藤井 酵素免疫測定法によるビテロジェニンの定量 ラボラトリーズ μlを添加 する 時間振と ル数に応じて算出する 筆者は 標識抗体として う後 上記同様 TBS-Tで 回振とう洗沖し Gで はなく ビオチン標識 'を用 酵素標識 I Lの基質溶液汁を添加する 基質としてオルト フェ いている I Gから 抗原との結合に関与しない PD 和光純薬工業などを用 ニレンジアミン 領 域 を 除 い た 'を用いることにより 非 いる場合は 暗箱に入れて時々発色状況を観察し 特異結合を軽減させることができる また ピオ パックグランドが発色し始めたら水道水で 流水洗 チン標識を施すことにより 必要に応じて市販 の 浄して発色を止める 筆者は 本法で μ/ L以 アビジンに結合した様々な酵素ある いは蛍光物質 下 の Vの発色が肉 眼で確認出来れ ば などの利用が可能となり 応用範囲が格段に広 が ト分に抗 体価が上がったと判断している L H v JW る さらに 酵素よりも分子量が小 さいピオチン D f f v 巴 I V f 巴I y f -v を標識することによ り 抗原抗体反応 における立 体障害を軽減する効果も 期待できる ビオチン標 識 'は 以下の方法で作製する まず 精製した IGの一部を脱塩用カラムエ コノノミック DGカラム ノ イオ ラッドラ ボラ トリーズなどを用いて M 塩化ナトリウ ムを含む M酢酸ナトリウム緩衝液注8H4に 溶媒交換し 分画分子量 kdの限外ろ過ミリ ポアなどによって濃縮して / L前後に調整 なお 得られた抗血清が 卵黄蛋 白質前駆物質 する ここで用いる IG量は 穴プレート 枚 卵抽出液と反応する 雌特異蛋白質正常雄血 を目安に計算する ブタ胃由来ペ プ 当た り 清や未熟雌血清とは反応しないが成熟雌血清と反 シン 和光純薬工業などを 4/ Lとなるよ E 処理 応する 及びエストロゲン誘導蛋白質 う添加し 穏やかに撹枠 溶解して 7Cで "' 魚血清と反応するという Vの定義を満たす蛋 時間消化する 白質を 特異的に認識することを確認してお く必要 kd と kd 及びペプシン kd がある 抗血清の特異性は ドットプロ ッテイン を分離するため '" kdを分画範囲として グ法でも大まかには調べられるが 認識する蛋白 S HR / カバーするゲ /レろ過カラム 質を確認するために 卵抽 出液 正常雄血清 成 GEヘ ル ス ケ ア バイオサイエンスなどで分 熟雌血清 ベ フ シ ン 消 化 後 ' E処理魚血清 精 製 Vなどを試料と したウエスタンブロッティング法の実施を推奨す 脱塩カラムで I G溶液を酢酸ナトリウム緩衝液に溶媒交換 る 同法は 市販のゲルパジェノレ SPG-L アトーなど 泳動装置ラピ ダス ミニスラブ 電 気泳動装置 アトーなど プロッティング装 置 ホライズブロット アトーなどを必要とし ブタ胃由来ペプシンを 4 j L添加 撹 祥 それ らの機器には丁寧な取扱説明書が 添付されて いる ので ここでの説明は省略す る また ブロッ テインク守膜のバンドの検出は 上述のドット プロッ トでの検出法に準じ 莫のサイズに合わせてスケー P B Sを用いたゲルろ過により ' を精製 ノレアップすれば良 い ' の 倍量の B 7 N H Sを添加 モル比で 標識抗体の作製 得られた抗血清から 市販 のプロテイン Aある ~4 時間穏やかに償枠 いはプロテイン Gカラム HT P A あ るいは HT P G HP GEへ/レスケアバ イオサイエンスなどを用い カラムの取扱説明 書に 準じて I Gを精製する 精製する I G量は 穴プレート 枚当たり を目安にし サンプ P f 合 fig ' ' w f - 4一 一

酵素免疫測定法によるピテロジェニンの定量 藤井 値と設定添加 量との誤差 は 78以下 で濃度が / Lの との吸光度に有意差 は認め られず そこ 低下するに従 い著しく増大した 74: :! : : は ブラン クの吸光度 吸光度 で ~ の範囲で 求め た 回 帰式 8 4:! : : の平均値プラス標準偏差の 倍 R= に各添加 量の 吸光度 を当てはめると かっブランクよりも有意に高 い値を示した また 7% 以下にまで低下した 同範囲の誤差が ~ /L の範 囲で R =の回帰式が得 8土 7A 同回帰式に各濃度の吸光度を られた 4 は ブランクの 吸光度 8土 当てはめて得た計算値と 設定濃度と の誤差は の平均値プラス標準偏差の 倍 かっブランクよ 78/ L以下で著しく大きくなった ま た 最 低 量 で ある の 吸 光 度 目 目 8 りも有意に高 い値を示 した さらに 全ての試験 区で 変動係数は % 未満であった これらの結 の HRPで は 果から 今回用いた比活性4/ 口 口 A胃 k U 凋仏 誤差を % まで許容すれば を境界として 諒 の広い範囲で酵素活性が測れることが明 らかになっ た y= x - y= x -4 7 T L D L 以 種類の回帰式を 用いることにより ~ 8 マコガレイビテロジェニンの酵素免疫測定法 