目 次 1.HLA 抗 体 検 査 の 臨 床 的 意 義... 3 1.1 臓 器 移 植 における HLA 抗 体 検 査... 3 1.2 造 血 幹 細 胞 移 植 における HLA 抗 体 検 査... 4 2.LABScreen Single Antigen 製 品 概 要... 5 2.1 LABScreen の 使 用 目 的 原 理... 5 2.2 LABScreen の 種 類... 6 3. 検 査 の 準 備... 8 3.1 キット 内 容 と 保 存 方 法... 8 3.2 他 に 必 要 な 試 薬... 8 3.3 必 要 な 機 器 器 具... 8 3.4 LABScan システム/LABScan 3D システム 測 定 時 に 必 要 なファイル... 9 3.5 検 査 の 流 れ... 9 3.6 検 体 処 理... 10 4. 推 奨 プロトコル... 11 5.LABScreen Single Antigen の 判 定 に 関 して... 14 5.1 蛍 光 値 (nmfi 値 Baseline)に 関 して... 14 5.2 施 設 カットオフラインの 検 討 方 法... 14 5.3 再 検 査 の 基 準... 14 5.4 施 設 判 定 ルール( 参 考 例 )... 14 5.5 施 設 報 告 ルール( 参 考 例 )... 14 6.HLA Fusion 3 による LABScreen の 解 析... 15 6.1 LABScreen 解 析 カタログのインポート 方 法... 15 6.2 LABScreen データのインポート 方 法... 17 6.3 LABScreen Mixed 解 析... 19 6.4 LABScreen Single Antigen 解 析... 21 7.LABScreen Single Antigen よくある 質 問 (FAQ)... 32 7.1 陽 性 コントロールビーズ 値 (PC 値 )が 低 い 場 合... 32 7.2 陰 性 コントロール 値 (NC ビーズ 値 )が 高 い 場 合... 33 7.3 プロゾーン 様 現 象... 34 7.4 HLA 自 然 抗 体... 35 7.5 ネガティブコントロール 血 清... 36 7.6 DQ DP 抗 体 が 存 在 する 場 合... 37 7.7 自 己 抗 体... 38 8.LABScreen Single Antigen 共 通 化 プロジェクト... 39 9. 付 録 : 操 作 手 順 書... 40 2

初 めに 本 LABScreen の 手 引 き は LABScreen を 使 用 されている 方 使 用 予 定 の 方 が 安 心 して 試 薬 を 使 用 できるよう に 操 作 方 法 や 解 析 トラブルシューティングに 至 るまでの 様 々な 重 要 なポイントをまとました LABScreen 検 査 で 迷 った 際 等 に 是 非 ご 活 用 下 さい 1.HLA 抗 体 検 査 の 臨 床 的 意 義 1.1 臓 器 移 植 における HLA 抗 体 検 査 HLA 抗 体 検 査 は 抗 体 関 連 性 の 臓 器 拒 絶 を 回 避 する 為 に 非 常 に 重 要 な 検 査 であると 言 えます ドナー 臓 器 の HLA 抗 原 に 特 異 的 に 反 応 する HLA 抗 体 (DSA Donor Specific Antibody)を 患 者 が 保 有 していた 場 合 臓 器 拒 絶 のリスクが 上 昇 すると 言 われています 移 植 前 に DSA を 保 有 している 場 合 移 植 後 に 急 性 拒 絶 が 起 こる 危 険 性 があると 考 えられています さらに 近 年 では 移 植 後 の 慢 性 拒 絶 にも DSA の 関 与 が 強 く 示 唆 されてい ます Dunn らによる 最 近 の 研 究 では 統 計 上 の 生 存 率 が 移 植 後 5 年 目 で DSA 陽 性 患 者 では DSA 陰 性 患 者 に 比 べて 優 位 差 をもって 低 下 することが 明 らかとなっています 1) 図 1) 1) Dunn TB, et al. Revisiting traditional risk factors of rejection and graft loss after kidney transplantation. American Journal of Transplantation 2011. 図 1:DSA と 生 存 率 の 関 係 3

1.2 造 血 幹 細 胞 移 植 における HLA 抗 体 検 査 DSA の 存 在 は 移 植 した 造 血 幹 細 胞 の 生 着 にも 影 響 を 与 えています 特 に DSA を 保 有 する 場 合 有 意 差 をもって 生 着 不 全 となります 2) 3) 4) 図 2) 臍 帯 血 移 植 では HLA の 2 抗 原 ミスマッチまで 非 血 縁 骨 髄 移 植 においても HLA の1 抗 原 ミスマッチが 許 容 されて いるため DSA の 有 無 を 事 前 に 確 認 しておくことで 拒 絶 のリスクを 回 避 する 事 が 重 要 と 考 えられています この ような 背 景 から 2012 年 の 診 療 報 酬 改 定 により 全 ての 造 血 幹 細 胞 移 植 術 に 対 して 抗 HLA 抗 体 検 査 を 実 施 した 場 合 4000 点 加 算 出 来 ることになりました 2)Takanashi M, Atsuta Y, Fujiwara K, Kodo H, Kai S, Sato H, et al. The impact of anti-hla antibodies on unrelated cord blood transplantations. Blood. 2010; 116:2839 2846. 3) 高 橋 聡. 臍 帯 血 移 植 と HLA 抗 体 東 大 医 科 研 での 経 験 からー. HLA と 抗 体 3 号.2007.2 4) 高 梨 美 乃 子. 臍 帯 血 移 植 における 抗 HLA 抗 体 の 影 響. HLA と 抗 体 7 号.2008.7 好 中 球 回 復 率 血 小 板 回 復 率 無 再 発 生 存 率 生 存 率 図 2: 臍 帯 血 移 植 における 抗 HLA 抗 体 の 影 響 2) Ab-negative:HLA 抗 体 陰 性 Ab-positive:HLA 抗 体 陽 性 Positive-vs-CB: 臍 帯 血 に 対 して 特 異 的 な HLA 抗 体 陽 性 (DSA 陽 性 ) 4

2.LABScreen Single Antigen 製 品 概 要 2.1 LABScreen の 使 用 目 的 原 理 LABScreen は LABScan システム(Luminex)を 使 用 して 検 体 ( 血 清 または 血 漿 ) 中 の HLA 抗 体 を 検 出 する 為 の 研 究 用 試 薬 で 精 製 した HLA 抗 原 がコーティングされたマイクロビーズです 簡 便 かつ 高 感 度 に HLA 抗 体 を 検 出 す る 事 ができます LABScreen ビーズと 検 体 を 反 応 後 PE 標 識 抗 ヒト IgG 抗 体 で 染 色 し LABScan システム/LABScan 3D システムに より 蛍 光 強 度 を 測 定 し HLA 抗 体 を 検 出 します 5

