 合 した 混 合 液 を 添 加 し 未 反 応 の B を 定 量 することによ り 混 合 液 中 に 存 在 する A を 逆 算 する 定 量 法 を 阻 害 法 と 呼 びます 直 接 法 による 検 量 線 阻 害 法 + 添 加 B A もしくは A 阻 害 法 による 検 量 線

44 3. 濃 度 測 定 3-1-1. プログラムの 実 行 濃 度 測 定 では 原 則 としてリファレンスセルを 設 定 しません 評 価 に 用 いる 結 合 量 として 溶 液 効 果 の 影 響 を 受 けない 解 離 領 域 における 結 合 量 を 利 用 するためです なお 非 特 異 的 吸 着 を 差 し 引 く 等 の 目 的 で リファレンスセルを 設 定 する 場 合 には あらかじめウィザー ドの Concentration Analysis のテンプレートで 作 成 したメソッドをメソッドビルダーで 開 き リファレンスセルを 設 定 をした 上 で 測 定 を 実 施 してください Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Assay Concentration Analysis を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプログラム を Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダに 保 存 されて いるプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラムをハイライ トにして Open をクリックします 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します

3. 濃 度 測 定 45 Detection Flow path Chip Chip type 目 的 のフローセルを 選 択 します リファレンスセルの 差 し 引 き はできません 利 用 するセンサーチップを 選 択 します Capture アナライトの 添 加 前 に 固 定 化 したキャプチャー 分 子 に 対 して リガンドを 捕 捉 する 場 合 にチェックを 入 れます Sample アナライトの 添 加 コマンドです Enhancement 2 次 抗 体 などを 添 加 する 場 合 にチェックを 入 れます Regeneration 再 生 が 必 要 な 場 合 にチェックを 入 れます 添 加 回 数 を 選 択 してください (1 or 2) Next >をクリックします Startup 指 定 した 溶 液 ( 通 常 ランニング 緩 衝 液 )で サンプル 測 定 と 同 様 の 工 程 をサン プル(アナライト) 測 定 前 に 実 施 します Solution 溶 液 名 Number of cycles サイクル 数 3 回 以 上 を 推 奨 します Next >をクリックします

46 3. 濃 度 測 定 Sample contact time Flow rate Mix with アナライトの 添 加 時 間 (s) 流 速 (μl/min) チェックを 入 れると 測 定 直 前 にサンプルと 混 合 溶 液 を 自 動 混 合 します( 阻 害 法 による 定 量 の 場 合 に 使 用 しま す) Fraction に 混 合 後 の 溶 液 に 対 する 混 合 溶 液 の 割 合 (%)を 入 力 します ( 例 )75%と 入 力 した 場 合 :サンプル 25% 混 合 溶 液 75% Regeneration Solution High viscosity solution contact time Flow rate Stabilization perion 再 生 溶 液 の 名 称 粘 性 の 高 い 溶 液 (40% エチレングリコール 以 上 )の 場 合 はチェックを 入 れます 再 生 溶 液 の 添 加 時 間 (s) 流 速 (μl/min) 添 加 終 了 後 のベースライン 安 定 化 時 間 (s) Next >をクリックします

3. 濃 度 測 定 47 Calibration Curve Analyte name アナライト( 既 知 濃 度 サンプル)の 名 称 Run first 検 量 線 測 定 を 測 定 の 初 めに 実 施 するよう 予 め 設 定 され ています Repeat calibration every 検 量 線 作 成 頻 度 指 定 したサンプル 数 ごとに 検 量 線 を 実 施 します チェッ クを 入 れない 場 合 には サンプル 測 定 前 に 1 度 検 量 線 を 測 定 します Run last 検 量 線 測 定 を 測 定 の 最 後 に 実 施 するかを 設 定 します Calibration points Concentration 単 位 をプルダウンで 選 択 して 濃 度 を 入 力 します 6 段 階 濃 度 以 上 測 定 回 数 2 回 以 上 の 繰 り 返 し 測 定 を 推 奨 します テーブルに 入 力 した 順 番 で 測 定 は 実 行 します Next >をクリックします

48 3. 濃 度 測 定 Control Sample definition Run control Samples コントロールサンプルを 測 定 する 際 にチェックします Repeat control Sample(s) every 測 定 頻 度 を 入 力 します コントロールは 20 サンプル 程 度 ごとに 入 れます Control Samples Control Sample id コントロールサンプルの 名 称 Expected conc. コントロールサンプルの 濃 度 Next >をクリックします

3. 濃 度 測 定 49 Sample id サンプルの 名 称 Dilution factor サンプルの 希 釈 倍 率 テーブルに 入 力 した 順 番 で 測 定 します Next >をクリックします 補 足 3-1. Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 の 入 力 Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 を 移 行 するには Excel での 保 存 時 タブ 区 切 りのテ キストファイル( 拡 張 子 は txt)を 選 択 します タブ 区 切 りで 保 存 したデータを 上 記 画 面 で 開 き コピーペーストで 入 力 します 測 定 を 始 める 前 の Prime および Normalize の 実 施 を 選 択 します Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 Cycle Run List をクリックすると 測 定 サイクルを 確 認 できます Next >をクリックします

50 3. 濃 度 測 定 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 3-2. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

3. 濃 度 測 定 51 補 足 3-3. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 を 設 定 することができます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します

52 3. 濃 度 測 定 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックし ます 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 の 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

3. 濃 度 測 定 53 補 足 3-4. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

54 3. 濃 度 測 定 3-1-2. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 自 動 保 存 された 取 得 データが 開 きます 補 足 3-5. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします

3. 濃 度 測 定 55 補 足 3-6. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

56 3. 濃 度 測 定 Toolbar の をクリックします Using calibration をクリックします Concentration Analysis[Create]ボックスの Calibration が 表 示 されます Calibration Curve Settings Flow cell 解 析 に 利 用 するセルの 選 択 Report point レポートポイントの 選 択 Response type 結 合 レスポンス(Relative Response)で 濃 度 測 定 するか 傾 き(Slope)で 濃 度 測 定 するか 選 択 します Fitting Function 検 量 線 を linear で 引 くか 4-parameter で 引 くか 選 択 し ます Use preceding calibration curve サンプル 測 定 の 直 前 で 測 定 した 検 量 線 を 利 用 する 場 合 にチェックを 入 れます Use average calibration Curve 検 量 線 を 複 数 作 成 していて 平 均 した 検 量 線 を 利 用 する

3. 濃 度 測 定 57 場 合 にチェックを 入 れます Use calibration trends 検 量 線 を 複 数 作 成 している 場 合 で 時 間 経 過 に 伴 う 結 合 量 の 低 下 を 考 慮 したサイクル 毎 の 検 量 線 を 利 用 する 場 合 にチェックを 入 れます (サイクル 毎 の 検 量 線 はバー チャル 作 成 されます ) 設 定 した 条 件 の 検 量 線 を 確 認 します Calibration Curve の もしくは をクリックし 目 的 のサ イクルを 選 択 します 複 数 の 検 量 線 を 同 時 に 確 認 する 場 合 は を 使 用 します キーボードの Ctrl キーを 押 しながら カラム 中 の 目 的 の 番 号 をクリックします 連 続 した 番 号 を 選 択 する 場 合 は マウスをドラッグして 選 択 可 能 です 画 面 右 に 設 定 した 検 量 線 が 表 示 されます Use calibration trends を 選 択 した 場 合 には 全 検 量 線 の 重 ね 書 きが 表 示 されます 画 面 左 の Calibration Table に 検 量 線 の 各 測 定 ポイントの 詳 細 情 報 が 表 示 されます Conc.には メソッドで 入 力 した 濃 度 Calc.Conc.には 作 成 した 検 量 線 から 計 算 した 濃 度 が 表 示 されます 同 一 濃 度 で 繰 り 返 し 測 定 している 場 合 には 算 出 された 濃 度 の CV 値 が CV(%)に 表 示 され ます 検 量 線 の 測 定 ポイントの 選 択 削 除 検 量 線 の 選 択 削 除 は 補 足 3-7 および 3-8 を 参 照 してく ださい

58 3. 濃 度 測 定 未 知 サンプルの 測 定 結 果 Concentration Analysis[Create]ボックス 上 部 の Samples のタブの 付 いたページをクリック します 画 面 左 の Sample Table にサンプル 情 報 が 表 示 されます Dil.Fact.( 希 釈 倍 率 )を 掛 けた 濃 度 が Calc.Conc.に 表 示 されます 同 一 サンプルで 繰 り 返 し 測 定 している 場 合 には 算 出 された 濃 度 の CV 値 が CV(%)に 表 示 されます クリックして 選 択 したサンプルについては 画 面 右 で 強 調 表 示 されます 測 定 ポイントの 選 択 削 除 は 補 足 3-7 を 参 照 してください Finish をクリックします 解 析 結 果 が Evaluation Explorer 中 のフォルダに 保 存 されます

3. 濃 度 測 定 59 補 足 3-7. 測 定 ポイントの 削 除 エアーの 混 入 などの 理 由 で 測 定 結 果 から 削 除 したい 測 定 ポイントがある 場 合 は その 測 定 ポイント 上 にカーソルを 移 動 し マウスを 右 クリックします Exclude Cycle をクリックします 測 定 ポイントが 削 除 され 同 時 に Calibration Table の 削 除 した 測 定 ポイントに 赤 色 の 削 除 ラ インが 引 かれます 検 量 線 の 測 定 ポイントを 削 除 した 場 合 には 改 めて 残 りの 測 定 ポイントで 検 量 線 が 作 り 直 されます 再 度 採 用 する 場 合 には マウスを 右 クリックして Include Cycle を 選 択 します

60 3. 濃 度 測 定 補 足 3-8. 検 量 線 の 削 除 エアーの 添 加 などの 理 由 で 複 数 回 数 取 得 している 検 量 線 のうち 解 析 から 削 除 したい 検 量 線 がある 場 合 いずれかの 測 定 ポイント 上 でマウスを 右 クリックします Exclude Curve をクリックします 検 量 線 は 削 除 され 同 時 に Calibration Table のその 検 量 線 を 構 成 している 全 測 定 ポイントに 赤 色 の 削 除 ラインが 引 かれます 再 度 採 用 する 場 合 には マウスを 右 クリックして Include Curve を 選 択 します

3. 濃 度 測 定 61 補 足 3-9. コントロールサンプルのレスポンスのチェック 定 期 的 にコントロールサンプルを 添 加 している 場 合 その 結 合 レスポンスを Concentration Analysis [Create]ボックス 上 部 の Control Samples のタブの 付 いたページでチェックする ことができます 補 足 3-10. レポートポイントの 追 加 Tools Custom Report Points をクリックします Add をクリックします

62 3. 濃 度 測 定 Id にレポートポイントの 名 前 を 入 力 します 追 加 する 位 置 を 設 定 し Cycles でどのサイクル で 記 録 するのか 設 定 します OK をクリックします 初 期 画 面 に 追 加 したレポートポイントが 表 示 されます なお 追 加 したレポートポイントは Calibaration Settings の Report Point に 追 加 されます

