様 式 C-19 科 学 研 究 費 補 助 金 研 究 成 果 報 告 書 平 成 23 年 5 月 13 日 現 在 機 関 番 号 :12102 研 究 種 目 : 若 手 研 究 (B) 研 究 期 間 :2009 ~ 2010 課 題 番 号 :21700339 研 究 課 題 名 ( 和

様 式 C-19 科 学 研 究 費 補 助 金 研 究 成 果 報 告 書 平 成 23 年 5 月 13 日 現 在 機 関 番 号 :12102 研 究 種 目 : 若 手 研 究 (B) 研 究 期 間 :2009 ~ 2010 課 題 番 号 :21700339 研 究 課 題 名 ( 和 文 ) 脂 質 性 シグナルによる 神 経 回 路 網 形 成 の 分 子 機 構 研 究 課 題 名 ( 英 文 ) Functional roles of Lipid signaling in the neuronal network formation 研 究 代 表 者 長 谷 川 潤 (HASEGAWA HIROSHI) 筑 波 大 学 大 学 院 人 間 総 合 科 学 研 究 科 助 教 研 究 者 番 号 :10332230 研 究 成 果 の 概 要 ( 和 文 ):1)ホスファチジルイノシトール 4,5- 二 リン 酸 (PIP2)の 合 成 酵 素 であるホスファチジルイノシトール 4-リン 酸 5-キナーゼ(PIP5K)の 2 つのアイソザイム PIP5KA および PIP5KB のノックアウトマウスを 作 製 したところ これらの 酵 素 が 精 子 形 成 に 必 須 であることが 分 かった また 2)エタノールアミンキナーゼ-1により 合 成 されるホス ファチジルエタノールアミンが 神 経 突 起 の 伸 長 において 重 要 な 役 割 を 担 っていることが 分 か った 研 究 成 果 の 概 要 ( 英 文 ): 1) We developed the knockout mice of two isozymes of phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinases (PIP5KA and PIP5KB), which are phospholipid metabolizing enzymes to synthesize phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). From the analyses of these knockout mice, we found that PIP5KA and PIP5KB are crucial for spermatogenesis. 2) We also found that phosphatidylethanolamine and its synthetic enzyme, ethanolamine kinase-1, play an important role in neurite elongation. 交 付 決 定 額 ( 金 額 単 位 : 円 ) 直 接 経 費 間 接 経 費 合 計 2009 年 度 1,800,000 540,000 2,340,000 2010 年 度 1,600,000 480,000 2,080,000 年 度 年 度 年 度 総 計 3,400,000 1,020,000 4,420,000 研 究 分 野 : 神 経 生 物 学 科 研 費 の 分 科 細 目 : 神 経 科 学 神 経 科 学 一 般 キーワード: 細 胞 内 脂 質 神 経 細 胞 ホスファチジルイノシトール 4-リン 酸 5-キナーゼ ホ スファチジルエタノールアミン 1. 研 究 開 始 当 初 の 背 景 正 確 な 神 経 回 路 網 形 成 は 動 物 の 生 存 や 外 界 への 適 応 において 非 常 に 重 要 な 役 割 を 担 っている しかし そのような 正 確 な 神 経 回 路 網 形 成 の 分 子 メカニズムには 不 明 な 点 が 多 い 近 年 の 研 究 により 脂 質 性 シグナルが 神 経 回 路 網 形 成 に 重 要 な 役 割 を 担 っていること が 示 唆 されてきた (1)ホスファチジルイ ノシトール 4-リン 酸 5-キナーゼ(PIP2)は ホスホリパーゼ 類 や PI3K の 基 質 であるほか それ 自 身 がアクチン 細 胞 骨 格 や 細 胞 膜 蛋 白 質 の 調 節 を 担 うシグナル 伝 達 分 子 としても 機 能 する このような 多 様 な 生 理 機 能 を 持 つ PIP2 の 神 経 回 路 網 形 成 における 役 割 はほと んど 分 かっていない (2)また 現 在 注 目 を 集 めている 別 のシグナル 伝 達 脂 質 として ホスファチジルエタノールアミン(PE)があ