2.2 LABScreen の 種 類 LABScreen は LABScreen Mixed LABScreen PRA LABScreen Single Antigen の 3 種 類 があります( 図 1) こ れ らの 試 薬 は HLA 抗 原 型 を 100% 網 羅 しています LABScreen Mixed:ビーズに 3-5 パネルセル 由 来 の HLA 抗 原 が 結 合 しており HLA 抗 体 の 有 無 を 確 認 可 能 LABScreen PRA:1 ビーズに 1 パネルセル 由 来 の HLA 抗 原 が 結 合 しており HLA 抗 体 の 有 無 およその 特 異 性 %PRA * を 確 認 可 能 LABScreen Single Antigen:1 ビーズに 対 しリコンビナント HLA 抗 原 が 1 種 類 のみ 結 合 しており HLA 抗 体 の 抗 原 特 異 性 の 検 出 が 可 能 なお 追 加 で 開 発 された LABScreen Single Antigen Supplement を 併 用 すれば 日 本 人 に 見 られる HLA アリルの ほぼ 全 てを 網 羅 しているため( 表 1) さらに 高 精 度 なアリルレベルでの DSA 測 定 が 可 能 となります( 図 2) * %PRA(Panel Reactive Antibody): 全 パネル 細 胞 の 何 %が 陽 性 となるかの 値 %PRA が 高 い 程 様 々な 抗 原 に 対 する 抗 体 を 保 有 している 指 標 となります 製 品 名 LABScreen Mixed LS12M(ClassI&II&MICA) LABScreen PRA LS1PRA(ClassI) LS2PRA(ClassII) LS12PRA(ClassI&II) LABScreen Single Antigen 目 的 HLA 抗 体 のスクリーニング (1 ビーズに 3~5 パネル) 20 種 類 のビーズ %PRA * とおおよその 特 異 性 (1 ビーズに 1 パネル) ビーズの 種 類 ClassI:55 ClassII:35 LS1A04(ClassI) LS1A04SP(ClassI+SupplementI) LS1ASP01(SupplementI) LS2A01(ClassII) LS1ASP01(SupplementII) LS2A01SP(ClassII+SupplementII) 特 異 性 の 検 出 DSA の 同 定 (1 ビーズに 1 抗 原 ) ビーズの 種 類 ClassI:99 SupplementI:36 ClassII:97 SupplementII:18 図 1. LABScreen 製 品 の 種 類 及 び 使 用 目 的 6

表 1:LABScreen Single Antigen+ Supplement での 日 本 人 アリル 頻 度 カバー 率 図 2: 各 種 LABScreen による HLA 抗 体 測 定 レベル 7

3. 検 査 の 準 備 3.1 キット 内 容 と 保 存 方 法 未 開 封 のキットは -65 以 下 で 箱 に 表 示 されている 有 効 期 限 まで 保 存 できます 一 度 解 凍 したあとの 保 存 方 法 と 有 効 期 限 は 下 記 のとおりです 内 容 保 存 方 法 と 有 効 期 限 LABScreen beads mix キットの 箱 全 体 を 初 回 使 用 時 まで-65 C 以 下 のフリーザーに 保 管 して ください ラベルに 記 載 された 有 効 期 限 まで 保 管 できます 一 度 解 凍 したビーズは 再 凍 結 しないでください 解 凍 したビーズは 最 長 3 ヵ 月 または 有 効 期 限 (3 ヵ 月 以 内 の 場 合 )まで 2-8 C に 保 管 で きます 10 Wash buffer 初 回 使 用 後 は Wash Buffer を 最 長 3 ヵ 月 または 有 効 期 限 (3 ヵ 月 以 内 の 場 合 )まで 2 C~8 C に 保 管 できます 3.2 他 に 必 要 な 試 薬 下 記 はキットに 含 まれないので 別 途 ご 用 意 ください LABScreen では 毎 回 必 ず 陰 性 コントロール 血 清 (LS-NC)を 並 行 してテストして 下 さい -20 で 有 効 期 限 まで 保 管 できます 二 次 抗 体 (LS-AB2)は 凍 結 乾 燥 の 粉 末 状 態 で 届 く 為 滅 菌 蒸 留 水 で 溶 解 させます 滅 菌 蒸 留 水 の 量 は ロット 毎 に 異 なる 場 合 があるので 必 ず 製 品 バイアルで 量 を 確 認 します 溶 解 した 後 は 冷 蔵 で 6 ヶ 月 間 保 管 可 能 です 商 品 コード 品 名 容 量 1 検 体 の 使 用 量 LS-NC LABScreen negative control 400 all(20 test) 20 all serum LS-AB2 PE conjugated Goat anti human 0.5 mg 100 Stock を 1 all IgG ( 約 1000 test) PBS - - 3.3 必 要 な 機 器 器 具 製 品 名 製 造 元 カタログ 番 号 LABScan システム LABSCNXS3 One Lambda (または LABScan 3D システム) (LABSCNXS4) 96 ウェル マイクロプレート "UNIPLATE" Whatman 7701-3250 (white) トレーシール One Lambda SSPSEA300 プレート 遠 心 機 どのメーカーでも 可 1300g 以 上 回 せるもの プレートシェーカー どのメーカーでも 可 その 他 ピペットやチップ 等 もご 用 意 ください 8

3.4 LABScan システム/LABScan 3D システム 測 定 時 に 必 要 なファイル 測 定 に 必 要 なファイルを 下 記 URL からダウンロードします 使 用 している LABScreen 製 品 ロットに 該 当 する 測 定 ファイルを 選 択 して 下 さい LABScan システム(Luminex IS2.2/2.3)を 使 用 の 場 合 :テンプレートファイル http://download.onelambda.com/pub/tray_info/windows/luminex_templates_lx100_200/is2_3/labscreen/ LABScan システム(Luminex xponent3.1)を 使 用 の 場 合 :プロトコルファイル http://download.onelambda.com/pub/tray_info/windows/luminex_templates_lx100_200/xponent_3_1/labscreen/ LABScan 3D システム(Luminex xponent4.2)を 使 用 の 場 合 :プロトコルファイル http://download.onelambda.com/pub/tray_info/windows/luminex_templates_labscan3d/xponent_4_2/labscreen/ 3.5 検 査 の 流 れ 前 処 理 検 体 ( 血 清 または 血 漿 )を 凍 結 融 解 転 倒 混 和 8000g -10000gで10 分 間 超 遠 心 反 応 ビーズ5ulと 検 体 20ulを 混 合 遮 光 室 温 (20 25 )で 振 とうで30 分 間 反 応 洗 浄 (3 回 ) PE 標 識 洗 浄 バッファー 遠 心 (1300gx5 分 or 1500gx3 分 ) フリッキング タッピング ドライボルテックス 100 倍 希 釈 した 二 次 抗 体 を100ulずつ 添 加 遮 光 室 温 (20 25 )で 振 とうで30 分 間 反 応 洗 浄 (2 回 ) 洗 浄 バッファー 遠 心 (1300gx5 分 or 1500gx3 分 ) フリッキング タッピング ドライボルテックス 9