3. 濃 度 測 定 63 3-2. 検 量 線 不 要 の 濃 度 測 定 CFCA (Calibration Free Concentration Analysis) 検 量 線 を 必 要 としない 濃 度 測 定 法 (CFCA ; Calibration Free Concentration Analysis) は アナ ライトの 拡 散 特 性 とセンサーグラムの 結 合 領 域 初 期 における 結 合 速 度 ( 初 期 結 合 速 度 )を 利 用 して カーブフィッティングにより 結 合 活 性 を 有 するアナライト 分 子 の 絶 対 濃 度 を 算 出 する 方 法 です 適 した 標 準 分 子 がない 場 合 や 標 準 サンプルの 結 合 活 性 濃 度 を 確 認 し たい 場 合 に 有 効 です さらに 厳 密 な 速 度 定 数 と 親 和 定 数 を 求 める 目 的 においても CFCA により 絶 対 的 な 結 合 活 性 濃 度 を 求 めることは 有 効 です d[r] dt M W : 分 子 量 (Da) k m = f ( M w, k m, Conc ) :マストランスポート 係 数 d[r] / dt 100 μl/min 5 μl/min CFCA では リガンドをできるだけ 多 く 固 定 化 ( 例 : 分 子 量 150 kda で 5000 RU 以 上 )し マストランスポートリミテーション 条 件 下 で 測 定 を 実 施 します 固 定 化 量 が 多 い 表 面 にお いて 初 期 結 合 速 度 は アナライトの 分 子 量 (Mw) マストランスポート 係 数 (km) アナ ライト 濃 度 (Conc)で 決 定 されます このため 上 記 の 初 期 結 合 速 度 (d[r] / dt)の 関 数 を 利 用 してサンプル 中 のアナライト 濃 度 を 算 出 することができます 測 定 は アナライトを 最 低 2 流 速 (5 および 100 μl/min を 推 奨 )で 添 加 して センサーグラ ムから 初 期 結 合 速 度 を 求 めます マストランスポート 係 数 (km)は 拡 散 係 数 (D) 流 速 フローセル 容 積 から 計 算 できます 得 られた 2 流 速 でのセンサーグラムを 1:1 結 合 モデル で Kinetics 解 析 し アナライトの 分 子 量 (Mw) km 値 を 定 数 とし アナライト 濃 度 をパラ メータとしてカーブフィッティングすることで 濃 度 を 算 出 します なお アナライトが 抗 体 (Bivalent Analyte)であっても マストランスポートリミテーション 条 件 下 で カーブフ ィッティングが 良 好 であれば CFCA を 実 施 することができます 参 考 文 献 : Christensen, Anal. Biochemistry (1997)249, p.153 Sigmundsson, K., et. Al., Biochemistry (2002) 41, p.8263

64 3. 濃 度 測 定 CFCA を 実 施 するための 至 適 条 件 1 アナライト 分 子 量 5,000 Da 2 結 合 速 度 定 数 (k a ) 10 7 > k a > 5 X 10 4 M -1 s -1 3 固 定 化 量 できるだけ 多 く 固 定 化 します ( 分 子 量 150 kda では 5,000 RU 以 上 は 必 要 ) 4 アナライト 濃 度 CFCAで 良 好 な 結 果 が 得 られる 濃 度 レンジは 0.05~5 μg/ml です 測 定 に 用 いるサンプル 濃 度 は 1 μg/ml 程 度 が 至 適 です 吸 光 度 (280 nm)による 総 タンパク 質 濃 度 を 基 準 として 調 製 します 濃 度 が 不 明 な 場 合 には 10 倍 希 釈 系 列 で 4 濃 度 以 上 調 製 してく ださい 5 流 速 5 μl/min および 100 μl/min を 推 奨 します 6 サンプルの 性 状 拡 散 係 数 や 分 子 量 が 大 きく 異 なる 分 子 の 混 合 溶 液 の 場 合 には CFCA は 実 施 できません 例 )アナライトが IgG のポリクローナル 抗 体 の 場 合 には CFCA は 可 能 ですが アナライトが IgG と IgM の 混 合 溶 液 の 場 合 には CFCA は 実 施 できません 7 リファレンスセル リファレンスセルも 設 定 し リファレンスセルを 差 し 引 いたセ ンサーグラムを 利 用 して CFCA を 実 施 します 8 非 特 異 的 吸 着 非 特 異 的 吸 着 が 起 きている 場 合 に 正 確 な 濃 度 が 算 出 できません 補 足 3-11. マストランスポート マストランスポートリミテーションとは マストランスポートとは フローセルを 流 れる 溶 液 中 からセンサーチップ 表 面 への アナ ライトの 拡 散 現 象 を 表 します アナライトのセンサーチップ 表 面 への 拡 散 ( 供 給 ) 速 度 は 次 式 で 求 められます アナライトの 拡 散 速 度 (mol/m 2 s)=アナライト 濃 度 マストランスポート 係 数 (km) 3 D 2 f km = 0.98 0.3 h 2 w l D : 拡 散 係 数 f : 測 定 流 速 h :フローセルの 高 さ w :フローセルの 幅 l :フローセルの 長 さ なお アナライトの 拡 散 速 度 よりも センサーチップ 表 面 のリガンドとの 結 合 速 度 が 速 い 場 合 マストランスポートが 結 合 速 度 を 制 限 するため マストランスポートリミテーショ ンが 起 きているといえます リガンドの 固 定 化 量 が 多 い 場 合 には マストランスポートリ ミテーションが 起 こりやすいです

3. 濃 度 測 定 65 補 足 3-12. 拡 散 係 数 の 求 め 方 CFCA を 実 施 する 場 合 20 における 拡 散 係 数 がパラメータとして 必 要 です 拡 散 係 数 は 分 子 のサイズと 形 状 によって 決 定 され 次 式 によって 算 出 できます D = 324.3 10-11 f ηrel Mw 1/3 (m 2 /s) f η rel Mw : 摩 擦 率 :20 での 水 に 対 するアナライト 溶 媒 の 粘 性 : 分 子 量 (Da) なお 以 下 の 方 法 でも 拡 散 係 数 を 得 ることができます 1 弊 社 Web サイト 上 の 拡 散 係 数 算 出 ツール 2 文 献 値 3 実 験 的 に 算 出 ( 超 遠 心 分 析 や 光 散 乱 分 析 など) 弊 社 Web サイトの 拡 散 係 数 算 出 ツールによる 拡 散 係 数 の 求 め 方 次 のアドレスにアクセスします http://www.biacore.com /diffusion_calculator ユーザー 名 (User ID)とパスワード(Password)を 入 力 して LOGIN をクリックします ( 事 前 に ユーザー 登 録 が 必 要 です )

66 3. 濃 度 測 定 1 2 3 4 画 面 上 で 20 における 拡 散 係 数 を 算 出 します 1 Molecular weight: 分 子 量 (Da)を 入 力 します 2 Friction ratio: 摩 擦 率 Choose molecular shape にチェックを 入 れ の をクリックして 該 当 の 値 を 選 択 します 以 下 の 3 項 目 から 選 択 できます Globular (1.2) 球 形 のタンパク 質 ( 初 期 設 定 値 ) 例 ) 抗 体 など Moderately elongated (1.7) 長 いタンパク 質 例 )フィブロネクチンやプラスミノーゲンなど Elongated (2.5) 硬 く 長 いタンパク 質 例 )フィブリノーゲンやトロポミオシンなど

3. 濃 度 測 定 67 Enter value にチェックを 入 れると 任 意 の 値 を 入 力 できます 3 Viscosity relative to water at 20 20 における 水 に 対 するアナライト 溶 媒 の 粘 性 Use standard value (1.00)にチェックを 入 れると 粘 性 係 数 を 1 と します ( 初 期 設 定 値 ) Enter value にチェックを 入 れると 任 意 の 値 を 入 力 できます 1~3の 設 定 が 終 了 したら をクリックし 計 算 を 実 行 します 4に 計 算 結 果 が 表 示 されます 画 面 下 では 任 意 の 温 度 における 拡 散 係 数 から 20 における 拡 散 係 数 を 算 出 することが できます 文 献 や 実 測 によって 20 以 外 での 拡 散 係 数 が 得 られている 場 合 にも 利 用 でき ます

68 3. 濃 度 測 定 3-2-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Method アイコン( ます )または Menu bar の Run Method をクリックし Biacore Methods を 選 択 した 後 Open をクリックします Calibration-Free Concentration を 選 択 した 後 Open をクリックします Method Builder の Main ダイアログが 表 示 されます Overview 画 面 にはメソッド 全 体 の 設 定 項 目 が 表 示 されます 以 下 に 変 更 項 目 について 記 載 します 詳 細 は 日 本 語 取 扱 説 明 書 基 本 操 作 編 -を 参 照 してください General Settings をクリックします

3. 濃 度 測 定 69 1 2 3 4 5 6 1 Data Collection rate 10 Hz を 選 択 します 2 Detection 検 出 モードを 以 下 の 2 つ(Dual, Multi)から 選 択 します Dual 2-1 4-3 Multi 2-1,4-3 2-1,3-1,4-1 3 Sample compartment temperature サンプルコンパートメントの 温 度 (4~45 )を 設 定 します 通 常 は 25 4 Concentration unit アッセイ 全 体 を 通 して 用 いる 濃 度 単 位 を 選 択 します 5 Buffer settings 使 用 するランニング 緩 衝 液 名 を 入 力 します 6 After run チェックを 入 れておくと 全 測 定 が 終 了 した 後 に センサー 表 面 の 温 度 が 指 定 し た 温 度 に 自 動 変 更 されます 設 定 後 Assay Steps をクリックします

70 3. 濃 度 測 定 1 2 1 Startup を 選 択 します 2 下 記 のように 設 定 します Number of replicates times ベースライン 安 定 化 のためのスタートアップの 測 定 回 数 を 指 定 します 3 回 以 上 を 推 奨 します

3. 濃 度 測 定 71 1 2 1 Sample を 選 択 します 2 下 記 のように 設 定 します Number of replicates times 繰 り 返 し 測 定 回 数 を 選 択 します

72 3. 濃 度 測 定 1 2 1 Blank を 選 択 します 2 下 記 のように 設 定 します Recurrence Distribute にチェックを 入 れ occurrences evenly で 1 を 選 択 全 測 定 サイクル 内 で 均 等 にブランクの 測 定 を 実 施 します Number of replicates times 繰 り 返 し 測 定 回 数 を 選 択 します Cycle Types をクリックします

3. 濃 度 測 定 73 1 2 4 3 5 1 Startup をクリックします アナライト 測 定 前 のスタートアップの 詳 細 を 設 定 します 2 Commands タブの Sample1 をクリックします 3 Settings for Sample1 でスタートアップ 用 サンプル(Buffer) 添 加 の 詳 細 条 件 を 設 定 しま す 測 定 流 速 以 外 は サンプル 添 加 と 同 一 条 件 を 設 定 します Type High performance を 選 択 します Contact time 添 加 時 間 (s) 基 本 は 36 秒 です Dissociation time 解 離 時 間 (s) 基 本 は 5 秒 です Flow rate 流 速 (μl/min) 基 本 は 30μl/min です Flow path Both を 選 択 します Sample solution Buffer (ランニング 緩 衝 液 ) 4 引 き 続 き Commands タブの Regeneration1 をクリックします 5 再 生 条 件 を 設 定 します Regeneration solution 再 生 溶 液 名 を 入 力 します Contact time 添 加 時 間 (s) Flow rate 流 速 (μl/min) Flow path Both を 選 択 します

74 3. 濃 度 測 定 1 2 4 3 5 1 Cycle types currently in Method の Sample をクリックします 2 Commands タブの Sample 1 をクリックします 3 Settings for Sample1 でサンプル 添 加 の 詳 細 条 件 を 設 定 します Type High performance を 選 択 します contact time 添 加 時 間 (s) 基 本 は 36 秒 です Dissociation time 解 離 時 間 (s) 基 本 は 5 秒 です Flow rate Is variable に 設 定 されています 実 数 は Setup Run の Variables で 入 力 します Flow path Both を 選 択 します 4 引 き 続 き Commands タブの Regeneration 1 をクリックします 5 再 生 条 件 を 設 定 します Regeneration solution 再 生 溶 液 名 を 入 力 します contact time 添 加 時 間 (s) Flow rate 流 速 (μl/min) Flow path Both を 選 択 します Variable Settings を 選 択 します

3. 濃 度 測 定 75 Assay Steps の Sample をクリックします 画 面 右 上 で Define some values in method and others at run time. にチェックを 入 れます 下 記 の 5 項 目 については Setup Run 以 降 の Variables で 入 力 します Sample solution サンプル 名 Flow rate (μl/min) 同 一 サンプルで 5 μl/min と 100 μl/min の 2 流 速 を 設 定 します MW(Da) 分 子 量 D(20 ) 20 における 拡 散 係 数 Dilution サンプルの 希 釈 倍 率 以 下 について 画 面 下 で 設 定 します Blank 解 析 時 のキーワードとして 利 用 します ブランクサンプルか 否 か を 指 定 します サンプルの 場 合 には No または n を 入 力 しま す