筆者が マ コガレイ Vのサ ン ドイ ツチ 法を検 Vを用い 各 濃度 4連で前述の① ⑬に従い吸光 / Lとブランク 度を測定した その結果 I 4 一一一一一一一一 A ε 凶C凶 R二 y = x - ~ 8 4 4 7 8 H R P R v f q y f x HRP y q A k 8 w * E =I v - v I v X 討 し た 事 例 を 紹介する ~ 8/L の精製 コ = 一-吋 よ 4 B y 二 x - 4 7 凶巳 円崖Z R二 B y= x - 7 R= 8 ー E ~ ' D > - 8 D4 R w q y f HR P y x y D f y f A 8 E f q : v f 8 D4 7S v f / L A / L B EL SA f v V E fq : : v f - 7一 一

藤井:酵素免疫測定法によるビテロジェニンの定量 そこで ~ /L の範囲で求めた回帰式 濃度を計算する必要がある 7 B R= 8 に各濃度の吸光度を当ては 本稿で例示した 酵素 HRP と 発 色 基 質 めた結果 同濃度範囲の誤差が %未満に減少し PD の組み合わせでは 他 の実験条件にもよ 8 各濃度区の変動係 数は / L た / Lオーダー 以下の定量下限値が期待でき るが を除き 全て % 未満であった これらの結果か る さらなる高感度化 の工夫が種々報告されてい / Lを境界として 種類の回帰式を用 ら るが河野 石川 いることにより Av A k P C j タカラ ~ /L の範囲で Y が バイオなどを変えた発色法 あるいは同じ HRP 定量できることが明らかになった でも発光基質 酵素 C IP① おわりに S S ① ELTSA S タカラバイオなど C EUSAにおける各反応は 反応時間 温度 抗 に変更することなどによっても 高感度化が期待 原や抗体の質や量などによって影響を受ける 従っ できる また 酵素の代 わりにランタノイドを標 て 新しい ELISAの系を確立するためには 識した市販のアビジン DELIA E I 酵素免疫測定法 で示したこれらの条件を参考と v パーキンエノレマ ー ジャパンを用い して 独自に最適条件を見つけ出す必要がある ることにより パックグランドの低い蛍光検出法 なお 抗原抗体反応時の温度については 抗体産 である時間分解蛍光免疫測定法への変更も可能で 生に用いたウサギの体温に近い C前後が至適温 ある藤井ら しかし 発光法や 度と考えられ インキュベーターなどで温めると 蛍光法は 発色法よりも高価 な試薬や検出機器を 時間短縮が期待できる しかしながら 加温する 必要とするので それらも総合的に勘案して目的 とプレートに温度差を生じて縁辺部の試料穴ほど に合った方法を選択する こ とが重要である 値が高くなる いわゆるエッジ効果が現れる場合 がある 従って 急激な温度変化のない室温で反 解説 応させる方が より安定した結果を得ることがで 注採血 :供試魚を 飼育水で 希釈した麻酔液 きる なお 気温が低い場合は 空調により室温 オイゲノーノレの場合は ~ 倍希釈に をC以上に保つことが望ましい また 冷蔵保 浸潰して十分に麻酔を 施 した後 濡れたタオルな 存した溶液をすぐに使うと ピペ ッティング誤差 どを巻いて魚体を固定する 尾柄部を露出させ の原因となるため 必要量だけ取り出して 時間 体高の最も狭まった部分付近の腹側 から注射針を ほど放置し 室温に戻してから使用する必要があ 挿入し 斜め前方に穿刺する 鱗が邪魔な場合は る ピペ ッティングは 一定の順番とリズムで行 ピンセットなどで取 り除くか 鱗の隙聞から穿刺 うことを心がけ 試料穴聞の反応時間を出来るだ する 針先が脊椎骨に当たる感触が確認できたら け均等にする さらには 常に標準液 Y濃度 ピストンをゆっくりヲ し て採血する 注射器テ 既知の血清の希釈系 列でも可を試料とともに測 ルモやニフ ロなどのサ イズは 必要とする 血液 定し その都度求めた回帰式によって試料の Y 量や魚の大きさによって異なるが 最大採血量が 魚体重の約 7 日 * 8 % 魚種によって多少異なるであ ることを目安に選択するとよ い 注射針も 魚の y= x- 4 8 口 y= x- 7 大きさなどによって G~ 8G 内径 ~ 8 η の範囲で選択されることが多い 供試魚が極めて ぞ 小 さくて注射器採血 が困難 な場合は 尾柄部を切 と4 断し 出血箇所にへマ トクリット管を当てること により毛細管現象によって採血 できる また 高 7 8 V / L 濃度の E 曝露に よって腹水が貯まる場合には 注射器で 採水するか 開腹して PMSやアプロチ 8 R v f v 旬 巴 y閃 右 芯 ω お 引 叩 q 日 川 7 A k 川 附 I η 川 78 w 巾 叩 * E = v - v : v X 責して回収し Y ニンを含む氷冷した TBSに浸 精製用の材料とすることができる j 主 K I U: K k I U カリクレイ ン阻害活性の 略 KIUは H8 室温 - 8- 時