3.6 検 体 処 理 3.6.1 検 体 前 処 理 ( 必 須 ) 1. 検 体 ( 血 清 または 血 漿 (ACD または K-EDTA 加 血 ))は 必 ず 凍 結 融 解 します 2. 融 解 後 は しっかり 転 倒 混 和 を 行 ってから 遠 心 を 行 います (8000~10000g 10 分 間 以 上 ) 不 純 物 が 多 い 検 体 は 遠 心 速 度 時 間 を 増 やします 3. 上 層 下 層 および 壁 面 に 凝 固 物 が 存 在 する 可 能 性 があるので 慎 重 に 中 間 層 から 検 体 を 回 収 して 使 用 します 3.6.2 再 検 査 の 為 の 検 体 処 理 ( 参 考 情 報 各 施 設 で 検 討 して 下 さい ) 陰 性 コントロールビーズ 値 (NC 値 )が 高 い 場 合 : 非 特 異 物 質 の 吸 着 操 作 使 用 する 試 薬 :Adsorb Out( 製 品 コード:ADSORB One Lambda) Adsorb Out 処 理 プロトコル(メーカープロトコル) 1. (1 テストあたり) 血 清 30uL に 対 して Adsorb Out ビーズを 3 ul 加 え ボルテックスします 2. 室 温 で 30 分 間 振 とうしながら 反 応 させ 15000 rpm で 5 分 間 遠 心 します 3. 上 清 を ビーズを 吸 わないように 慎 重 に 新 しい 別 の 1.5mL チューブに 移 します 4. もし 検 体 に Adsorb Out ビーズが 混 入 した 場 合 には 再 度 超 遠 心 し 上 清 を 移 します 陽 性 コントロールビーズ 値 (PC 値 )が 低 い 場 合 : DTT 処 理 による IgM 抗 体 の 不 活 化 使 用 する 試 薬 :DTT (dithiothreitol メーカー 不 問 ) DTT 処 理 プロトコル( 第 4 回 アメリカ 組 織 適 合 性 学 会 (ASHI) 推 奨 プロトコル) 1. DTT 溶 液 (0.05M) 10 ul に 対 して 血 清 を 90 ul 加 えます (DTT の 終 濃 度 は 0.005M) 2. よく 混 ぜた 後 37 で 30-45 分 間 反 応 させます 1300g で 10 分 間 遠 心 し 上 清 を 使 用 します プロゾーン 現 象 * が 疑 われる 場 合 :PBS(メーカー 不 問 )による 検 体 の 希 釈 希 釈 倍 率 は 検 体 によって 異 なるので 各 施 設 で 検 討 して 下 さい *プロゾーン 現 象 過 剰 に 抗 体 が 存 在 することで 抗 原 抗 体 反 応 が 抑 制 される 現 象 偽 陰 性 となる 可 能 性 あり プロゾーン 様 現 象 が 疑 われる 場 合 : 補 体 成 分 の 不 活 化 使 用 する 試 薬 : 0.5M-EDTA(メーカー 不 問 ) EDTA 処 理 参 考 プロトコル 1. 溶 解 した 血 清 90uL に EDTA 3uL を 入 れます 2. 室 温 にて 30 分 間 振 とうしながら 反 応 させ 20000g で 10 分 遠 心 し 上 清 を 使 用 します *プロゾーン 様 現 象 検 体 中 の 補 体 成 分 が 二 次 抗 体 の 結 合 を 阻 害 して 偽 陰 性 となってしまう 現 象 主 に LABScreen Single Antigen で 報 告 されています 10

4. 推 奨 プロトコル 96 ウェルプレート 法 :データのばらつきが 最 も 少 ない 為 推 奨 しています ( 図 3 参 照 ) 検 体 及 び 試 薬 の 分 注 1 96 ウェルプレートの 最 初 のウェルに 陰 性 コントロール 血 清 ( 製 品 コード:LS-NC)20uL を 入 れます 使 用 す る LABScreen 試 薬 毎 に LS-NC を 1 ウェルずつ 使 用 します 2 2 番 目 のウェルから 前 処 理 ( 凍 結 融 解 超 遠 心 ) 済 みの 検 体 20uL を 入 れます 3 ビーズを 軽 くスピンダウンし( 蓋 の 裏 に 付 いた 液 を 落 とす) 数 秒 間 ボルテックスします キャップを 開 け 10 回 程 度 ピペッティングをして LABScreen ビーズをよく 混 合 します ビーズ 数 が 多 いため しっかりとボル テックス ミキシングすることが 大 切 です 使 用 後 は 蒸 発 を 防 ぐためにしっかり 蓋 を 締 め 冷 蔵 で 保 存 して 下 さい ビーズは 凍 結 融 解 不 可 です 4 ビーズ 5uL を 各 ウェルに 入 れ ピペッティングでよくビーズと 検 体 を 混 合 します 一 回 目 の 反 応 :ビーズと 検 体 の 反 応 5 トレーシールを 貼 り アルミホイルなどで 遮 光 し 室 温 (20-25 )でシェーカーを 用 いて 振 とうしながら 30 分 間 反 応 させます 6 反 応 中 に 蒸 留 水 で 10 X Wash Buffer ( 製 品 コード:LSPWABUF) を 希 釈 し 1 X Wash buffer を 必 要 量 だけ 調 製 します 希 釈 は 使 用 するチューブ 等 の 目 盛 を 用 いての 調 製 で 問 題 ありません 1 X Wash buffer は 1 テストあたり 約 1.1mL 必 要 です 洗 浄 操 作 :7~11を 3 回 繰 り 返 し 行 う 7 反 応 後 各 ウェルに 希 釈 済 みの 1 X Wash buffer を 加 えます 添 加 量 :1 回 目 は 150uL 2 回 目 3 回 目 は 200uL を 加 えます 8 新 しいトレーシールを 貼 り 1300g で 5 分 間 (または 1500g で 3 分 間 ) 遠 心 します 3 回 目 の 洗 浄 の 遠 心 時 に 100 倍 希 釈 の 二 次 抗 体 を 用 意 します 1 テストあたり 二 次 抗 体 の Stock 溶 液 (3.2 参 照 )1uL を 1 X Wash Buffer 99uL に 加 えます 9 トレーシールを 剥 がし しっかりフリッキングして 上 清 を 除 去 します フリッキングは 真 下 にしっかりと 1 回 のみ 行 います 何 度 も 行 うとビーズをロスする 危 険 があります 10 フリッキング 後 はトレーを 下 向 きにしたままキムタオルに 5 秒 間 押 し 付 け 軽 く 5 回 タップします タッピン グすることでウェル 内 の 残 存 液 を 除 去 する 事 ができます 11 ビーズのみの 状 態 で ウェルのビーズがほぐれる 程 度 ( 約 2 秒 ~5 秒 程 度 )ボルテックスします(ドライボル テックス) ほぐれると 青 い 点 のようになっていたビーズが 広 がり 見 えなくなります なおドライボルテ ックスを 長 くし 過 ぎると 蛍 光 値 が 弱 くなる 場 合 があるので 注 意 して 下 さい ( 図 4) 左 図 :フリッキング 中 央 図 :タッピング 右 図 :ドライボルテックス(シール 不 要 ) 11

二 次 抗 体 によるラベリング 12 3 回 目 のドライボルテックス 後 希 釈 二 次 抗 体 100 ul ずつ 各 ウェルに 加 えます トレーシールを 貼 り 遮 光 しながら 室 温 (20 C~25 C)で 振 とうしながら 30 分 間 反 応 させます 13 LABScan システムもしくは LABScan 3D システムの 電 源 を 入 れておきます 洗 浄 操 作 :15~16を 計 2 回 行 う ( 遠 心 は 3 回 ) 14 反 応 後 洗 浄 バッファーは 加 えず 1300g で 5 分 間 (または 1500g で 3 分 間 ) 遠 心 します 15 フリッキング タッピング ドライボルテックスを9~11と 同 様 に 行 います 16 各 ウェルに 1 X Wash buffer を 200uL ずつ 加 え トレーシールを 貼 り 1300g で 5 分 間 (または 1500g で 3 分 間 ) 遠 心 します 17 フリッキング~ 遠 心 (15~16)をさらに 一 回 行 った 後 フリッキング タッピング ドライボルテックスを 9~11と 同 様 に 行 います 18 1 X PBS を 各 ウェルに 80uL ずつ 加 えます 以 上 でサンプル 調 整 が 終 了 です LABScan システム/LABScan 3D システム による 測 定 に 関 して すぐに 測 定 できない 場 合 は シールを 貼 り 冷 蔵 庫 で 保 管 します 蛍 光 値 が 弱 くなるので 必 ず 24 時 間 以 内 に 測 定 します ビーズ 数 が 非 常 に 多 くビーズがウェル 底 に 沈 みやすいので すぐに 測 定 できない 場 合 には 測 定 前 にし っかりとサンプルのミキシングを 行 います LABScan の 蛍 光 値 は その 日 の 条 件 (レーザー 出 力 気 温 等 )に 影 響 されます より 正 確 に 蛍 光 値 を 測 定 するために 測 定 前 に 必 ずキャリブレーションを 行 います 12