76 3. 濃 度 測 定 Assay Steps の Blank をクリックします 画 面 右 上 で Define some values in Method and others at run time. にチェックを 入 れます Flow rate (μl/min)については Setup Run 以 降 で 入 力 します 画 面 下 で 下 記 の 項 目 について 入 力 します Sample solution Buffer と 入 力 します MW(Da) 未 入 力 D(20 ) 未 入 力 Blank ブランクサンプルの 場 合 には Yes または y を 入 力 します Dilution 未 入 力 Verification をクリックします

3. 濃 度 測 定 77 メソッドの 設 定 に 不 備 が 無 ければ The Method has been verified and can be used to set up a run. と 表 示 されます 問 題 が 有 る 場 合 は 該 当 部 分 が 表 示 されるので 指 示 に 従 って 修 正 し ます 確 認 後 Setup Run をクリックします 適 切 な Flow path を 選 択 し Next >をクリックします

78 3. 濃 度 測 定 Sample をクリックします 下 記 項 目 について 入 力 します Sample solution サンプル 名 Flow rate (μl/min) 同 一 サンプルで 5 μl/min と 100 μl/min の 2 流 速 を 設 定 します Mw(Da) 分 子 量 D(20 ) 20 における 拡 散 係 数 Dilution サンプルの 希 釈 倍 率

3. 濃 度 測 定 79 引 き 続 き Blank をクリックします Flow rate (μl/min) Sample と 同 一 の 流 速 を 設 定 します 設 定 後 Next >をクリックします 測 定 サイクルリストが 表 示 されます

80 3. 濃 度 測 定 Next >をクリックします 測 定 を 始 める 前 に Prime および Normalize をおこなう 場 合 にはチェックを 入 れます 入 力 後 Next >をクリックします 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 3-13. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

3. 濃 度 測 定 81 補 足 3-14. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 を 設 定 することができます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します

82 3. 濃 度 測 定 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックします 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したメソッドをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします

3. 濃 度 測 定 83 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

84 3. 濃 度 測 定 補 足 3-15. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

3. 濃 度 測 定 85 3-2-2. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します 補 足 3-16. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします た だし リガンド 名 の 変 更 はできません

86 3. 濃 度 測 定 補 足 3-17. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

3. 濃 度 測 定 87 Toolbar の をクリックし をクリックします 画 面 上 の 表 に 測 定 したサンプル 情 報 が 測 定 サイクル 順 に 表 示 されます Cycle# 測 定 サイクル 番 号 Curve カーブタイプ Ligand リガンド 名 Sample アナライト 名 Dilution factor 希 釈 倍 率 Flow (μl/min) 測 定 流 速 Initial rate prel (RU/s) 添 加 開 始 10 秒 後 の 5 秒 幅 における 結 合 速 度 ( 自 動 計 算 されます) QC ratio prel QC 比 ( 自 動 計 算 されます) Temp ( ) 測 定 温 度 MW (Da) 分 子 量 D (m 2 /s) 測 定 温 度 における 拡 散 係 数 ( 自 動 計 算 されます) Blank used ブランクとして 利 用 しているセンサーグラムのサイクル 番 号

88 3. 濃 度 測 定 なお 画 面 上 部 の Expand all cycles のチェックを 外 すと サンプル 情 報 表 の 表 示 がサンプル 名 別 のリストに 変 更 します リファレンスセルを 差 し 引 かないセンサーグラムで 解 析 する 場 合 には Use reference subtracted data のチェックを 外 します 画 面 左 下 の をクリックして ブランクを 確 認 します センサーグラムを 確 認 して エアーの 混 入 や 形 状 がおかしいブランクは 画 面 上 表 の Include のチェックを 外 します ブランクセルは 差 し 引 かなくても 解 析 は 可 能 です ブランクを 利 用 しない 場 合 には Include のすべてのチェックを 外 します 選 択 後 OK をクリックします 解 析 に 利 用 できるセンサーグラムを 選 択 します 補 足 3-18. CFCA に 利 用 するセンサーグラムの 選 択 基 準 CFCA では マストランスポートリミテーション 条 件 下 のセンサーグラムを 解 析 に 利 用 しま す 以 下 の 評 価 基 準 を 満 たすセンサーグラムを 解 析 に 利 用 します 1 低 流 速 の 初 期 速 度 (Initial rate ( RU / s ) )= 0.3~15 ( RU / s ) < 0.3 RU / s では レスポンスの 上 昇 量 が 低 いため 良 好 な 結 果 が 得 られません > 15 RU / s では マストランスポートリミテーションが 十 分 ではない 可 能 性 があります 2 QC ratio 0.13 < 0.13 の 場 合 には マストランスポートリミテーションが 十 分 ではありません

3. 濃 度 測 定 89 解 析 に 利 用 しないセンサーグラムは Include のチェックを 外 します 選 択 したセンサーグラムを 確 認 したい 場 合 には 画 面 中 央 の で 選 択 します をクリックしてセンサーグラムを 選 択 します Show blank subtracted data のチェックを 外 すと リファレンスセルと 差 し 引 き 前 のセンサーグラムを 確 認 できます 画 面 右 下 の Advanced settings>をクリックします 選 択 したセンサーグラムの 重 ね 書 きが 表 示 されます Apply settings to の Single Sample series にチェックを 入 れ

90 3. 濃 度 測 定 の をクリックしてサンプルを 選 択 すると 各 サンプルのセンサーグラムの 重 ね 書 きに 変 更 できます サンプル 添 加 開 始 3 秒 後 から 添 加 終 了 3 秒 前 の 範 囲 ( 青 いラインで 表 示 )で 解 析 します この 範 囲 にエアーの 混 入 などによるノイズが 確 認 できる 場 合 には 該 当 部 位 を 削 除 します ( 補 足 3-19 参 照 )Close >をクリックします Next>をクリックします 補 足 3-19. センサーグラムの 部 分 的 削 除 エアーの 混 入 などで センサーグラムが 乱 れている 部 分 は 以 下 の 方 法 で 削 除 します マウスの 左 ボタンをドラッグし 該 当 の 領 域 を 拡 大 した 後 マウスの 右 ボタンをドラッグ して 削 除 する 領 域 を 選 択 します 拡 大 図 を 解 除 する 場 合 は 白 い 部 分 をダブルクリックす ると 一 つ 前 の 縮 小 画 面 に 戻 ります 領 域 をクリックすると グラフ 右 上 の Remove Selection ボタンがアクティブになります ク リックすると 選 択 部 位 が 削 除 されます Undo をクリックすると 削 除 前 に 戻 ります

3. 濃 度 測 定 91 解 析 が 始 まります 解 析 が 終 了 すると 画 面 上 部 に 各 サンプルの 結 果 が 表 示 されます Meas. Conc ( M ) 解 析 によって 算 出 された 濃 度 をクリックすると 単 位 変 更 が 可 能 です

92 3. 濃 度 測 定 Calc. Conc ( M ) QC ratio Chi 2 ( RU 2 ) SE ( Meas. Conc ) 希 釈 倍 率 を Meas. Conc に 掛 けた 濃 度 QC 比 カイ 二 乗 Meas. Conc の 標 準 誤 差 解 析 結 果 の 評 価 については 補 足 3-20 を 参 照 してください Finish をクリックします 上 記 解 析 結 果 が Evaluation Explorer 中 のフォルダに 追 加 保 存 されます 補 足 3-20. CFCA の 解 析 結 果 の 評 価 以 下 の 基 準 を 満 たしている 場 合 には 良 好 な 結 果 と 判 断 できます 1 カーブフィッティングが 良 好 である フィッティングが 良 好 な 場 合 カーブフィッティングによって 得 られた 黒 色 のセンサー グラムが 測 定 センサーグラムと 一 致 します Chi 2 値 が 低 流 速 のセンサーグラムの 解 離 直 前 の 結 合 量 の 5% 以 下 であれば フィッティングが 良 好 と 判 断 できます 2 SE (standard error) が 解 析 結 果 濃 度 の 10% 以 下 SE が 算 出 濃 度 の 10% 以 下 であれば 問 題 ありません 3 解 析 結 果 濃 度 が 0.05~5 μg/ml の 範 囲 内 である 範 囲 外 の 場 合 には 1 2の 基 準 にパスしていても 結 果 の 取 り 扱 いに 注 意 が 必 要 です 補 足 3-21. ファイル 名 の 変 更 Evaluation Explorer 中 の 目 的 ファイルをクリックします 上 記 状 態 で キーボードの Backspace キーで ファイル 名 を 一 度 削 除 し 新 たに 新 規 ファ イル 名 を 入 力 します

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 93 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 熱 力 学 的 解 析 熱 力 学 的 パラメータは 分 子 同 士 の 相 互 作 用 メカニズム 解 析 に 対 して 重 要 な 情 報 を 提 供 し ます Biacore では 熱 力 学 的 パラメータは 複 数 の 温 度 条 件 で 速 度 論 的 相 互 作 用 解 析 を 実 施 することで 算 出 できます 平 衡 状 態 における 熱 力 学 的 パラメータ(ΔG ΔH ΔS ) のみならず 遷 移 状 態 における 熱 力 学 的 パラメータ(ΔG ΔH ΔS )も 算 出 する ことが 可 能 です 平 衡 状 態 におけるパラメータからは その 分 子 同 士 がその 強 さで 結 合 す る 理 由 遷 移 状 態 におけるパラメータからは その 分 子 同 士 がその 速 度 で 結 合 解 離 する 理 由 を 議 論 することができます 例 として ある 抗 原 (A)と 抗 体 ( 野 生 型 と 2 種 類 の 変 異 型 B)の 相 互 作 用 を 紹 介 します 通 常 の 速 度 論 的 解 析 では ある 温 度 で 相 互 作 用 測 定 を 実 施 し 算 出 された 反 応 速 度 定 数 の 比 較 から 野 生 型 と 変 異 型 の 結 合 および 解 離 速 度 の 違 いを 知 ることができます さらに 熱 力 学 的 解 析 の 結 果 からは 下 図 に 示 したように 変 異 型 2 のΔH とΔS が 野 生 型 および 変 異 型 1 のそれらとは 大 きく 異 なっていることがわかります すなわち 変 異 型 2 は 野 生 型 および 変 異 型 1 とは 異 なった 様 式 で 相 互 作 用 していることが 示 唆 されます 野 生 型 変 異 型 Response (RU) 13 C 45 C 13 C 21 C 29 C 37 C 45 C kj/mol Δ 60 40 20 0-20 -40-60 -80-100 Δ G ΔG A+B A--B AB wt mut 1 mut 2 kj/mol Δ 10 0 50 0-50 -100 ΔH ΔH A+B A--B AB wt mut 1 mut 2 kj/mol Δ 60 40 20 0-20 -40-60 -80-100 -TΔS ΤΔS A+B A--B AB wt mut 1 mut 2 A+B 混 合 時 A B 遷 移 時 AB 複 合 体 熱 力 学 的 パラメータの 解 析 手 順 数 段 階 の 温 度 (4 段 階 以 上 )において 同 一 分 子 間 のカイネティクス 解 析 を 実 施 し 解 離 定 数 (K D ) 反 応 速 度 定 数 (k a, k d )を 算 出 します 平 衡 状 態 遷 移 状 態 における 熱 力 学 的 パラメータ 算 出 には それぞれ 次 式 を 応 用 していま す 各 温 度 において 算 出 した 解 離 定 数 (K D ) 反 応 速 度 定 数 (k a, k d )を 代 入 します