る PE は 細 胞 膜 の 主 要 構 成 成 分 の 一 つであ るが 細 胞 膜 内 層 と 外 層 のトランスポートを 介 して Rho ファミリー 低 分 子 量 G 蛋 白 質 の 調 節 などを 行 うことが 知 られている 本 分 子 に 関 しても 神 経 回 路 網 形 成 における 役 割 は 全 く 分 かっていない 2. 研 究 の 目 的 (1)PIP2 の 主 要 合 成 酵 素 であるホスファチ ジルイノシトール 4-リン 酸 5-キナーゼ (PIP5K)の2つのアイソザイム PIP5KA お よび PIP5KB のノックアウトマウスを 作 製 し これらの 酵 素 の 生 理 機 能 特 に 神 経 系 におけ る 機 能 を 明 らかにする (2) 発 生 期 神 経 細 胞 における PE および PE の 主 要 合 成 酵 素 の 一 つであるエタノールア ミンキナーゼ-1(Eki-1)の 細 胞 内 局 在 を 明 らかにするとともに これらの 分 子 の 神 経 突 起 伸 長 における 役 割 を 明 らかにする 3. 研 究 の 方 法 (1)PIP5KA および PIP5KB のノックアウ トマウスを 作 製 し 解 剖 学 的 および 行 動 学 的 解 析 を 行 う (2) 初 代 培 養 海 馬 神 経 細 胞 に Eki-1 の 過 剰 発 現 を 行 い 神 経 細 胞 の 形 態 を 観 察 する ま た PE に 特 異 的 に 結 合 する Ro09-0198 を 用 いて PE の 細 胞 膜 内 局 在 を 検 討 する 4. 研 究 成 果 (1) 我 々は PIP5KA と PIP5KB のノック アウトマウス(KO)および 両 者 のダブル KO (D-KO)を 作 製 した これらのマウスは 成 体 まで 成 長 可 能 であり 外 観 に 目 立 った 異 常 は 観 察 されなかった しかし 交 配 実 験 の 結 果 PIP5KA-および PIP5KB-KO の 雄 は 生 殖 能 力 が 減 弱 した 低 妊 孕 能 であり D-KO の 雄 は 完 全 に 不 妊 であることがわかった 野 生 型 精 巣 の 抗 体 染 色 により PIP5KA PIP5KB は 共 に Sertoli 細 胞 と 伸 長 精 子 細 胞 に 発 現 して いることが 分 かった D-KO 精 巣 切 片 所 見 か ら D-KO においては 伸 長 精 子 細 胞 数 が 少 な く その 結 果 精 子 数 が 減 少 していることが 明 らかとなった 一 方 精 祖 細 胞 や 精 母 細 胞 の 数 には 異 常 は 見 られなかった また D-KO では Sertoli 細 胞 と 伸 長 精 子 細 胞 の 細 胞 間 接 着 部 位 での F-actin の 集 積 が 低 く また 精 細 管 腔 内 に 異 常 な F-actin の 集 積 が 見 られたこ とから PIP5K の 欠 損 によりアクチン 細 胞 骨 格 系 が 調 節 不 全 となり 伸 長 精 子 細 胞 が 脱 落 していると 考 えられた D-KO マウスの 精 子 は 中 片 部 と 尾 部 の 形 態 に 異 常 を 呈 するとと もに 運 動 能 力 も 減 弱 しており 体 外 受 精 が 不 可 能 であった PIP5KA-KO の 精 子 中 片 部 も 同 様 の 形 態 異 常 を 示 すが その 表 現 系 は D-KO に 比 べれば 軽 微 であった 一 方 PIP5KB-KO の 精 子 には 顕 著 な 異 常 は 見 られ なかった これらの 結 果 から PIP5KA およ び PIP5KB が 精 子 形 成 に 必 須 であることが 明 らかとなった 一 方 これらの KO マウスが 痛 覚 および 味 覚 に 異 常 を 持 つかを 行 動 学 的 に 解 析 した し かし ホットプレートテスト テールイマー ジョンテスト 酢 酸 ライジングテスト 味 覚 テスト( 甘 味 および 塩 味 )のいずれにおいて も コントロールの 野 生 型 マウスとの 差 は 観 察 されなかった (2)マウス 初 代 培 養 海 馬 神 経 細 胞 に Eki-1 を 過 剰 発 現 させ 神 経 突 起 の 長 さを 計 測 した ところ 過 剰 発 現 細 胞 ではコントロール 細 胞 に 比 べて 神 経 突 起 が 有 意 に 長 いことが 分 か った また 多 くの 場 合 細 胞 膜 脂 質 二 重 層 の 内 層 に 存 在 する PE が 神 経 突 起 先 端 部 で は 外 層 に 露 出 していることが 分 かった この ような PE の 細 胞 膜 内 局 在 を 制 御 する 分 子 を 探 索 し IV 型 ATPase のうち ATP8 ATP9 ATP10 ファミリーの 分 子 が 発 生 期 の 神 経 細 胞 に 多 く 発 現 していることを 見 出 した また IV 型 ATPase の 補 因 子 である cdc50 ファミ リー 分 子 の 発 現 も 同 時 に 確 認 した 今 後 こ れらの 分 子 の 生 理 機 能 について 研 究 を 展 開 して 行 く 予 定 である 5. 