蛍 光 値 ( nmfi) HLA 特 異 性 図 3:LABScreen Single Antigen のプレート 法 とチューブ 法 の 比 較 蛍 光 値 ( nmfi) HLA 特 異 性 図 4:LABScreen Single Antigen におけるドライボルテックス 時 間 の 影 響 13

5.LABScreen Single Antigen の 判 定 に 関 して 5.1 蛍 光 値 (nmfi 値 Baseline)に 関 して LABScreen 検 査 は 使 用 分 野 使 用 目 的 に 応 じて 当 然 結 果 の 解 釈 や 治 療 方 針 等 は 異 なるので 必 ず 各 施 設 で 判 定 基 準 判 定 ルールを 作 成 して 下 さい なお 判 定 の 際 の 蛍 光 値 (nmfi * )を 絶 対 視 せ ず あくまでも 抗 体 量 の 目 安 として 参 照 して 下 さい *nmfi(baseline): 補 正 された 蛍 光 値 normalized Mean Fluorescence Intensity の 略 ビーズに 対 する 非 特 異 反 応 と 抗 原 に 対 する 非 特 異 反 応 を 差 し 引 いた 値 nmfi = 検 体 の 各 ビーズ 値 - 検 体 の NC ビーズ 値 -( NC 血 清 各 ビーズ 値 -NC 血 清 の NC ビーズ) 5.2 施 設 カットオフラインの 検 討 方 法 1. カットオフラインは NC 血 清 の 反 応 値 (バックグラウンド 値 )よりも 十 分 に 高 くなるように 設 定 します バ ックグラウンド 値 は メーカーの NC 血 清 を 用 いて 3-5 回 の 再 現 性 試 験 を 行 って 測 定 して 下 さい もしくは 5-10 種 類 の 輸 血 暦 移 植 暦 の 無 い 健 常 男 性 ドナー 由 来 の NC 血 清 を 使 用 して バックグラウンドの 平 均 値 を 算 出 することも 出 来 ます 2. 5-10 程 度 の 予 め 特 異 性 が 分 かっている 陽 性 血 清 あれば 設 定 したカットオフラインで 検 出 できるかを 検 証 し て 下 さい 3. 必 要 に 応 じて 他 の 抗 体 検 査 法 の 過 去 の 結 果 と LABScreen のカットオフが 適 合 するか 検 証 して 下 さい ま た %PRA が 高 く( 特 異 性 の 幅 が 広 く) タイピング 情 報 があるサンプルがあれば 自 己 の HLA アリルのビー ズの 反 応 値 をカットオフの 目 安 として 使 用 することも 出 来 ます 5.3 再 検 査 の 基 準 :メーカーでは 以 下 のいずれかの 場 合 に 該 当 する 場 合 再 検 査 する 事 を 推 奨 しています 1. ビーズカウントが 50 以 下 2. PC 値 が 500 以 下 3. NC 値 が 1500 以 上 4. PC/NC 値 が 2 以 下 5.4 施 設 判 定 ルール( 参 考 例 ) 必 ず 各 施 設 で 判 定 基 準 判 定 ルールを 作 成 して 下 さい 1 コントロール 値 の 確 認 :NC 値 500 以 下 PC 値 3000 以 上 PC/NC 値 10 以 上 であることを 確 認 する 範 囲 外 な ら 再 検 査 する 2 基 本 的 には HLA Fusion 3 の 自 動 判 定 で x6 以 上 を 陽 性 とする ただし 必 ず nmfi 値 を 確 認 する 3 nmfi 値 で 約 1000 以 上 を 陽 性 カットオフとするが 抗 体 特 異 性 や 反 応 グラフのショルダー( 蛍 光 値 が 大 きく 下 がるビーズ)をもとにカットオフの 妥 当 性 を 必 ず 検 討 する 5.5 施 設 報 告 ルール( 参 考 例 ) 必 ず 各 施 設 で 判 定 基 準 判 定 ルールを 作 成 して 下 さい 1 基 本 情 報 の 記 載 : 患 者 情 報 性 別 感 作 歴 ( 妊 娠 歴 輸 血 歴 移 植 歴 ) HLA タイピング 情 報 検 査 日 実 施 者 使 用 製 品 使 用 ロットなど 2 コントロール 値 の 確 認 :ビーズカウント 数 PC 値 NC 値 PC/NC 比 3 検 査 結 果 の 詳 細 情 報 : 抗 体 特 異 性 ( 抗 原 レベル アリルレベル) DSA の 有 無 nmfi 値 バーチャルクロス マッチ 結 果 など 14

6.HLA Fusion 3 による LABScreen の 解 析 6.1 LABScreen 解 析 カタログのインポート 方 法 6.1.1 解 析 用 PC がインターネットに 繋 がっていない 場 合 1. HLA Fusion 解 析 時 に 必 要 なカタログファイルは インターネットに 繋 がっている 別 の PC を 使 用 して 下 記 よりダウンロードして 下 さい カタログ ID の 読 み 方 : 製 品 コードと NC 血 清 ロット_ビーズロット_revision 例 : LABScreen Single Class I NC 血 清 ロット 14 ビーズロット 8 revison2= LS1A04NC14_008_02 http://download.onelambda.com/pub/tray_info/windows/hla_fusion_catalogs/labscreen/ 2. ダウンロードしたファイルは USB 等 を 使 用 して 解 析 PC の C ドライブに 保 存 して 下 さい 3. HLA Fusion を 起 動 し 画 面 の 上 部 のタブより Utilities >Update Reference >Update Reference File を 選 択 します 4. 新 しい 画 面 が 表 示 されますので 左 側 のファイルより C ドライブを 選 択 します 画 面 左 下 の Catalog にチェックを 入 れて 右 側 よりカタログファイルを 選 択 し Import Catalog ボタンをクリックします 5. 新 しい 画 面 が 開 き 左 側 のカラムにカタログが 表 示 されますので Close を 押 します 以 上 でカタログのインポートが 完 了 です 15

6.1.2 解 析 用 PC がインターネットに 繋 がっている 場 合 1. HLA Fusion を 起 動 し 画 面 の 上 部 のタブより Utilities >Update Reference >Update Reference File を 選 択 します 2. 新 しい 画 面 が 表 示 されますので 画 面 左 下 の Catalog にチェックを 入 れて Auto Update ボタンをク リックします 3. 別 画 面 が 表 示 されますので 画 面 左 下 の Not in Fusion DB をチェックし 画 面 左 上 の LABScreen をチ ェックし 画 面 右 下 の Import ボタンを 押 します 完 了 すると 緑 色 のゲージが 一 番 右 側 まで 行 きます Close を 押 します 16

6.2 LABScreen データのインポート 方 法 LABScreen 解 析 用 データは LABScan(Luminex)の 測 定 用 PC の 以 下 の 場 所 に 自 動 的 に 保 存 されています Luminex IS2.3 をご 使 用 の 場 合 :C:\My Batch\Output Luminex xponent3.1/4.2 をご 使 用 の 場 合 :C:\ ProgramData\Luminex\xPonent31\OutPut または C:\My Session ファイル 名 は 測 定 の 際 に 入 力 したバッチ 名.csv となっています 測 定 PC と 別 の PC で 解 析 する 場 合 は 上 記 のファイルを USB 等 で 移 動 させて 下 さい 1. HLA Fusion 3.0 アイコンをクリックし User Name Password を 入 力 し ログインします 初 期 画 面 左 下 の LABScreen をクリック 後 画 面 左 上 にあるフォルダのアイコンをクリックします 2. 解 析 したいバッチファイルを 選 択 します 複 数 選 択 する 場 合 は Shift または Ctrl キーを 押 しながら 選 択 して 開 く を 押 してください その 後 解 析 したいバッチファイルを 選 択 します もし 過 去 に 解 析 したファイルを 再 度 読 み 込 む 時 は Include Imported にチェックして 下 さい 3. 中 央 画 面 に Session ID Catalog ID が 自 動 入 力 されます Catalog ID が 合 っているか 必 ず 確 認 をしてく ださい Session ID に 特 殊 記 号 が 含 まれていると HLA Fusion で 解 析 できないので 必 ず 半 角 英 数 字 とハイフン アンダーバーのみを 使 用 します カタログ ID の 読 み 方 : 製 品 コード 陰 性 血 清 ロット_ビーズロット_revision 例 : LABScreen Single Class I 陰 性 血 清 ロット 14 ビーズロット 8 revison2= LS1A04NC14_008_02 17