94 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 平 衡 状 態 における 熱 力 学 的 パラメータ 算 出 van t Hoff 式 を 応 用 します 各 温 度 における 解 離 定 数 (K D )を 代 入 し 各 種 パラメータを 算 出 します 線 形 解 析 と 非 線 形 解 析 により 算 出 可 能 です 線 形 解 析 ΔG = RT lnk D ΔG = ΔH - TΔS lnk D = ΔH / RT - ΔS / R ΔG R T K D ΔH ΔS 自 由 エネルギー 変 化 (kj/mol) 気 体 定 数 絶 対 温 度 (K) 解 離 定 数 (M) エンタルピー 変 化 (kj/mol) エントロピー 変 化 (J/K mol) 非 線 形 解 析 ΔC p 熱 容 量 変 化 (kj/k mol) T 0 基 準 温 度 ( 標 準 状 態 では 25 ) 遷 移 状 態 における 熱 力 学 的 パラメータ 算 出 Eyring 式 を 応 用 します 各 温 度 における 反 応 速 度 定 数 (k a, k d )を 代 入 し 各 種 パラメータを 算 出 します k = ( k B T / h )exp( ΔS / R - ΔH / RT ) ln k / T = ΔS / R - ΔH / RT + ln kb / h k k B h ΔS R ΔH T ΔG 各 反 応 速 度 定 数 ボルツマン 定 数 プランク 定 数 エントロピー 変 化 (J/K mol) 気 体 定 数 エンタルピー 変 化 (kj/mol) 絶 対 温 度 (K) 自 由 エネルギー 変 化 (kj/mol)

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 95 4-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Assay Thermodynamics を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダに 保 存 されてい るプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラムをハイライト にして Open をクリックします 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します

96 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 Detection Flow path 2-1 もしくは 4-3 を 設 定 します Chip Chip type 利 用 するセンサーチップを 選 択 します Capture アナライトの 添 加 前 に 固 定 化 したキャプチャー 分 子 に 対 して リガンドを 捕 捉 する 場 合 にチェックを 入 れます リガンドは フローセル 2 もしくはフローセル 4 にキャプチャーされます Sample アナライトの 添 加 コマンドです Regeneration 再 生 が 必 要 な 場 合 にチェックを 入 れます 添 加 回 数 を 選 択 します (1 or 2) Carry Over アナライトのキャリーオーバーを 確 認 する 場 合 にチェックを 入 れます Next >をクリックします Conditioning Solution Contact time 再 生 溶 液 または 緩 衝 液 の 名 称 添 加 時 間 (s)

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 97 Number of injections 添 加 回 数 Startup Solution 指 定 した 溶 液 で 相 互 作 用 測 定 と 同 様 の 工 程 をアナラ イト 測 定 前 に 実 施 します 通 常 は ランニング 緩 衝 液 を 用 います Number of cycles サイクル 数 3 回 以 上 を 推 奨 します Solvent correction 低 分 子 化 合 物 がアナライトで 溶 媒 補 正 が 必 要 な 場 合 にチェックを 入 れます Number of injections 溶 媒 補 正 の 測 定 点 を 選 択 します 何 サンプルごとに 溶 媒 補 正 を 実 施 するかを Repeat after Sample cycles で 指 定 します Temperatures Analysis temperatures 検 出 部 位 の 温 度 を 設 定 します 25 を 真 ん 中 に 5 点 以 上 を 推 奨 します Sample compartment temperatures サンプルコンパートメントの 温 度 を 入 力 します Next >をクリックします Sample contact time アナライトの 添 加 時 間 120 s Flow rate 流 速 30 μl/min Dissociation time 解 離 時 間 120 s Extra wash after injection with アナライト 添 加 後 に 指 定 した 溶 液 で フローセル 以 外 の 流 路 を 洗 浄 したい 場 合 にチェックを 入 れます セン サーチップ 表 面 には 流 れません Regeneration Solution 再 生 溶 液 の 名 称

98 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 High viscosity solution 粘 性 の 高 い 溶 液 (40%エチレングリコール 以 上 )の 場 合 に 選 択 します Contact time 再 生 溶 液 の 添 加 時 間 60 s Flow rate 流 速 30 μl/min Stabilization period 添 加 後 のベースライン 安 定 化 時 間 0 s ( 必 要 に 応 じて 設 定 します) 入 力 後 Next >をクリックします Sample id アナライトの 名 称 MW (Da) アナライトの 分 子 量 Concentration アナライトの 濃 度 ( 単 位 も 選 択 ) 分 子 量 と 濃 度 を 入 力 すると 自 動 的 に モル 濃 度 nm と 重 量 濃 度 μg/ml を 換 算 します 入 力 後 Next >をクリックします 補 足 4-1. Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 の 入 力 Excel ファイルで 作 成 したサンプル 情 報 を 移 行 するには Excel での 保 存 時 タブ 区 切 りのテ キストファイル( 拡 張 子 は txt)を 選 択 します タブ 区 切 りで 保 存 したデータを 上 記 画 面 で 開 き コピーペーストで 入 力 します

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 99 測 定 を 始 める 前 の Prime before run および Normalize detector の 実 施 を 選 択 します 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 と 容 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックするとそ れに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイアルお よびサンプルをラックにセットします 補 足 4-2. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

100 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 補 足 4-3. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 別 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 を 設 定 することができます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 101 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックし ます 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します

102 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 設 定 温 度 に 達 するまで 上 記 ウインドウが 表 示 されます 設 定 温 度 に 達 すると 測 定 が 開 始 されます 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 します 補 足 4-4. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 103 4-2. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します 補 足 4-5. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword Table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします た だし リガンド 名 は 変 更 できません

104 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 補 足 4-6. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 105 各 温 度 における 解 離 定 数 (K D ) 反 応 速 度 定 数 (k a,k d )を 算 出 します 詳 細 は 基 本 操 作 編 -を 参 照 してください Toolbar の をクリックします 同 一 温 度 同 一 サンプル 名 のセンサーグラムがすべて 重 ね 書 き 表 示 されます Select Evaluation mode で Single mode を 選 択 します Next >をクリックします

106 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 濃 度 0 のセンサーグラムが ブランクとして 全 センサーグラムから 差 し 引 かれます Kinetics >をクリックします

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 107 Model:に 1:1 Binding を 選 択 します Fit をクリックします Finish をクリックします 上 記 解 析 結 果 が Evaluation Explorer 中 のフォルダに 追 加 保 存 されます ファイル 名 は 自 動 的 にサンプル 名 が 採 用 されます この 実 験 では 測 定 温 度 を 変 化 させて 同 一 サンプルで 同 様 の 実 験 を 行 うため どの 温 度 についての 解 析 結 果 も 同 一 ファイル 名 (サンプル 名 )で 保 存 されます 混 乱 を 避 けるため この 時 点 でファイル 名 を 変 更 することを 推 奨 します 補 足 4-7. ファイル 名 の 変 更 Evaluation Explorer 中 の 目 的 ファイルをクリックします 上 記 状 態 で キーボードの Backspace キーで ファイル 名 を 一 度 削 除 し 新 たに 新 規 ファ イル 名 を 入 力 します

108 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 同 様 に 別 の 温 度 の 測 定 データについても 解 析 します Toolbar の をクリックします Temperature 右 側 の をクリックします 温 度 を 変 更 し 反 応 速 度 定 数 (k a,k d )を 算 出 しま す すべての 温 度 について 解 析 終 了 後 Toolbar の をクリックします 自 動 的 に 全 解 析 結 果 がテーブルに 表 示 されます

4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 109 Import をチェックし Thermodynamics に 利 用 するデータを 選 択 します Check All をクリッ クするすると 全 データが 選 択 されます Next >をクリックします

110 4. 熱 力 学 的 パラメータの 算 出 温 度 に 対 する 解 離 定 数 反 応 速 度 定 数 のプロットが 表 示 されます Next >をクリックします から 線 形 解 析 (Linear)または 非 線 形 解 析 (Non-linear)を 選 択 します 選 択 した 解 析 手 法 の 結 果 が 表 示 されます すべての 熱 力 学 的 パラメータは 左 上 のテーブルに 表 示 されます Finish をクリックします 上 記 解 析 結 果 は Evaluation Explorer 中 の Thermodynamics フォルダに 追 加 されます ファ イル 名 は 自 動 的 にサンプル 名 が 採 用 されます

5. 結 合 アナライトの 回 収 111 5. 結 合 アナライトの 回 収 固 定 化 したリガンドに 対 して 結 合 したアナライトを 回 収 します 再 生 溶 液 を 添 加 し 溶 出 されたアナライトを 引 き 戻 すようにして 指 定 したバイアルに 回 収 します 1 回 の 回 収 容 量 は およそ 2 μl です 効 率 よく 回 収 するためには アナライトの 添 加 条 件 と 回 収 溶 液 の 条 件 が 重 要 となります アナライトの 添 加 条 件 できるだけ 高 濃 度 のアナライトを 用 いる 方 が 1 度 の 添 加 でより 効 率 よくアナライトを 回 収 することができます 特 に 低 親 和 性 の 結 合 ではアナライト 濃 度 が 回 収 率 に 大 きく 影 響 しま す 血 清 等 のアナライトの 添 加 では センサーチップ 表 面 へ 非 特 異 的 吸 着 が 生 じやすく 目 的 分 子 以 外 の 分 子 も 回 収 されます このような 場 合 には 希 釈 倍 率 をあげて 非 特 異 的 吸 着 を 低 減 させるなどの 検 討 が 必 要 となります また 1 度 に 回 収 される 量 は 微 量 であるため 結 合 量 から 何 回 程 度 繰 り 返 し 結 合 回 収 が 必 要 か 確 認 する 必 要 があります 回 収 溶 液 再 生 溶 液 が 回 収 溶 液 となります 再 生 できなければ アナライトを 回 収 することができな いので あらかじめ マニュアル 測 定 で 再 生 条 件 を 検 討 します 質 量 分 析 に 回 収 サンプルを 直 接 持 ち 込 む 場 合 は サンプルの 酸 性 化 が 必 要 です 低 濃 度 の 酸 は 結 合 したアナライトを 再 生 するのに 適 している 場 合 が 多 く 回 収 溶 液 に 0.5 % TFA や 0.1 % 酢 酸 を 利 用 すれば 回 収 サンプル 溶 液 を 直 接 質 量 分 析 で 解 析 することができます 質 量 分 析 の 前 に ZipTip(Millipore)などのマイクロ 逆 相 カラムで 精 製 する 場 合 には 回 収 溶 液 として アルカリ 溶 液 (50 mm NaOH など)も 使 用 できます 回 収 前 の 洗 浄 溶 液 相 互 作 用 測 定 時 の 緩 衝 液 には 質 量 分 析 を 阻 害 する 成 分 ( 例 ;NaCl Surfactant P20 DMSO リン 酸 緩 衝 液 など)が 多 く 含 まれています 回 収 サンプル 溶 液 中 への これらの 成 分 の 混 入 を 抑 えるために アナライト 添 加 直 前 にセンサー 表 面 や 流 路 を 洗 浄 する 必 要 があります その 洗 浄 溶 液 として 炭 酸 水 素 アンモニウムなどの 揮 発 性 の 緩 衝 液 が 用 いられます

112 5. 結 合 アナライトの 回 収 5-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Method アイコン( ます )または Menu bar の Run Method をクリックし Biacore Methods をダブルクリックします Inject and recover をハイライトにし Open をクリックします Method Builder の Main ダイアログが 表 示 されます Overview 画 面 にはメソッド 全 体 の 設 定 項 目 が 表 示 されます 以 下 に 変 更 項 目 について 記 載 します 詳 細 は 基 本 操 作 編 -を 参 照 してください