主 な 発 表 論 文 等 ( 研 究 代 表 者 研 究 分 担 者 及 び 連 携 研 究 者 に は 下 線 ) 雑 誌 論 文 ( 計 9 件 ) 1, da Silva S, Hasegawa H, Scott A, Zhou X, Wagner AK, Han BX, Wang F Proper formation of whisker barrelettes requires periphery-derived Smad4-dependent TGFβ signaling Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 査 読 有, 2011, 108, 3395-3400 2, Akiyama M, Zhou M, Sugimoto R, Hongu T, Furuya M, Funakoshi Y, Kato M, Hasegawa H, Kanaho Y Tissue- and development-dependent expression of the small GTPase Arf6 in mice Dev. Dyn., 査 読 有, 2010, 239, 3416-3435 3, Funakoshi Y, Hasegawa H, Kanaho Y Regulation of PIP5K activity by Arf6 and its physiological significance J. Cell. Physiol., 査 読 有, 2010, 226, 888-895

4, Zhou X, Wang L, Hasegawa H, Amin P, Han BX, Kaneko S, He Y, Wang F Deletion of PIK3C3/Vps34 in sensory neurons causes rapid neurodegeneration by disrupting the endosomal but not the autophagic pathway Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 査 読 有, 2010, 107, 9424-9429 5, Hada K, Asahina M, Hasegawa H, Kanaho Y, Slack FJ, Niwa R The nuclear receptor gene nhr-25 plays multiple roles in the Caenorhabditis elegans heterochronic gene network to control the larva-to-adult transition Dev. Biol., 査 読 有, 2010, 344, 1100-1109 6, Suzuki A, Arikawa C, Kuwahara Y, Itoh K, Watanabe M, Watanabe H, Suzuki T, Funakoshi Y, Hasegawa H, Kanaho Y The scaffold protein JIP3 functions as a downstream effector of the small GTPase ARF6 to regulate neurite morphology of cortical neurons FEBS Lett., 査 読 有, 2010, 584, 2801-2806 7, Kanaho Y, Funakoshi Y, Hasegawa H Phospholipase D signalling and its involvement in neurite outgrowth. Biochem. Biophys. Acta, 査 読 有, 2009, 1791, 898-904 8, Rawlins EL, Okubo T, Xue Y, Brass DM, Auten RL, Hasegawa H, Wang F, Hogan BL The role of Scgb1a1+ Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar, epithelium Cell Stem Cell, 査 読 有, 2009, 4, 525-534 9, Nishikimi A, Fukuhara H, Su W, Hongu T, Takasuga S, Mihara H, Cao Q, Sanematsu F, Kanai M, Hasegawa H, Tanaka Y, Shibasaki M, Kanaho Y, Sasaki T, Frohman MA, Fukui Y Sequential Regulation of DOCK2 dynamics by two phospholipid during neurtrophil Science, 査 読 有, 2009, 324, 384-387 学 会 発 表 ( 計 24 件 ) 1, 長 谷 川 潤 杉 本 里 香 山 下 美 鈴 野 口 純 子 岡 田 理 沙 鵜 木 隆 光 船 越 祐 司 馬 場 忠 金 保 安 則 精 子 