4. 陰 性 血 清 ( 一 番 目 の 検 体 )の NS のボックスをチェックし Import ボタン 横 の Check Control ボタンを 押 し 陰 性 血 清 の 測 定 データとメーカーデータとを 比 較 します 5. 陰 性 血 清 の 測 定 データがメーカーデータと 乖 離 していた 場 合 には コンタミネーションが 疑 われます 問 題 ない 場 合 には Import ボタンをクリックします メーカーデータ 測 定 データ 6. 画 面 右 上 にある Navigator に インポートしたセッションが 表 示 されるので クリックします 青 字 : 未 解 析 のセッション 黒 字 : 解 析 済 セッション 7. Summary が 表 示 されます 各 検 体 をダブルクリックすると 解 析 画 面 が 表 示 されます 18

6.3 LABScreen Mixed 解 析 6.3.1 解 析 手 順 1. 画 面 左 下 Statistics のコントロール 値 が 施 設 基 準 と 比 較 して 問 題 ない 事 を 確 認 してください 2. 結 果 は HLA Class I 抗 体 Class II 抗 体 および MICA 抗 体 の 陰 性 / 陽 性 が 判 定 できます MICA 抗 体 の 結 果 を 確 認 するには 画 面 左 下 の MIC というタブをクリックします 3. 判 定 は Final Assignment の Positive Negative Undetermined( 判 定 保 留 ) を 確 認 します 判 定 後 Save ボタンをクリックします 赤 色 の 横 線 : 陽 性 カットオフライン 陽 性 カットオフ 以 上 のビーズが 一 つでもあれば Positive と 判 定 されます 緑 色 の 横 線 : 陰 性 カットオフライン すべてのビーズが 陰 性 カットオフライン 以 下 であれば Negative と 判 定 されます グレーゾーン: 陰 性 カットオフラインと 陽 性 カットオフラインの 間 にビーズがある 場 合 Undetermined と 判 定 されます カットオフラインは 各 施 設 で 各 自 検 討 して 下 さい HLA Class I HLA Class II 1 コントロール 値 の 確 認 2 判 定 結 果 の 確 認 3 判 定 結 果 の 保 存 19

6.3.2 LABScreen Mixed の 判 定 :NBG ratio に 関 して LABScreen Mixed では NBG ratio という 値 を 用 いて 陽 性 陰 性 のカットオフを 定 めます NBG ratio は NC ビーズに 対 して 各 抗 原 ビーズがどれくらい 反 応 したかの 比 率 を 表 すパラメーターです NBG ratio = ( 検 体 各 ビーズ 値 - 検 体 NC ビーズ 値 )/(NC 血 清 各 ビーズ 値 - NC 血 清 NC ビーズ 値 ) NBG ratio のデフォルト 値 は 陽 性 カットオフ 値 が 1.5 陰 性 カットオフ 値 が 1.2 となっていますが 各 施 設 で の 検 討 を 基 にカットオフ 値 を 変 更 する 事 が 可 能 です LABScreen Mixed のカットオフ 値 を 変 更 する 方 法 : 使 用 する 解 析 カタログ 毎 に 設 定 する 必 要 があります 1. HLA Fusion にログイン 後 Utilities>Antibody Product Configuration>Set Mixed Product Configuration をクリックします 2. 下 記 画 面 が 開 きますので Catalog ID から 使 用 するカタログを 選 択 し カットオフ 値 の 変 更 を 行 います 3. 陽 性 カットオフ(Positive Threshold) 陰 性 カットオフ(Negative Threshold)の 欄 に 施 設 で 検 討 した 値 を 手 入 力 します 入 力 後 は 必 ず Save を 押 します 20

6.4 LABScreen Single Antigen 解 析 6.4.1 解 析 手 順 1. 画 面 左 下 Statistics のコントロール 値 が 施 設 基 準 と 比 較 して 問 題 ない 事 を 確 認 してください 2. オレンジ 色 の 縦 線 (デフォルトのカットオフライン)にカーソルを 合 わせると 蛍 光 値 が 表 示 されますので 各 施 設 の 蛍 光 値 のカットオフ 基 準 に 合 わせて 左 右 にドラッグしてカットオフラインを 検 討 して 下 さい X8 X6 X4 自 動 判 定 におけるデフォルトの 陽 性 カットオフラインは X6 です HLA Fusion はビーズの 反 応 を X8,X6,X4,X2 とグループ 分 けして 解 析 します 解 析 のアルゴリズムは nmfi 値 ( 蛍 光 値 )のショルダー( 蛍 光 値 が 急 に 下 がる 点 ) CREG( 交 差 反 応 ) エピトープ 等 に 基 づいています カットオフの 設 定 は 各 施 設 の 基 準 に 基 づいて 行 って 下 さい 変 更 する 際 には 各 施 設 で 定 めた nmfi 値 の 他 に 抗 原 特 異 性 (CREG 患 者 の HLA タイプの 反 応 ) 等 を 参 考 に 検 討 して 下 さい 3. 画 面 下 の CREG の 表 Epitope Analysis Results から 抗 原 特 異 性 を 確 認 します 下 記 の 表 は 2C 5C など 各 CREG を 表 しています 紫 色 の 抗 原 が 陽 性 と 判 定 されたものです CREG で 反 応 性 が 説 明 できる 場 合 がありますので カットオフ 変 更 の 際 に 参 考 にして 下 さい 抗 原 レベルで 乖 離 している 例 1 Mean(Raw)となっている 場 合 は 設 定 の 変 更 を 行 って 下 さい 2 Utilities > Antibody Product Configuration > Set Analysis Configuration を 選 択 し Product Type を LABScreen Single Antigen を 選 びます 3 その 後 画 面 下 の 下 記 のチェックボックス にチェックして Save して 下 さい Epitope Analysis Results では Spec : 抗 原 特 異 性 >=X6 : 陽 性 カットオフより 高 い 反 応 のビーズ 数 <X6 : 陽 性 カットオフより 低 い 反 応 のビーズ 数 Mean = 各 抗 原 ビーズ 値 の 平 均 の nmfi( 蛍 光 値 )が 分 か ります 抗 原 レベルで 反 応 が 乖 離 しているものが 無 いかを 確 認 します 21

4. 抗 原 レベルでの 特 異 性 を 確 認 する 場 合 には 画 面 上 部 の Sort Ag ボタンより グラフをローカス 毎 に 並 び 替 えます もとに 戻 す 場 合 は Refresh ボタンを 押 します 5. 画 面 中 央 上 部 の DNA にチェックすると 抗 原 表 記 がアリル 表 記 に 切 り 替 わります アリルによって 反 応 性 が 異 なる 場 合 がありますので 患 者 ドナーのアリル 情 報 がある 場 合 は 参 照 してください アリルをアサ インする 場 合 には 6.4.2 を 参 照 ください 例 :Cw10 Cw10 C*03:02 C*03:04 6. 陽 性 と 判 断 した 抗 原 を Epitope Analysis Results より 選 択 し > ボタンで 移 動 します 複 数 選 択 する 場 合 Shift キーもしくは Ctrl キーを 押 しながら 選 択 します 取 り 消 したい 抗 原 がある 場 合 は 選 択 後 Remove を 押 します 7. 解 析 後 は 必 ず 画 面 右 下 の Save をクリックしてください 一 度 保 存 したデータを 再 保 存 する 場 合 は Confirm ボタンをクリックしてください 22