5. 結 合 アナライトの 回 収 113 General settings をクリックします

114 5. 結 合 アナライトの 回 収 1 2 3 4 5 6 1 Data collection rate 1Hz を 選 択 します 2 Detection Multi を 選 択 します 設 定 の 変 更 不 可 1 2 3 4 に 流 れます 3 Sample compartment temperature サンプルコンパートメントの 温 度 (4~45 )を 設 定 します 通 常 は 25 4 Concentration unit アッセイ 全 体 を 通 して 用 いる 濃 度 単 位 を 選 択 します 5 Buffer settings 使 用 するランニング 緩 衝 液 名 を 入 力 します 6 After run チェックを 入 れておくと 全 測 定 が 終 了 した 後 にセンサー 表 面 の 温 度 が 指 定 した 温 度 に 自 動 変 更 されます 設 定 後 Assay Steps をクリックします

5. 結 合 アナライトの 回 収 115 Surface conditioning をクリックする Number of replicates Times スタートアップの 測 定 回 数 を 指 定 します 3 回 以 上 を 推 奨 します Inject and Recover をクリックします

116 5. 結 合 アナライトの 回 収 Number of replicates Times 回 収 サイクルの 実 施 回 数 を 入 力 します Cycle Types をクリックし 次 画 面 に 移 動 します

5. 結 合 アナライトの 回 収 117 Inject and Recover をクリックします Sample solution アナライトの 名 称 Contact time アナライト 添 加 時 間 (s) Flow rate 流 速 (μl/min) Flow path 1, 2, 3, 4 変 更 不 可 Wash solution アナライト 添 加 前 のフローシステムの 洗 浄 溶 液 Recovery solution マニュアル 測 定 で 条 件 検 討 した 再 生 溶 液 を 入 力 します 回 収 溶 液 は ランニング 緩 衝 液 との 希 釈 を 防 ぐために エアーセグメントをはさんでフローセルに 添 加 されま す フローセルに 到 達 したところで 流 速 は 0 になり 接 触 時 間 (Incubation time) 分 留 まります Incubation time 回 収 溶 液 の 接 触 時 間 (s)を 入 力 します Deposition solution 回 収 溶 液 を 中 和 する 緩 衝 液 を 入 力 します また トリ プシンやプロテアーゼも 使 用 可 能 です アナライト 添 加 前 に 回 収 先 となるバイアルに 設 定 容 量 分 を 自 動 分 注 します Deposition solution volume 中 和 溶 液 の 分 注 量 (μl)を 指 定 します Number of repetitions 1 サイクル 中 の 添 加 回 収 回 数 を 入 力 します 最 大 10 回 まで 可 能 です 回 収 量 を 稼 ぎたい 場 合 に 設 定 します

118 5. 結 合 アナライトの 回 収 Conditioning をクリックします 回 収 サイクル 前 のセンサーチップのコンディショニング 条 件 を 設 定 します Regeneration solution 再 生 溶 液 を 入 力 します contact time 添 加 時 間 (s) Flow rate 流 速 (μl/min) Flow path 1, 2, 3, 4 を 選 択 します Setup Run をクリックします Flow path: Next >をクリックします 1, 2, 3, 4 を 選 択 します

5. 結 合 アナライトの 回 収 119 測 定 サイクルリストが 表 示 されます Next >をクリックします 測 定 を 始 める 前 の Prime および Normalize の 実 施 を 選 択 します Temperature settings Analysis temperature 25 Sample compartment temperature 25 Next >をクリックします

120 5. 結 合 アナライトの 回 収 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします

5. 結 合 アナライトの 回 収 121 補 足 5-1. 同 一 バイアルからのサンプリング 設 定 サンプル 位 置 は 同 一 サンプルであっても 添 加 回 数 分 分 注 して 配 置 されるように 組 ま れています( 例 えば 同 一 の Control Sample であっても R1A1 から R1A12 に 12 バイアルに 分 けてセットするように 指 示 されます) 同 一 サンプルを 同 バイアルから 使 用 したい 場 合 は プーリング 機 能 を 利 用 します Menu から Automatic Positioning を 選 択 します ここで すべてのサンプルと 試 薬 に 関 する 配 置 を 設 定 することができます Pooling の 項 目 は 通 常 Auto になっています 同 一 バイアルからサンプリングしたいサンプル 試 薬 の 種 類 について Pooling のプルダ ウンメニューから Yes を 選 択 し ダイアログ 右 下 の OK をクリックします なお Automatic Positioning ダイアログでは 色 やバイアルのサイズの 設 定 もできるので こ れらも 必 要 に 応 じて 適 宜 設 定 を 変 更 します

122 5. 結 合 アナライトの 回 収 Eject Rack をクリックして Rack tray port を 開 きます ラックトレイを 奥 まで 挿 入 し OK をクリックします Eject Rack Tray ダイアログが 閉 じた 後 Rack Positions ダイアログ 右 下 の Next >をクリックし ます 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリックします 設 定 したメソッドをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します

5. 結 合 アナライトの 回 収 123 Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 補 足 5-2. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 します 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

124 5. 結 合 アナライトの 回 収 回 収 のセンサーグラム エアー アナライト 添 加 セグメント フローシステムの 洗 浄 回 収 量 回 収 回 収 の 評 価 1,000 RU は 約 1 ng/mm 2 の 質 量 変 化 に 相 当 します 回 収 操 作 終 了 後 60 秒 後 に 結 合 レスポンス(bound)を 相 対 値 0 として 計 算 した 回 収 レス ポンス(recovered)が 得 られます 4 つのフローセルの 面 積 の 合 計 は 約 5.8 mm 2 なので 何 ng 回 収 できたかを 推 測 することができます 回 収 レスポンスは 測 定 結 果 のレポートポイ ントテーブルを 参 照 してください

6. 免 疫 原 性 試 験 125 6. 免 疫 原 性 試 験 人 体 が 異 質 なタンパク 質 にさらされると 免 疫 応 答 が 起 こります 慎 重 に 設 計 され 構 築 されたタンパク 質 治 療 薬 でも 異 質 なタンパク 質 としてみなされ 治 療 薬 を 認 識 する 抗 体 の 産 生 を 引 き 起 こすかもしれません このような 応 答 は 治 療 効 果 を 低 下 させ 場 合 によっ ては 生 命 に 係 わる 免 疫 反 応 を 惹 起 します 今 日 タンパク 質 治 療 薬 の 開 発 において 抗 薬 物 抗 体 (Anti drug Antibodies: 以 下 ADAs と 略 します) の 測 定 は 申 請 の 必 須 項 目 となっています を 用 いた ADAs の 検 出 では Drug-ADAs 複 合 体 を 一 時 的 に 解 離 した 状 態 で 測 定 する Merged Inject 法 または Double Mix 法 を 使 用 することで ADAs を 高 感 度 に 検 出 できます 血 中 に 存 在 する 薬 物 の 濃 度 や 抗 体 のアフィニティーに 関 係 なく 安 定 的 な ADAs の 検 出 を 行 うことができます さらに 免 疫 原 性 試 験 スキームとして 阻 害 法 による 擬 陽 性 の 確 認 試 験 ADAs のアイソタイプの 同 定 試 験 ADAs の 成 熟 度 ( 結 合 安 定 性 )の 確 認 試 験 がありま す Merged Inject 法 Drug ADAs 複 合 体 を 酸 性 化 することで ADAs を 薬 物 から 解 離 させた 後 薬 物 (リガンド) を 固 定 化 したフローセルに 流 れる 直 前 に 中 和 溶 液 と 混 合 してサンプル 溶 液 を 中 性 化 後 添 加 する 方 法 です フローセル 1 およびフローセル 2 を 通 る 間 に 中 和 溶 液 と 混 合 しますの で リガンドはフローセル 3 に 固 定 化 します ADAs の 結 合 速 度 が 速 く 中 和 後 薬 物 と 速 やかに 再 結 合 する 場 合 は Merged Inject 法 の 利 用 を 推 奨 します 図 1. Merged Inject 法 のイメージ

126 6. 免 疫 原 性 試 験 図 2. サンプル 中 の 薬 物 濃 度 変 化 における ADAs の 結 合 量 の 変 化 ( 酸 性 化 / 中 性 化 なし) 図 3. サンプル 中 の 薬 物 濃 度 変 化 における ADAs の 結 合 量 の 変 化 ( 酸 性 化 / 中 性 化 あり) Double Mix 法 Drug ADAs 複 合 体 をマイクロプレートのウェル 内 で 酸 性 化 および 中 和 後 にフローセルに 添 加 する 方 法 です ADAs の 結 合 速 度 が 遅 く 中 和 後 に 再 結 合 するまで 時 間 がかかる 場 合 や 酸 性 化 することで 薬 物 が 破 壊 され 複 合 体 形 成 の 可 能 性 がない 場 合 は Double Mix 法 が 利 用 できます 至 適 条 件 センサーチップ 固 定 化 量 を 確 保 して 非 特 異 吸 着 を 低 減 するため Sensor Chip CM5 の 使 用 を 推 奨 します リガンド 固 定 化 手 法 固 定 化 量 を 確 保 するため アミンカップリング 法 を 推 奨 します 固 定 化 フローセル Merged Inject 法 を 使 用 する 試 験 では Fc3 と 4 にリガンドを 固 定 化 してください (Fc4 では ADAs と 抗 原 が 再 結 合 して 感 度 が 低 下 することがあるため Fc3 での 評 価 を 推 奨 します ) リガンド 固 定 化 量 固 定 化 量 が 多 いほど 検 出 感 度 が 上 がります 150 kda 程 度 の 分 子 量 であれば 7,000 RU~15,000 RU の 固 定 化 量 を 目 指 してくださ い リファレンスの 差 し 引 き サンプル 添 加 後 の 結 合 レスポンスおよび 解 離 領 域 で 評 価 するた め 必 要 ありません ただし センサーチップ 表 面 への 非 特 異 的 吸 着 を 低 減 するためのサンプル 処 理 が 必 要 です ランニング 緩 衝 液 HBS-EP+を 推 奨 します

6. 免 疫 原 性 試 験 127 サンプルの 前 処 理 遠 心 またはフィルターろ 過 による 不 溶 性 成 分 の 除 去 が 必 要 です (Merged Inject 法 を 使 用 する 場 合 には 血 清 は 希 釈 せずに 使 用 しま す ) 非 特 異 吸 着 の 低 減 血 清 サンプルは 血 清 中 の 夾 雑 物 がセンサーチップ 表 面 のデキ ストランに 非 特 異 的 吸 着 します 非 特 異 的 吸 着 を 低 減 するため デキストラン(NSB Reducer;コード 番 号 BR-1006-91)をサン プル 溶 液 に 混 合 してください(Merged Injection 法 では 効 果 が 低 いため 使 用 しません) 終 濃 度 の 目 安 は 1 mg/ml です HBS-EP+ をランニング 緩 衝 液 として 使 用 していない 場 合 には HBS-EP+に 相 当 する 濃 度 の 塩 (150 mm NaCl) 界 面 活 性 剤 (0.05% Surfactant P20)を 混 合 してください コントロールサンプル ネガティブコントロールとして 薬 物 が 投 与 されていない 血 清 を 使 います ポジティブコントロールとして ネガティブコン トロールに 抗 体 を 添 加 したものを 使 います 繰 り 返 し 測 定 によ るリガンドの 失 活 が 起 きている 場 合 やリガンドへの 非 特 異 的 吸 着 が 起 きている 場 合 には それらの 因 子 についてネガティブコ ントロールおよびポジティブコントロールの 結 合 量 を 利 用 して 検 体 の 結 合 量 を 補 正 することができます 補 正 するためには 1 測 定 につき 4 回 コントロールの 測 定 を 実 施 してください ネ ガティブコントロールおよびポジティブコントロールは 1 種 類 あれば 十 分 です 温 度 設 定 Merged Injection 法 では 測 定 温 度 が 高 いと 酸 性 化 サンプルがフ ローセル 1 および 2 を 通 過 する 際 にセンサーチップ 表 面 に 非 特 異 的 吸 着 が 起 きます 温 度 が 低 い 程 センサーチップ 表 面 に 対 する 非 特 異 的 吸 着 を 抑 制 できるため Analysis temperature およ び Sample compertment temperature はいずれも 10 を 推 奨 しま す 通 常 の 添 加 および Double Mix 法 を 使 用 する 測 定 では Analysis temperature は 25 Sample compertment temperature は 10 を 推 奨 します ただし 10 で 沈 殿 する 緩 衝 液 成 分 や 再 生 溶 液 ( 例 : guanidine-hcl)を 使 用 する 際 には ご 注 意 ください