形 成 においてホスファチジルイノシト ール 4-リン 酸 5-キナーゼは 必 須 である 日 本 薬 学 会 第 131 年 会 2011 東 日 本 大 震 災 のため 要 旨 発 表 のみ 2, 鵜 木 隆 光 松 田 信 爾 掛 川 渉 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 柚 崎 通 介 リン 脂 質 キナーゼ PIP5KC661 と AP-2 複 合 体 の 結 合 はポストシナプス 可 塑 性 を 制 御 す る BMB2010 2010 年 12 月 7 日 3, 本 宮 綱 記 福 原 茂 朋 望 月 直 樹 鈴 木 輝 彦 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 低 分 子 量 G 蛋 白 質 Arf6 による 腫 瘍 血 管 形 成 制 御 BMB2010 2010 年 12 月 10 日 4, 木 下 雅 美 本 宮 綱 記 周 淼 秋 山 雅 博 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 肺 胞 の 機 能 維 持 における 低 分 子 量 Arf6 の 役 割 BMB2010 2010 年 12 月 10 日 5, 長 谷 川 潤 杉 本 里 香 山 下 美 鈴 野 口 純 子 岡 田 理 沙 鵜 木 隆 光 船 越 祐 司 馬 場 忠 金 保 安 則 ホスファチジルイノシトール 4-リン 酸 5-キ ナーゼ 欠 損 マウスにおける 精 子 形 成 不 全 第 52 回 日 本 脂 質 生 化 学 会 2010 年 6 月 15 日 森 秋 旅 館 ( 群 馬 県 渋 川 市 ) 6, 船 越 祐 司 樋 口 珠 美 佐 藤 隆 信 長 谷 川 潤 ARF6 による PIP5K アイソザイム 活 性 制 御 機 構 の 解 析 第 62 回 日 本 細 胞 生 物 学 会 大 会 2010 年 5 月 19 日 大 阪 国 際 会 議 場 7, 佐 藤 隆 信 本 宮 綱 記 坂 本 めぐみ 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 Phospholipase D はマウス 好 中 球 における 活 性 酸 素 産 生, 酵 素 放 出 には 必 須 でない 第 62 回 日 本 細 胞 生 物 学 会 大 会 2010 年 5 月 21 日 大 阪 国 際 会 議 場 8, Funakoshi Y, Higuchi T, Sato T, Hasegawa H, Kanaho Y Novel activation mechanism of PIP5Kc by the small GTPase ARF6 The 5 th Japan-Korea Conference in

Cellular Signaling for Young Scientists 平 成 21 年 11 月 24 日 ハウステンボス( 長 崎 ) 9, Okada R, Hasegawa H, Furuya Y, Funakoshi Y, Kanaho Y The role of PIP5K in wound healing The 5 th Japan-Korea Conference in Cellular Signaling for Young Scientists 平 成 21 年 11 月 25 日 ハウステンボス( 長 崎 ) 10, Higuchi T, Sato T, Hasegawa H, Funakoshi Y, Kanaho Y Isozyme specific activation of PIP5K by ARF6 The 5 th Japan-Korea Conference in Cellular Signaling for Young Scientists 平 成 21 年 11 月 25 日 ハウステンボス( 長 崎 ) 11, Suzuki A, Arikawa C, Kuwahara Y, Funakoshi Y, Kanaho Y, Hasegawa H Regulation of morphology by the small GTPase Arf6 is mediated by the interaction with a novel down stream effector, JIP3 International Symposium on Cellular Signaling 平 成 21 年 11 月 18-19 日 筑 波 大 学 12, Hongu T, Funakoshi Y, Hasegawa H, Kanaho Y Involvement of small GTPase Arf6 in angiogenesis International Symposium on Cellular Signaling 平 成 21 年 11 月 18-19 日 筑 波 大 学 13, 樋 口 珠 美 渡 辺 宏 子 小 林 裕 一 佐 藤 隆 信 長 谷 川 潤 船 越 祐 司 ARF6 