6.4.2 アリルレベルでの 特 異 性 をアサインする 場 合 1. 画 面 右 下 の Raw Data ボタンをクリックします 2. 下 記 画 面 より 陽 性 ビーズのアリルをダブルクリックし Close します ダブルクリック 3. 解 析 画 面 右 下 の Final Assignment のカラムに 陽 性 となったアリルが 表 示 されます 最 後 に 画 面 右 下 の Save を 押 します 追 加 したアリルはレポートに 反 映 されます 追 加 されたアリル 23

6.4.3 DQ DP 抗 体 の 解 析 DQ DP 抗 体 は デフォルト 設 定 では DQB1/DPB1 の 反 応 性 に 基 づいてソフトが 自 動 判 定 しています DQ DP 抗 体 を 解 析 する 際 には DQA1/DPA1 の 特 異 性 も 確 認 します 1. 解 析 画 面 右 上 の DQA1/DPA1 にチェックを 入 れます 2. DQA1/DPA1 に 陽 性 反 応 に 関 係 する 特 異 性 があった 場 合 には 自 動 で Epitope Analysis の 画 面 に DQA1/DPA1 のア リルが 表 示 されます 前 後 で 結 果 を 比 較 して 下 さい 3. 次 に 画 面 上 部 の Sort Ag ボタンを 右 クリックし Sort by DQA1/DPA1 をクリックします 元 に 戻 す 場 合 は Refresh ボタンを 押 します 4. DQA1/DPA1 のアリル 情 報 でグラフが 並 びかえされます 陽 性 と 判 定 された 抗 原 アリルは 紫 色 で 特 異 性 が 表 示 されるので 特 異 性 を 比 較 確 認 します 元 に 戻 す 場 合 は Refresh ボタンを 押 します 5. 陽 性 と 思 われた DQA1/DPA1 アリルは Epitope Analysis 画 面 で 選 択 して >ボタンでアサインします 24

6.4.4 DSA(Donor Specific Antibody:ドナー 特 異 的 抗 体 )の 判 定 方 法 患 者 がドナー 特 異 的 抗 体 を 持 っているかどうかを 自 動 判 定 するためには 患 者 とドナーのタイピング 情 報 を HLA Fusion に 入 力 する 必 要 があります 1. 解 析 画 面 上 部 のアイコンをクリックします 2. Patient/Donor Flag から Patient を 選 択 します Patient ID First Name Last Name を 半 角 英 数 で 記 入 します 入 力 したら 必 ず 画 面 右 下 の Save を 入 力 します 以 上 で Patient ID が 解 析 中 の Sample ID に 紐 付 きます 追 加 の 編 集 は 画 面 左 下 の Edit/Update にチェックします 3. 次 に HLA Tests タブをクリックして 患 者 の HLA タイプ 情 報 を 入 力 し 必 ず Save を 押 します 必 要 に 応 じて クレアチニン 移 植 歴 治 療 歴 クロスマッチのデータも 隣 接 するタブから 順 次 入 力 できます HLA アリル 名 の 入 力 HLA 抗 原 名 の 入 力 4. General Info タブに 戻 り 画 面 下 の Add New ボタンを 押 します Patient/Donor Flag から Donor を 選 択 し 上 記 の 2 3 と 同 様 の 手 順 で 入 力 します 以 上 で 患 者 情 報 ドナー 情 報 の 入 力 が 完 了 します Patient/Donor Information の 画 面 を 一 旦 Close します 5. 解 析 画 面 上 部 から 再 度 アイコンをクリックし 画 面 右 下 の Associate Donor IDs クリックします 登 録 したドナーID を 左 側 から 選 択 し > ボタンで 右 側 に 移 動 し OK を 選 択 し Close します 25

6. 解 析 画 面 に 戻 り 画 面 右 下 のMマークを 押 すと DSA 情 報 がチェックできます これらの 情 報 は 全 てレポートに 反 映 させる 事 ができます (6.4.7 を 参 照 ) 患 者 タイピング 情 報 ドナータイピング 情 報 陽 性 と 判 定 した 抗 体 陽 性 と 判 定 した DSA 陽 性 判 定 外 の DSA 26

6.4.5 DSA のモニタリング 方 法 HLA Fusion を 使 用 すれば DSA のモニタリングを 簡 便 に 行 う 事 ができます 本 機 能 を 使 用 するには 該 当 Sample のテストデータが 解 析 済 みである 事 (6.4.1 を 参 照 ) Patient ID と Sample ID が 紐 付 けされている 事 (6.4.4 を 参 照 ) 患 者 情 報 ドナー 情 報 その 他 必 要 情 報 が 入 力 されている 事 (6.4.4 を 参 照 ) 以 上 の 条 件 を 満 たしている 必 要 があります 1. HLA Fusion の 画 面 上 部 から Patient Info > Ab Tracking をクリックします 2. Patient ID Donor ID を 選 択 します 3. 日 付 を 指 定 し Find をクリックします 4. データが 画 面 中 央 に 表 示 されます モニタリングするデータにチェックします 全 て 選 ぶ 場 合 は include を 右 クリックでし Select All を 選 択 します (しばらく 時 間 がかかる 場 合 があります ) 5. 必 要 に 応 じて Creatinine Transplant Treatment にチェック します 6. DQA/DPA をチェックします 最 後 に Track DSA にチェックを 入 れます 画 面 下 に HLA Class I ClassII の DSA のモニタリングのグラフが 表 示 されます 7. 画 面 右 下 の Graph Function をクリックし Set Time Scale Interval (Days)を 選 択 して 横 軸 の 目 盛 り 間 隔 を 調 整 できます 8. グラフのエクスポートは グラフを 右 クリック 後 Export Graph > Line (Time Scale)を 選 択 します 27

6.4.6 LABScreen Single Antigen と Supplement の 結 合 解 析 方 法 1. 6.2 と 同 様 に Import ファイルを 行 いますが データのインポート 時 に LABScreen Single Antigen 及 び Supplement のデータを 同 時 に 読 み 込 み チェックします 2. Combined タブを 選 択 し NC 血 清 にチェックを 入 れて Import をクリックします 3. 解 析 画 面 上 部 の DNA にチェックを 入 れ アリル 毎 の 反 応 性 の 違 いを 確 認 します 4. 基 本 的 な 解 析 方 法 は 通 常 の LABScreen Single Antigen と 同 様 です (6.4.1 を 参 照 ) 28

6.4.7 レポートの 作 成 1. 画 面 上 部 にあるメインメニューの Report をクリックします 2. 画 面 左 部 分 で レポート 作 成 したいデータの 検 索 を 行 います データ 解 析 した 日 付 で 検 索 する 場 合 Session Date を 選 択 して Find ボタンを 押 します その 後 Generic Antibody>Antibody Custom を 選 択 します 3. 画 面 右 に Set Up ボタンが 表 示 されますので クリックします 4. レポートに 出 力 したい 項 目 にチェックを 入 れます ただし 患 者 情 報 やドナー 情 報 等 入 力 されていない 情 報 Save していない 解 析 結 果 等 は 出 力 されません Report 名 を 入 力 して 画 面 右 側 の Save を 押 して 保 存 します レポートタイトル ( 英 数 字 半 角 20 字 まで 入 力 患 者 ID 名 前 アサイン した 抗 体 DSA 以 外 の 陽 性 抗 体 を 黒 丸 で 囲 みます DSA を 赤 丸 で 囲 みます ドナー 情 報 DSA の 有 無 NC PC 値 %PRA など 反 応 グラフの 表 示 29