128 6. 免 疫 原 性 試 験 酸 性 化 中 和 溶 液 Merged Injection 法 酸 性 化 溶 液 ;0.12 M HCl, 0.1 % Surfactant P20 中 和 溶 液 ;1.3 M Tris-HCl, 0.05 % Surfactant P20, ph 8.5 固 体 の Tris-HCl を 終 濃 度 1.3 M になるよう 超 純 水 を 用 いて 溶 解 し 4 M NaOH を 用 いて ph 8.5 に 合 わせます 最 後 に Surfactant P20 を 加 えて 調 製 します 使 用 期 間 は 1 週 間 です Double Mix 法 酸 性 化 溶 液 ;0.12 M HCl, 0.1% Surfactant P20 中 和 溶 液 ;1.0 M Tris-HCl, 0.05% Surfactant P20, ph 8.0 固 体 の Tris-HCl を 終 濃 度 1.0 M になるよう 超 純 水 を 用 いて 溶 解 し 4 M NaOH を 用 いて ph 8.0 に 合 わせます 最 後 に Surfactant P20 を 加 えて 調 製 します 使 用 期 間 は 1 週 間 です 再 生 条 件 10 mm Gly-HCl ph1.5 2.5 の 範 囲 で 30 秒 添 加 することで 再 生 で きることが 多 いです ただし 条 件 検 討 は 必 須 です 条 件 検 討 で は ポジティブコントロールとして 使 用 している 抗 体 を 用 いてく ださい この 時 抗 体 はランニング 緩 衝 液 に 希 釈 したものを 用 い ます 再 生 条 件 が 決 定 できた 上 で 抗 体 をスパイクした 血 清 を 用 いて 再 生 条 件 の 確 認 を 行 ってください また 測 定 温 度 により 再 生 条 件 は 異 なるため 測 定 予 定 の 温 度 で 条 件 検 討 を 行 ってくだ さい なお 再 生 溶 液 添 加 後 には 20% isopropanol, 40 mm NaOH によ る Extra wash を 実 施 してください 血 清 の 流 路 への 吸 着 を 洗 浄 除 去 します 増 幅 試 薬 ADAs の 結 合 レスポンスが 小 さく 評 価 しにくい 場 合 は 2 次 抗 体 など 用 いて 結 合 量 を 増 幅 させることができます ADAs のア イソタイプやサブクラスなどが 不 明 な 場 合 は 考 えられるアイソ タイプやサブクラスに 対 する 2 次 抗 体 を 混 合 した 溶 液 を 用 いて ください リガンドとして 固 定 化 している 薬 物 が 抗 体 であれば 軽 鎖 の 種 類 に 応 じて 抗 human IgG lambda 抗 体 や 抗 human IgG kappa 抗 体 を 用 いることもできます システムのメンテナンス 測 定 終 了 ごとに Desorb を 実 施 してください 月 に 1 度 Desorb

6. 免 疫 原 性 試 験 129 and Sanitize およびシステムチェックを 実 施 してください Cut-off 値 の 計 算 方 法 ネガティブコントロールサンプルのレスポンスの 平 均 値 + SD ( 標 準 偏 差 )x 1.645 (ネガティブコントロールとして 95 % 信 頼 できる 値 として 計 算 した 場 合 の 式 となります 参 照 文 献 Mire-Sluis, A. R. Et al 2004, J. Immunol.Methods 289, 1-16)

130 6. 免 疫 原 性 試 験 6-1. スクリーニング 6-1-1. プログラムの 実 行 (Merged Inject 法 の 場 合 ) Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Immunogenicity Immunogenicity Screening を 選 択 した 後 New をクリックします 以 前 にプログラムを Methods and Templates フォルダに 保 存 している 場 合 は 右 側 の 一 覧 表 に 反 映 されます 同 じプログラムを 実 行 したい 場 合 は Open をクリックします 別 のフォルダ に 保 存 されているプログラムを 実 行 したい 場 合 は Browse をクリックし 目 的 のプログラ ムをハイライトにして Open をクリックします Acidification and neutralization にチェックします Next >をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 131 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します Enhancement および Regeneration の 回 数 は 条 件 に 合 わせて 設 定 します Next >をクリックします ダミーランを 設 定 します ダミー 用 のサンプルは ポジティブコントロールを 用 います 3 回 以 上 の 実 施 を 推 奨 します Next >をクリックします

132 6. 免 疫 原 性 試 験 それぞれの 項 目 における 溶 液 名 添 加 時 間 流 速 を 入 力 します ( 上 記 画 面 は 2 次 抗 体 の 添 加 2 種 類 の 再 生 溶 液 の 添 加 を 想 定 した 例 となります )Next >をクリックします サンプル 名 を 入 力 します Cut-off 値 を 決 めるためのネガティブコントロールサンプルは サンプル 名 に blank_と 入 力 すると 測 定 値 を 抽 出 するのに 便 利 です Run order を 設 定 し Next >をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 133 コントロールサンプルを 測 定 する 場 合 は Run control samples をチェックし さらに 繰 り 返 し 測 定 する 場 合 は Run control sample(s) every をチェックします 測 定 頻 度 は 10 サンプ ルもしくは 20 サンプル 毎 が 推 奨 です コントロールサンプル 名 を 入 力 し Next >をクリッ クします 温 度 が 低 いほど 非 特 異 吸 着 を 抑 制 できるため Analysis temperature および Sample compartment temperature いずれも 10 を 推 奨 します ただし 10 にすることで 沈 殿 する 溶 液 もあるため 注 意 が 必 要 です ( 例 ;guanidine-hcl は 10 で 沈 殿 します ) 最 後 に 測 定 の 流 れを 確 認 する 場 合 は Cycle Run List をクリックします Next >をクリックします

134 6. 免 疫 原 性 試 験 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 6-1. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

6. 免 疫 原 性 試 験 135 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリッ クします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save As で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

136 6. 免 疫 原 性 試 験 補 足 6-2. プログラムの 緊 急 停 止 Run Stop Run をクリックします ボックス 中 の Stop Run をクリックします 実 行 中 の 測 定 サイクルが 終 了 するまで 待 機 し 終 了 します 上 記 ウインドウが 開 いている 状 態 で ただちにプログラムを 終 了 したい 場 合 には 画 面 の 表 示 に 従 い キーボードの[Ctrl]キーと[Break]キーを 同 時 に 押 してください 終 了 した 時 点 までのデータが Evaluation Software に 移 行 されます

6. 免 疫 原 性 試 験 137 6-1-2. プログラムの 実 行 (Double Mix 法 の 場 合 ) 6-1-1 章 に 従 い Immunogenicity Screening ウィザードを 用 いてプログラムを 作 成 し 保 存 します 保 存 したウィザードを 用 いて メソッドによりプログラム 内 容 を 変 更 します Toolbar の Run Method アイコン( )または Menu bar の Run Method をクリックし ます ウィザードを 保 存 したフォルダを 指 定 し Show importable wizard templates をチェックしま す 目 的 のプログラムをハイライトにし Open をクリックします Method Builder の Main ダイアログが 表 示 されます Overview 画 面 にはメソッド 全 体 の 設 定 項 目 が 表 示 されます 以 下 に 変 更 項 目 について 記 載 します 詳 細 は 基 本 編 -を 参 照 してください

138 6. 免 疫 原 性 試 験 (Cycle Types) Sample コマンドの 設 定 を 変 更 します Setting for sample 1 内 の Type を Double mix に 変 更 し Acid solution および Neutralization soln の 項 目 に Double mix 時 の 推 奨 条 件 (128 ページ)を 入 力 します

6. 免 疫 原 性 試 験 139 6-1-3. データ 解 析 ウィザードもしくはメソッドを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します 補 足 6-3. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword Table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします

140 6. 免 疫 原 性 試 験 補 足 6-4. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

6. 免 疫 原 性 試 験 141 Toolbar の をクリックし を 選 択 します 画 面 下 部 に サイクルごとにおける 結 合 量 がプロットされます 赤 色 のプロットはコント ロール 黒 色 のプロットはサンプルです Settings Curve; Fc=3 を 選 択 します Report Point; 2 次 抗 体 を 利 用 して 結 合 量 を 増 幅 している 場 合 は enhance_level 2 次 抗 体 を 使 用 していない 場 合 は stability を 選 択 します Regions & Boundaries Number of Regions; 評 価 基 準 の 数 を 設 定 します Boundary; 評 価 基 準 となる 数 値 を 入 力 します Region Name; 評 価 基 準 に 対 するカテゴリーごとの 名 称 を 入 力 します Finish をクリックします 補 足 6-5. コントロールサンプルによる 結 合 量 補 正 経 時 的 にリガンドが 失 活 する 場 合 や 再 生 条 件 が 不 十 分 な 場 合 には サイクルごとにリガ ンドの 結 合 キャパシティーが 低 下 しています コントロールサンプルを 定 期 的 に 測 定 して いる 場 合 には コントロールサンプルの 結 合 量 低 下 が 確 認 できます この 場 合 結 合 量 の ランキングを 正 確 に 把 握 できません 正 確 なランキングを 行 うためには コントロールサ ンプルの 結 合 量 に 基 づき リガンドの 最 大 結 合 量 を 考 慮 し 結 合 量 を 補 正 します Adjustment for Controls...をクリックします

142 6. 免 疫 原 性 試 験 Adjustment settings Use adjustment for controls にチェックします Positive control; 利 用 するポジティブコントロールを 選 択 します Negative control; 利 用 するネガティブコントロールを 選 択 します Fitting function; フィッティングに 利 用 する 式 を 選 択 します Linear( 線 形 式 )または Polynomial( 多 項 式 )を 選 択 します ウインドウ 右 側 に 補 正 後 のプロットが 表 示 されます ポジティブコントロールのフィッテ ィングラインが Y 軸 =100 で ネガティブコントロールのフィッティングラインが Y 軸 =0 で 表 示 されます OK をクリックすると 補 正 後 のプロットが 表 示 されます

6. 免 疫 原 性 試 験 143 評 価 基 準 で 設 定 した 値 にラインが 引 かれます 同 時 に 右 表 には 評 価 基 準 に 対 して 属 す るカテゴリーの 名 称 が Ranking カラムに 入 力 されます 上 段 のカラム( 囲 み)をクリック すると 昇 順 および 降 順 の 並 び 替 えが 可 能 です

144 6. 免 疫 原 性 試 験 6-2. 阻 害 法 を 利 用 した ADAs の 同 定 スクリーニングで 陽 性 だったサンプルについて 阻 害 法 によって ADAs の 同 定 をおこないま す サンプルおよびサンプルに 薬 物 を 混 合 した 溶 液 を 薬 物 固 定 化 表 面 に 添 加 して 結 合 量 の 低 下 の 有 無 から ADAs を 同 定 します 添 加 はダイレクト 法 を 使 用 します 6-2-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Immunogenicity Immunogenicity Confirmation を 選 択 した 後 New をクリックします 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します Enhancement および Regeneration の 回 数 は 条 件 に 合 わせて 設 定 します Next >をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 145 ダミーランを 設 定 します ダミー 用 のサンプルは ポジティブコントロールを 用 います 3 回 以 上 の 実 施 を 推 奨 します Next >をクリックします 測 定 直 前 に サンプルに 緩 衝 液 または 薬 物 を 混 合 します Sample 項 目 では Cycles without drug には Buffer を Cycles with drug には 薬 物 名 を 入 力 します Fraction では 混 合 比 率 を 入 力 します サンプル 添 加 条 件 および 再 生 条 件 を 入 力 し Next>をクリックします