は PIP5K をアイソザイム 依 存 的 に 活 性 化 する 平 成 21 年 10 月 23 日 14, 長 谷 川 潤 杉 本 里 香 山 下 美 鈴 野 口 純 子 岡 田 理 沙 鵜 木 隆 光 船 越 祐 司 馬 場 忠 ホスファチジルイノシトール 4-リン 酸 5- キナーゼは 精 子 形 成 に 不 可 欠 である 15, 周 淼 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 低 分 子 量 G 蛋 白 質 ARF6による 肝 細 胞 遊 走 制 御 機 構 の 解 析 16, 鈴 木 篤 史 有 川 千 尋 桑 原 裕 二 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 低 分 子 量 G 蛋 白 質 Arf6 による 神 経 突 起 分 枝 制 御 機 構 17, 本 宮 綱 記 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 金 保 安 則 血 管 形 成 における 低 分 子 量 GTP 結 合 蛋 白 質 ARF6 の 関 与 18, 鈴 木 篤 史 桑 原 裕 二 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 シグナル 伝 達 足 場 タンパク 質 JIP3 は Arf6 の 下 流 因 子 として 神 経 細 胞 の 形 態 形 成 を 制 御 する 平 成 21 年 度 特 定 領 域 G 蛋 白 質 シグナル 研 究 班 会 議 平 成 21 年 9 月 10 日 南 房 総 富 浦 ロイヤルホテル 19, 長 谷 川 潤 鈴 木 篤 史 有 川 千 尋 桑 原 裕 二 船 越 祐 司 低 分 子 量 G 蛋 白 質 Arf6 による 神 経 突 起 の 形 態 制 御 機 構 平 成 21 年 度 特 定 領 域 G 蛋 白 質 シグナル 研 究 班 会 議 平 成 21 年 9 月 11 日 南 房 総 富 浦 ロイヤルホテル 20, 長 谷 川 潤 杉 本 里 香 山 下 美 鈴 野 口 純 子 岡 田 理 沙 鵜 木 隆 光 船 越 祐 司 馬 場 忠 ホスファチジルイノシトール 4-リン 酸 5- キナーゼα βは 精 子 形 成 に 不 可 欠 である 第 6 回 日 本 病 理 学 会 カンファレンス 平 成 21 年 7 月 31 日 -8 月 1 日 つくば 国 際 会 議 場 21, 本 宮 綱 記 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 金 保 安 則 血 管 形 成 における 低 分 子 量 GTP 結 合 蛋 白 質 ARF6 の 機 能 第 6 回 日 本 病 理 学 会 カンファレンス 平 成 21 年 7 月 31 日 -8 月 1 日

つくば 国 際 会 議 場 22, 長 谷 川 潤 杉 本 里 香 山 下 美 鈴 野 口 純 子 岡 田 理 沙 鵜 木 隆 光 船 越 祐 司 馬 場 忠 ホスファチジルイノシトール 4-リン 酸 5- キナーゼの 精 子 形 成 への 関 与 第 61 回 日 本 細 胞 生 物 学 会 大 会 平 成 21 年 6 月 5-6 日 名 古 屋 国 際 会 議 場 助 教 研 究 者 番 号 :10332230 23, 鵜 木 隆 光 松 田 信 爾 船 越 祐 司 長 谷 川 潤 柚 崎 通 介 リン 脂 質 キナーゼ PIP5Kγ661 と AP-2 複 合 体 の 結 合 はポストシナプス 可 塑 性 を 制 御 する 第 61 回 日 本 細 胞 生 物 学 会 大 会 平 成 21 年 6 月 6 日 名 古 屋 国 際 会 議 場 24, 本 宮 綱 記 長 谷 川 潤 血 管 形 成 における 低 分 子 量 GTP 結 合 蛋 白 質 ARF6 の 関 与 第 61 回 日 本 細 胞 生 物 学 会 大 会 平 成 21 年 6 月 6 日 名 古 屋 国 際 会 議 場 産 業 財 産 権 出 願 状 況 ( 計 2 件 ) 1, 名 称 :Arf6 遺 伝 子 機 能 喪 失 動 物 及 びその 利 用 方 法 発 明 者 : 本 宮 綱 記 長 谷 川 潤 船 越 祐 司 権 利 者 : 筑 波 大 学 種 類 : 特 許 番 号 : 特 願 2010-050431 出 願 年 月 日 : 平 成 22 年 3 月 8 日 国 内 外 の 別 : 国 内 2, 名 称 :GTP 結 合 型 ARF6 タンパク 質 の 測 定 方 法 及 びその 用 途 発 明 者 : 本 宮 綱 記 周 淼 長 谷 川 潤 権 利 者 : 筑 波 大 学 種 類 : 特 許 番 号 : 特 願 2010-063109 出 願 年 月 日 : 平 成 22 年 3 月 18 日 国 内 外 の 別 : 国 内 6. 研 究 組 織 (1) 研 究 代 表 者 長 谷 川 潤 (HASEGAWA HIROSHI) 筑 波 大 学 大 学 院 人 間 総 合 科 学 研 究 科