5. 画 面 中 央 の Sessions タブより 解 析 したいデータにチェックを 入 れます セッション 名 の 横 の + ボタン を 押 すと さらに 詳 細 情 報 が 表 示 されます 一 つの 検 体 だけ 選 択 する 事 もできます 6. View Report をクリックすると 下 記 の 様 なレポートが 表 示 されます 7. 画 面 左 上 のアイコンより PDF で 保 存 または 印 刷 できます 30

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7.LABScreen Single Antigen よくある 質 問 (FAQ) 7.1 陽 性 コントロールビーズ 値 (PC 値 )が 低 い 場 合 があるのですが 原 因 は 何 でしょうか?この 時 どのように 対 処 すべきでしょうか? LABScreen には ヒト IgG がコーティングされた 陽 性 コントロールビーズが 予 め 混 合 されおり 蛍 光 二 次 抗 体 ( 抗 ヒト IgG)がしっかりと 結 合 しているかどうかを 確 認 する 事 ができます PC 値 が 低 くなる 原 因 としては 二 次 抗 体 の 劣 化 や サンプルに 含 まれる IgM 等 の 阻 害 物 質 による 二 次 抗 体 と ビーズの 結 合 阻 害 の 影 響 が 考 えられます 通 常 であれば 7000-8000 程 度 反 応 しますが それよりも 明 らか に 低 い 値 であれば 注 意 が 必 要 です 全 ての 検 体 で 陽 性 コントロールが 低 い 場 合 は 二 次 抗 体 の 劣 化 が 疑 われますので 新 しい 二 次 抗 体 をご 使 用 ください 二 次 抗 体 は 粉 末 の 状 態 で 届 きますので それを 添 付 文 書 で 指 定 された 量 の 滅 菌 蒸 留 水 (たいて いは 1mL で 希 釈 しますが ロットによって 異 なる 事 がありますのでご 注 意 下 さい)で 溶 解 後 冷 蔵 保 存 で 6 カ 月 以 内 に 使 用 して 下 さい 特 定 のサンプルだけ 陽 性 コントロールが 低 い 場 合 は サンプル 中 に 含 まれる IgM による 反 応 阻 害 が 疑 われま すので DTT * 処 理 を 行 って 下 さい DTT 処 理 のプロトコルは アメリカ 組 織 適 合 性 学 会 (ASHI)で 推 奨 され ている 方 法 です *DTT:ジチオトレイトール (dithiothreitol) DTT 処 理 プロトコル( 第 4 回 ASHI) 1. DTT 溶 液 (0.05M) 10 ul に 対 して 血 清 を 90 ul 加 えます (DTT の 終 濃 度 は 0.005M) 2. しっかり 混 ぜた 後 37 で 30-45 分 インキュベートします 3. 1300 g で 10 分 間 遠 心 します 32

7.2 陰 性 コントロール 値 (NC ビーズ 値 )が 高 い 場 合 があるのですが 原 因 は 何 でしょうか?この 時 どのように 対 処 すべきでしょうか? LABScreen には 何 もコーティングさしていないラテックスビーズが 予 め 混 合 されおり ビーズ 自 体 に 対 す る 非 特 異 結 合 が 無 いかを 確 認 する 事 ができます NC 値 が 高 い 原 因 としては サンプル 中 にラテックスに 対 する 抗 体 がある 場 合 や その 他 のタンパク 質 等 の 胸 雑 物 等 の 影 響 で 非 特 異 反 応 している 事 が 考 えられます 免 疫 グロブリン 療 法 を 行 っている 場 合 には 非 特 異 反 応 が 高 くなる 可 能 性 がありますので 30 日 以 上 間 隔 を あけてから LABScreen アッセイして 下 さい ビーズに 対 する 非 特 異 結 合 を 除 去 するためには Adsorb Out( 商 品 コード:ADSORB)の 使 用 をお 勧 めしてい ます Adsorb Out は 何 もコーティングされていないビーズであり このビーズとサンプルを 先 に 反 応 させ ることで 非 特 異 反 応 を 除 去 します ただし 全 てのサンプルで 非 特 異 反 応 が 低 下 するとは 限 りません Adsorb Out メーカー 推 奨 プロトコル(1 テスト 当 り) 1. サンプル 血 清 を 新 しい 1.5mL チューブに 30 ul 入 れます 2. Adsorb Out の 入 ったチューブをボルテックスします 3. Adsorb Out ビーズを 血 清 を 分 注 したチューブに 3 ul 加 え 蓋 を 締 めて 軽 くボルテックスします 4. 室 温 で 30 分 間 振 とうしながらインキュベーションします 5. 15000 rpm で 5 分 間 超 遠 心 します 6. 上 清 を 新 しい 別 の 1.5 ml チューブに 移 します この 時 チューブ 底 の Adsorb Out ビーズを 吸 わない 様 に 注 意 します 使 用 したビーズは 再 利 用 できません もし Adsorb Out ビーズが 混 入 してしまった 場 合 には 再 度 超 遠 心 して 上 清 を 移 します タンパク 等 による 非 特 異 反 応 が 疑 われた 場 合 には FBS 処 理 を 行 うとバックグラウンドが 下 がる 場 合 があり ます FBS 処 理 プロトコル( 参 考 情 報 ) 1. 血 清 100 ul に 対 して FBS 3 ul を 加 えます 2. 37 で 20-30 分 インキュベートし 10,000g で 20 分 遠 心 します 3. 中 間 層 の 血 清 を 別 のチューブに 移 し LABScreen Assay に 使 用 します 33

7.3 プロゾーン 様 現 象 とは 何 でしょうか?プロゾーン 様 現 象 はどのように 対 応 したら 良 いでしょ うか? プロゾーン 様 現 象 とは 血 清 中 の 補 体 成 分 がビーズと 抗 体 の 反 応 を 立 体 的 に 阻 害 して 偽 陰 性 となってしまう 現 象 です LABScreen Single Antigen ビーズにおいてプロゾーン 現 象 が 報 告 されています 1) 2) 1) 黒 田 ゆかり, 小 田 秀 隆, 浅 尾 洋 次, 他 :LABScreen Single Antigen におけるプロゾーン 現 象 への 補 体 の 関 与. 日 本 組 織 適 合 性 学 会,18(1): 56 57, 2011. 2) 小 島 裕 人, 藤 井 直 樹, 二 神 貴 臣, 他 :Luminex 法 におけるプロゾーン 様 現 象. 日 本 組 織 適 合 性 学 会,18(2): 157,2011. 特 に 新 鮮 血 清 の 場 合 補 体 の 活 性 が 高 いので 注 意 する 必 要 があります プロゾーン 様 現 象 を 防 ぐためには 補 体 を 不 活 化 する 必 要 があります 補 体 の 不 活 化 に 関 しては DTT 処 理 EDTA 処 理 など 様 々な 報 告 がありますがメーカーとして 明 確 な 推 奨 プロ トコルは 残 念 ながら 存 在 しませんので 各 施 設 でご 検 討 いただく 必 要 があります (3.6.2 参 照 ) ただし 熱 による 非 働 化 処 理 に 関 しては 非 特 異 反 応 が 強 くなる 事 から 推 奨 しておりません DTT 処 理 に 関 し ては ASHI で 推 奨 されている 下 記 のプロトコルを 参 照 ください DTT 処 理 プロトコル( 第 4 回 ASHI) 1. DTT 溶 液 (0.05M) 10 ul に 対 して 血 清 を 90 ul 加 えます (DTT の 終 濃 度 は 0.005M) 2. しっかり 混 ぜた 後 37 で 30-45 分 インキュベートします 3. 1300 g で 10 分 間 遠 心 します また LABScreen Single Antigen だけの 検 査 結 果 を 絶 対 視 せず 他 法 (LABScreen Mixed/PRA Flow PRA CDC クロスマッチ 等 )の 検 査 結 果 と 比 較 し 総 合 的 に 判 断 する 事 が 大 切 です 34