146 6. 免 疫 原 性 試 験 サンプル 名 を 入 力 します Next>をクリックします コントロールサンプルを 測 定 する 場 合 は Run control samples をチェックし さらに 繰 り 返 し 測 定 する 場 合 は Run control sample(s) every をチェックします 測 定 頻 度 は 10 サンプ ルもしくは 20 サンプル 毎 が 推 奨 です コントロールサンプル 名 を 入 力 し Next >をクリッ クします

6. 免 疫 原 性 試 験 147 測 定 の 流 れが 表 示 されます Next>をクリックします Sample compartment temperature は 10 を 推 奨 します ただし 10 にすることで 沈 殿 す る 溶 液 もあるため 注 意 が 必 要 です ( 例 ;guanidine-hcl は 10 で 沈 殿 します ) 最 後 に 測 定 の 流 れを 確 認 する 場 合 は Cycle Run List をクリックします Next >をクリック します

148 6. 免 疫 原 性 試 験 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします Next>をクリックします 補 足 6-6. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

6. 免 疫 原 性 試 験 149 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリッ クします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

150 6. 免 疫 原 性 試 験 6-2-2. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します 補 足 6-7. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword Table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 151 補 足 6-8. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

152 6. 免 疫 原 性 試 験 Toolbar の をクリックし を 選 択 します ADAs を 同 定 するためには 薬 物 を 混 合 したときの 結 合 量 と 薬 物 を 混 合 していないときの 結 合 量 を 比 較 する 必 要 があります それぞれのプロットデータを 作 成 して 比 較 をおこない ます 上 記 画 面 では 左 が 薬 物 混 合 時 のプロットデータ 右 が 薬 物 を 混 合 していないときのプロ ットデータです それぞれ 評 価 基 準 を 設 けます Settings Curve; 評 価 するフローセルを 選 択 します Report Point; 2 次 抗 体 を 利 用 して 結 合 量 を 増 幅 している 場 合 は enhance_level 2 次 抗 体 を 使 用 していない 場 合 は stability を 選 択 します Show sample cycles mixed with;にて 薬 物 混 合 有 り 無 しを 選 択 します Regions & Boundaries Number of Regions; 評 価 基 準 の 数 を 設 定 します Boundary; 評 価 基 準 となる 数 値 を 入 力 します Region Name; 評 価 基 準 に 対 するカテゴリーごとの 名 称 を 入 力 します Highおよび low を 使 用 すると 便 利 です コントロールサンプルによる 結 合 量 補 正 については 補 足 6-5 を 参 照 してください Finish をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 153 評 価 基 準 で 設 定 した 値 にラインが 引 かれます 同 時 に 右 表 には 評 価 基 準 に 対 して 属 す るカテゴリーの 名 称 が Ranking カラムに 入 力 されます 上 記 画 面 は 薬 物 混 合 時 の 結 果 を 表 していますので low と 表 示 されているサンプルが 評 価 対 象 となります 次 に 薬 物 を 混 合 していないときの 結 合 量 を 評 価 します 上 記 画 面 は 薬 物 を 混 合 していないときの 結 果 を 表 しています high と 表 示 されているサ ンプルが 評 価 対 象 となります 薬 物 混 合 時 の 評 価 が low 薬 物 を 混 合 していない 時 の 評 価 が high のサンプルが ADAs 陽 性 サンプルです

154 6. 免 疫 原 性 試 験 6-3. ADAs のアイソタイプの 同 定 アイソタイプの 同 定 は サンプル 添 加 後 引 き 続 きアイソタイプを 認 識 する 抗 体 を 添 加 し て 結 合 の 有 無 で 判 断 します 6-3-1. プログラムの 実 行 (Merged Inject 法 の 場 合 ) Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま Immunogenicity Immunogenicity Isotyping を 選 択 した 後 New をクリックします Merged Inject 法 を 使 用 する 場 合 は Acidification and neutralization にチェックします 酸 性 化 および 中 和 をしない 場 合 は Direct analysis にチェックします Next >をクリックし ます 以 降 Direct analysis を 用 いて 説 明 します

6. 免 疫 原 性 試 験 155 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します Use reagent(s) per cycle カラムから アイ ソタイプを 同 定 するための 抗 体 の 数 を 選 択 します Regeneration の 回 数 は 条 件 に 合 わせて 設 定 します Next >をクリックします ダミーランを 設 定 します 3 回 以 上 の 実 施 を 推 奨 します Next >をクリックします

156 6. 免 疫 原 性 試 験 それぞれの 項 目 における 溶 液 名 添 加 時 間 流 速 を 入 力 します (Merged Inject 法 を 最 初 に 選 択 している 場 合 は Sample 画 面 に Acidification solution カラムと Neutralization solution カラムが 表 示 されます ) Next >をクリックします サンプル 名 を 入 力 します Next >をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 157 アイソタイプ 同 定 のための 抗 体 名 を 入 力 します Next >をクリックします 測 定 の 流 れが 表 示 されます Next>をクリックします

158 6. 免 疫 原 性 試 験 Analysis temperature および Sample compartment temperature を 設 定 します Analysis temperature および Sample compartment temperature は 10 を 推 奨 します ただし 10 にすることで 沈 殿 する 溶 液 もあるため 注 意 が 必 要 です ( 例 ;guanidine-hcl は 10 で 沈 殿 します ) 最 後 に 測 定 の 流 れを 確 認 する 場 合 は Cycle Run List をクリックします Next >をクリックします 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします

6. 免 疫 原 性 試 験 159 補 足 6-9. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリッ クします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

160 6. 免 疫 原 性 試 験 6-3-2. プログラムの 実 行 (Double Mix 法 の 場 合 ) 6-3-1 章 に 従 い Immunogenicity Isotyping ウィザードを 用 いてプログラムを 作 成 し 保 存 し ます 保 存 したウィザードを 用 いて メソッドによりプログラム 内 容 を 変 更 します Toolbar の Run Method アイコン( )または Menu bar の Run Method をクリックし ます ウィザードを 保 存 したフォルダを 指 定 し Show importable wizard templates をチェックしま す 目 的 のプログラムをハイライトにし Open をクリックします Method Builder の Main ダイアログが 表 示 されます Overview 画 面 にはメソッド 全 体 の 設 定 項 目 が 表 示 されます 以 下 に 変 更 項 目 について 記 載 します 詳 細 は 基 本 編 -を 参 照 してください

6. 免 疫 原 性 試 験 161 (Cycle Types) Sample コマンドの 設 定 を 変 更 します Settings for Sample 1 内 の Type を Double mix に 変 更 し Acid solution および Neutralization soln の 項 目 に Double mix 時 の 推 奨 条 件 (128 ページ) を 入 力 します 2 次 抗 体 添 加 のコマンドを 追 加 します Enhancement コマンドを2 次 抗 体 の 数 だけ 追 加 して 詳 細 条 件 を 入 力 してください

162 6. 免 疫 原 性 試 験 6-3-3. データ 解 析 ウィザードを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します 補 足 6-10. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword Table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 163 補 足 6-11. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

164 6. 免 疫 原 性 試 験 Toolbar の をクリックし を 選 択 します Curve; 目 的 のフローセルを 選 択 します Sample Cut-Off; サンプル 結 合 量 の Cut-Off 値 を 入 力 します 棒 グラフは 2 次 抗 体 の 結 合 レスポンスを 表 示 しています 上 記 画 面 では 抗 IgM 抗 体 が 赤 色 抗 IgG 抗 体 が 緑 色 で 表 示 されています それぞれの 結 合 レスポンスにおける Cut-Off 値 を 画 面 下 のテーブルに 入 力 し Finish をクリックします サンプル 結 合 量 が Cut-off 値 を 超 えているサンプルが 抽 出 されて 2 次 抗 体 の 結 合 量 が 棒 グ ラフで 表 示 されます また 2 次 抗 体 について Cut-off 値 を 超 えている 場 合 は テーブルの 数 値 が 緑 色 で 表 示 されます

6. 免 疫 原 性 試 験 165 6-4. ADAs の 成 熟 度 の 確 認 一 般 的 に ADAs の 成 熟 度 の 確 認 方 法 として ADAs のアフィニティーを 評 価 します しかし ADAs の 正 確 なモル 濃 度 が 分 からない 場 合 は カイネティクス 解 析 およびアフィニティー 解 析 は 不 可 能 です このため 濃 度 情 報 が 反 映 されない 解 離 領 域 から 薬 物 に 対 する ADAs の 結 合 量 の 半 減 期 を 算 出 することで ADAs の 成 熟 度 を 評 価 します 6-4-1. プログラムの 実 行 Toolbar の Run Wizard アイコン( す )または Menu bar の Run Wizard をクリックしま 専 用 のウィザードがないため Screening ウィザードを 使 用 します Immunogenicity Immunogenicity Screening を 選 択 した 後 New をクリックします Direct analysis にチェックします 成 熟 度 の 評 価 では Merged Inject は 使 用 しません Next >をクリックします

166 6. 免 疫 原 性 試 験 1 サイクル 分 の 測 定 シークエンスを 設 定 します Enhancement および Regeneration の 回 数 は 条 件 に 合 わせて 設 定 します Next >をクリックします ダミーランを 設 定 します 3 回 以 上 の 実 施 を 推 奨 します Next >をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 167 それぞれの 項 目 における 溶 液 名 添 加 時 間 流 速 を 入 力 します サンプルの 解 離 時 間 は 解 離 領 域 をカーブフィッティングさせるため 120 秒 以 上 設 定 してください Next >をクリックします サンプル 名 を 入 力 します Run order を 設 定 し Next >をクリックします

168 6. 免 疫 原 性 試 験 コントロールサンプルを 測 定 する 場 合 は Run control samples をチェックし さらに 繰 り 返 し 測 定 する 場 合 は Run control sample(s) every をチェックします Next >をクリックします Analysis temperature および Sample compartment temperature の 温 度 を 設 定 します Sample compartment temperature の 温 度 は 10 を 推 奨 しますが 10 で 沈 殿 する 溶 液 もあるため 注 意 が 必 要 です ( 例 ;guanidine-hcl は 10 で 沈 殿 します ) 最 後 に 測 定 の 流 れを 確 認 する 場 合 は Cycle Run List をクリックします Next >をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 169 右 側 の 表 でサンプルの 位 置 とサンプル 量 (μl)を 確 認 します 表 中 のサンプルをクリックす るとそれに 対 応 するラック 上 の 位 置 が 強 調 表 示 されます 位 置 と 容 量 を 確 認 しながらバイ アルおよびサンプルをラックにセットします 補 足 6-12. サンプル 位 置 の 変 更 サンプル 位 置 は 上 記 画 面 に 切 り 替 わった 時 点 で 自 動 的 に 設 定 されます あらかじめサン プル 位 置 が 決 まっているプレートを 使 用 する 場 合 は 画 面 左 下 の Menu Export Positions を 実 行 し サンプル 位 置 をタブ 区 切 りのテキストファイルとして 保 存 します 必 要 事 項 を 変 更 した 後 ファイルを 保 存 し Menu Sample Position Import でそのファイルを 読 み 込 む と サンプル 位 置 が 変 更 されます

170 6. 免 疫 原 性 試 験 基 本 的 な 注 意 事 項 測 定 時 間 必 要 なランニング 緩 衝 液 量 が 表 示 されます Start をクリッ クします 設 定 したウィザードをテンプレートとして 保 存 するかどうか メッセージが 表 示 されます 保 存 の 場 合 は Save as で Methods and Templates フォルダまたは Bia Users の 各 自 のフォル ダに 保 存 します 保 存 しない 場 合 は Don t Save を 選 択 します Save in:に 測 定 結 果 の 保 存 先 を 設 定 し File name にファイル 名 を 入 力 して Save すると 測 定 がスタートします 測 定 終 了 後 装 置 は Standby flow 状 態 になります 測 定 データは 入 力 したファイル 名 で 自 動 に 保 存 され Evaluation Software が 自 動 的 に 起 動 して 各 サイクルの 測 定 結 果 が 重 ね 書 き 表 示 されます

6. 免 疫 原 性 試 験 171 6-4-2. データ 解 析 ウィザードもしくはメソッドを 用 いた 測 定 プログラム 終 了 後 Evaluation ソフトウェアは 自 動 的 に 立 ち 上 がり 取 得 データは 解 析 に 向 け 移 行 します 補 足 6-13. サンプル 情 報 の 変 更 サンプル 濃 度 および 濃 度 単 位 サンプルの 名 称 など 入 力 ミスがあった 場 合 は 解 析 を 実 行 する 前 に Keyword table で 変 更 します Tools Keyword Table をクリックします

172 6. 免 疫 原 性 試 験 補 足 6-14. 画 面 の 説 明 Menubar Toolbar Sensorgram window Evaluation Explorer Work area Menubar Toolbar Evaluation Explorer Sensorgram すべての 作 業 コマンドを 含 む 各 種 メニュー 表 示 使 用 頻 度 の 高 い 作 業 コマンドをアイコン 化 して 表 示 すべての 測 定 データ 解 析 後 のデータの 表 示 測 定 により 取 得 したセンサーグラム Plot 測 定 時 に 取 得 したレポートポイント 名 別 のプロット Work area Baseline Binding level Binding stability Binding to reference サンプル 添 加 直 前 の AbsResp サンプル 添 加 時 の Baseline からの RelResp サンプル 添 加 直 後 の Baseline からの RelResp リファレンスセルに 対 する Binding level Evaluation Explorer で 選 択 したファイルを 表 示

6. 免 疫 原 性 試 験 173 Toolbar の をクリックし を 選 択 します ここでは 結 合 量 ランキングのための 設 定 をおこないます Settings Curve; 評 価 するフローセルを 選 択 します Report Point; stability を 選 択 します Response Type; Relative Response を 選 択 します Regions & Boundaries Number of Regions; 評 価 基 準 の 数 を 設 定 します Boundary; 評 価 基 準 となる 数 値 を 入 力 します Region Name; 評 価 基 準 に 対 するカテゴリーごとの 名 称 を 入 力 します Next >をクリックします

174 6. 免 疫 原 性 試 験 前 画 面 で 設 定 した 評 価 基 準 値 以 上 の 結 合 量 のサンプルについて 解 析 結 果 が 画 面 下 のテー ブルに 表 示 されます 評 価 基 準 の 最 小 値 より 小 さいと 評 価 されたサンプルに 関 しては 自 動 的 に 解 析 から 除 外 されます 画 面 上 には 各 サイクルの Slow Fraction(%)がプロットさ れています 解 析 モデルの 詳 細 は 補 足 6-15 をご 参 照 ください RelResp Tot (RU); Fast Fraction (%); Slow Fraction (%); t 1/2 Fast (s); t 1/2 Slow (s); 解 離 直 後 の 結 合 レスポンス 全 結 合 抗 体 に 対 する 解 離 が 速 い 抗 体 の 割 合 全 結 合 抗 体 に 対 する 解 離 が 遅 い 抗 体 の 割 合 解 離 が 速 い 抗 体 の 半 減 期 解 離 が 遅 い 抗 体 の 半 減 期 プロットデータ 上 部 のスライダーでは プロットに 表 示 される Slow Fraction の t 1/2 の 下 限 値 の 設 定 ができます 入 力 した 時 間 ( 上 記 画 面 の 場 合 10 秒 )より t 1/2 が 長 いサンプルが プ ロットデータに 反 映 されます Plot settings で 表 示 方 法 を 変 更 することが 可 能 です Finish をクリックします

6. 免 疫 原 性 試 験 175 補 足 6-15. 解 離 領 域 の 反 応 モデル 式 および 半 減 期 の 計 算 方 法 免 疫 応 答 において 産 生 される 抗 体 は カイネティクスプロパティが 異 なる 抗 体 が 混 在 して いることが 予 測 されます しかし 既 存 の 反 応 モデル 式 では 混 在 している 個 々の 抗 体 を 評 価 することができません そのため 抗 体 の 成 熟 度 試 験 では 2 つの 独 立 した 解 離 成 分 を 含 んだ 解 離 反 応 モデル(two-component model)を 使 用 して 解 離 領 域 のみを 解 析 すること で 評 価 します ただし このモデルは 2 つの 明 確 に 異 なる 抗 体 が 存 在 することを 証 明 するものではなく あくまでも 速 い 解 離 の 抗 体 遅 い 解 離 の 抗 体 の 優 位 性 の 観 点 から 免 疫 応 答 を 分 類 する ための 評 価 ツールです 解 離 領 域 におけるカーブフィッティングのモデル 式 は 次 の 通 りです R = R 1 x e -kd1 ( t - t0 ) + R 2 x e-kd2 ( t - t0 ) R; t (s)における 結 合 レスポンス k d1 および k d2 ; 解 離 速 度 定 数 R 1 および R 2 ; k d1 および k d2 を 求 める 際 の 解 離 領 域 開 始 レスポンス また t 1/2 ( 半 減 期 )の 計 算 式 は 下 記 になります t 1/2 は 複 合 体 の 量 ( 抗 体 結 合 量 )が 50% 低 減 するのに 必 要 な 時 間 ( 秒 )です t 1/2 = ln2 / k d

索 引 索 引 A ADAs... 125, 126, 128, 144, 152, 153, 154, 165 Add Solvent Correction... 36 Adjustment for controls... 14 After run... 69, 114 Analysis temperature... 5, 27, 49, 97, 119 Anti drug Antibodies... 125 Assay Steps... 69, 114 B Baseline... 11, 35, 42, 55, 86, 104, 140, 151, 163, 172 Binding level... 11, 12, 35, 55, 86, 104, 140, 151, 163, 172 Binding to reference... 11, 17, 35, 42, 55, 86, 104, 140, 151, 163, 172 Buffer settings... 69, 114 C Calibration Curve... 47 Calibration points... 47 Capture... 2, 24, 45, 96 Carry Over...24, 42, 96 CFCA... 63 Concentration... 26, 44, 47, 56, 58, 61, 69, 98, 114 Concentration Analysis... 44, 56, 58, 61 Concentration unit... 69, 114 Conditioning... 24, 96, 118 Contact time... 4, 24, 25, 46, 73, 74, 96, 97, 98, 117, 118 Control sample definition... 27, 48 Control samples... 27, 48 Custom Report Point... 18, 61 Cut-off... 129, 132, 164 Cycle Run List... 6, 27, 49 Cycle Types... 72, 116 D Data Collection rate... 69, 114 Deposition solution... 117 Deposition solution volume... 117 Detection... 2, 24, 45, 69, 96, 114

索 引 Dissociation time... 4, 25, 73, 74, 97 DMSO... 20, 21, 22, 39, 111 Double Mix... 126, 137, 160 E Eject Rack Tray... 8, 30, 52, 82, 101, 122 Enhancement... 2, 45, 131, 144, 166 Exclude Curve... 60 Exclude Cycle... 59 Exclude point... 37 Extra wash after injection with... 25, 97 Extrapolate... 39 F Fitting Function... 56 Flow path... 2, 24, 45, 73, 74, 77, 96, 117, 118 Flow rate... 4, 25, 46, 73, 74, 97, 98, 117, 118 Fraction... 46 G General... 68, 113 General Settings... 68 H High viscosity solution... 4, 46, 98 I Immunogenicity... 130, 137, 144, 154, 160, 165 Include Curve... 60 Include Cycle... 59 Incubation time... 117 K ka... 93, 94, 105, 108 kd... 93, 94, 105, 108 KD... 20, 93, 94, 105 Keyword Table... 10, 34, 54, 85, 103, 139, 150, 162, 171 Kinetics/Affinity... 23 km... 63 M Merged Inject... 125, 130, 154, 156, 165 Mix with... 46

索 引 N Normalize... 5, 27, 49, 80, 99, 119 Number of cycles... 2, 25, 45, 97 Number of injections...24, 25, 97 Number of replicates... 70, 71, 72, 115, 116 O Overview... 68, 112, 137, 160 P Prime... 5, 27, 49, 80, 99, 119 R Ranking... 13 Recovery solution... 117 Regeneration... 2, 4, 24, 45, 46, 73, 74, 96, 97, 118 Repeat calibration every... 47 Repeat Control sample(s) every... 5 Report... 16, 40, 56, 62 Report point... 56 Report Point Table... 16 RI 21 S Sample compartment temperature... 5, 27, 49, 69, 97, 114, 119 Single mode... 105 Single-cycle Kinetics... 68 Solvent correction... 25, 38, 39, 97 Stabilization period... 4, 25, 98 Standby flow... 9, 31, 52, 83, 102, 123, 135, 149, 159, 170 Startup... 2, 24, 42, 45, 70, 73, 97 Stop Run... 9, 31, 53, 84, 102, 123, 136 T t1/2... 174, 175 Type... 73, 74 U Use average calibration curve... 56 V van t Hoff... 94 Verification... 76

索 引 W Wash solution... 117 あ アイソタイプ... 125, 154, 155, 157 か 回 収... 111, 117, 124 拡 散 係 数... 63, 65 き キャリーオーバーチェック... 32, 42 緊 急 停 止... 9, 31, 53, 84, 102, 123, 136 く グラフ 化... 19 け 結 合 量 補 正... 14, 141, 152 検 量 線... 43, 47, 56, 57, 59, 60, 63 検 量 線 不 要 の 濃 度 測 定... 63 こ 抗 薬 物 抗 体... 125 コントロールサンプル... 4, 5, 12, 13, 14, 17, 26, 27, 48, 61, 127, 129, 132, 133, 141, 146, 152, 168 さ 最 大 結 合 量... 14, 141 酸 性 化 溶 液... 128 サンプリング 設 定... 7, 29, 51, 81, 100, 121 サンプル 情 報 の 入 力... 5, 27, 49, 98 サンプル 位 置 の 変 更... 7, 28, 50, 80, 99, 134, 148, 159, 169 サンプル 情 報 の 変 更... 10, 34, 54, 85, 103, 139, 150, 162, 171 し 初 期 結 合 速 度... 63 す スクリーニング... 1, 40, 41 せ 成 熟 度 の 確 認... 165 線 形 解 析... 94, 110 そ 増 幅 試 薬... 128

索 引 阻 害 法... 43, 46, 125, 144 測 定 ポイントの 削 除... 37, 59 ち 中 和 溶 液... 117, 125, 128 直 接 法... 43 て 低 分 子 化 合 物... 20 デキストラン 溶 液... 127 と 同 定... 144, 152, 154, 155, 157 ね 熱 力 学 的 パラメータ... 93, 94, 110 の 濃 度 測 定...43, 44, 63 は バルク... 21, 22 バルクレスポンス... 21, 32 半 減 期... 165, 174, 175 ひ 非 線 形 解 析... 94, 110 非 特 異 吸 着... 42, 126, 127, 133 ふ ファイル 名 の 変 更... 92, 107 フィッティング... 15, 43, 142 複 数 サンプルの 連 続 添 加... 3 分 子 量 補 正...14, 40, 41 ほ ポジティブコントロール... 13, 15, 42, 127, 128, 131, 142, 145 ま 摩 擦 率... 65, 66 マストランスポート 係 数... 63, 64 マストランスポートリミテーション...63, 64, 88 マニュアル 測 定... 111, 117 め 免 疫 応 答... 125, 175 ゆ

索 引 有 機 溶 媒... 20 よ 溶 媒 補 正... 21, 22, 25, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 97 溶 媒 補 正 用 曲 線... 22, 36, 37, 38 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 延 長... 39 溶 媒 補 正 用 曲 線 の 削 除... 38 ら ランキング... 12, 14, 16, 40, 141 り リファレンスセル... 11, 17, 21, 22, 35, 39, 42, 45, 55, 86, 104, 140, 151, 163, 172 れ レポートポイント... 11, 16, 18, 32, 33, 35, 55, 56, 61, 62, 86, 104, 124, 140, 151, 163, 172 レポートポイントの 追 加... 18, 61

60

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