7.4 HLA 自 然 抗 体 とは 何 でしょうか?HLA 自 然 抗 体 には 意 義 があるのでしょうか? 感 作 歴 ( 妊 娠 歴 輸 血 歴 移 植 歴 )が 全 くない 健 常 人 でも HLA 抗 体 が 検 出 された 場 合 に HLA 自 然 抗 体 と 呼 び 通 常 の HLA 抗 体 (アロ 抗 体 )と 異 なると 考 えられています 両 者 の 明 確 な 区 別 は 難 しく HLA 自 然 抗 体 リスト( 表 2) や 日 本 人 の 抗 原 頻 度 等 の 情 報 ( 表 3)を 基 に 判 断 するしかありません また HLA 自 然 抗 体 の 意 義 に 関 しては 明 らかになっていませんので 検 査 結 果 から 除 外 せずに 報 告 し 必 要 に 応 じて 自 然 抗 体 の 可 能 性 あり 等 の 追 加 コメントがあると 理 解 し 易 いでしょう ただし 報 告 ルール は 各 施 設 でご 検 討 ください 近 年 臓 器 移 植 において 患 者 が 補 体 依 存 性 HLA 抗 体 を 持 つ 場 合 に 臓 器 の 生 着 率 が 悪 いという 事 が 分 かってき ました 1)~3) C1qScreen と LABScreen を 組 み 合 わせて 使 用 すれば 検 出 された 抗 体 が 臨 床 的 に 意 義 の 高 い 補 体 依 存 性 抗 体 かどうかを 判 別 する 事 ができると 考 えられます ただし 補 体 非 依 存 性 の 抗 体 に 意 義 が 無 いというという 事 では 無 く 今 後 さらなる 研 究 データの 蓄 積 が 大 切 と 考 えられます 1)Thammanichanond, D.,Mongkolsuk T, Rattanasiri S, et al. Significance of C1q-fixing Donor-Specific Antibodies After Kidney Transplantation. Transplant Proc, 2014; 46(2):368 71. 2)Kheradmand, T., Anthony TL, Harland RC, et al. Antibody-mediated rejection in ABO compatible husband to wife living donor liver transplant and review of the literature. Hum Immunol. 2014. 3)Kubal CA, Mangus RS, Saxena R, et al. Crossmatch-positive liver transplantation in patients receiving thymoglobulin-rituximab induction. Transplantation. 2014;97(1):56 63. LABScreen Single Antigen だけの 検 査 結 果 を 絶 対 視 せず 他 法 の 検 査 結 果 と 比 較 し 総 合 的 に 判 断 する 事 が 大 切 です 表 2:メキシコの 健 常 人 に 見 られた HLA 抗 体 (Class I) Mex:メキシコ 人 集 団 における HLA 抗 原 の 有 無 Jap: 日 本 人 集 団 における HLA アリル 頻 度 35

7.5 ネガティブコントロール 血 清 は メーカーの 製 品 を 使 用 すべきですか? はい メーカーであるワンラムダで 販 売 している 製 品 (LS-NC)をご 使 用 することを 推 奨 しています 理 由 は ワンラムダのネガティブコントロール 血 清 は LABScreen ビーズの 各 製 品 各 ロットで 事 前 に 検 証 されている 為 です 結 果 は 全 てデータシートに 記 入 されており 解 析 ソフトで 解 析 する 際 は メーカーQC データと 実 際 に 行 ったネガティブコントロール 結 果 を 簡 便 に 比 較 する 事 ができます (6.4.1 参 照 ) これによって 操 作 方 法 にミスがないか コンタミネーションがないかどうかを 確 認 できます LABScreen ネガティブコントロール 血 清 のデータシート URL:http://www.onelambda.com/product-attachment.aspx?c1=antibody-detection&c2=labscreen-sup-sup -&c3=ancillary-products-controls-&c4=3&c5=18&c6=90 メーカーデータ 測 定 データ 36

7.6 DQ DP 抗 体 が 存 在 する 場 合 どのような 事 に 注 意 すれば 良 いですか? 近 年 移 植 後 の DQ 抗 体 や DP 抗 体 が 拒 絶 の 兆 候 として 見 られるという 報 告 があり DQ DP 抗 体 の 重 要 性 が 高 まってきています 1. Willicombe M, et al. De novo DQ donor-specific antibodies are associated with a significant risk of antibody-mediated rejection and transplant glomerulopathy. Transplantation. 2012;94(2):172-7. 2. Devos JM, et al. Donor-specific HLA-DQ antibodies may contribute to poor graft outcome after renal transplantation. Kidney Int 2012;82(5):598-604. 3. Nelson KA, Youngs D, Marks MH, et al. Acute humoral rejection is associated with antibodies to HLA-DP (Abstract). Am J Transplant 2005; 5(Suppl 11): 245. 4. Jianxin Qiu, Junchao Cai,1 Paul I. Terasaki, et al. Detection of Antibodies to HLA-DP in Renal Transplant Recipients Using Single Antigen Beads. LABScreen Single Antigen Class II ( 製 品 コード:LS2A01)の DQ DP 抗 原 ビーズには それぞれ(DQA1/DQB1) (DPA1/DPB1)がコーティングされており 実 際 には 1 ビーズにα 鎖 β 鎖 の 2 種 類 の 抗 原 が 存 在 します 通 常 は DQB1 や DPB1 の 抗 原 の 方 が DQA1 や DPA1 よりも 多 型 性 に 富 んでいる 為 DQB1 や DPB1 に 対 する 抗 体 が 検 出 されやすい 傾 向 にありますが DQA1 や DPA1 に 対 する 抗 体 も 検 出 される 事 があります そのため 解 析 する 際 には 必 ず DQA1 や DPA1 に 対 する 特 異 性 の 解 析 も 行 う 事 をお 勧 めします 解 析 ソフト HLA Fusion 3 では DQA1 や DPA1 を 容 易 に 解 析 する 機 能 があります DQA1/DPA1 にチェックを 入 れると DQA1 DPA1 を 含 めて 自 動 で 再 解 析 を 行 います (6.4.3 参 照 ) ただし DQ DP ローカスに 関 してはそもそもドナー レシピエントのタイピング 情 報 が 無 い 場 合 が 多 く DSA であるかどうかを 判 定 できない 場 合 があります DR ローカスとの 連 鎖 情 報 を 元 に DQ のタイピング 情 報 をあ る 程 度 推 測 する 事 も 出 来 ますが 必 要 に 応 じて DQ DP のタイピングを 追 加 実 施 する 事 をお 勧 めします な お LABType DQ( 製 品 コード:RSO2QT) LABType DP( 製 品 コード:RSO2PT)は DQA1/DQB1 DPA1/DPB1 を 中 ~ 高 解 像 度 でタイピングする 事 ができます 37

7.7 自 己 抗 体 ( 患 者 の HLA に 対 する HLA 抗 体 )が 検 出 されたのですが どのように 考 えればよい のでしょうか? 原 則 として 自 己 に 対 する HLA 抗 体 は 産 生 しませんので 自 己 抗 体 が 検 出 された 場 合 には 結 果 を 注 意 深 く 見 直 す 必 要 があります 検 体 の 取 り 違 えが 無 かったかを 確 認 してください 検 査 自 体 がうまく 行 われたかを 確 認 して 下 さい 特 にバックグラウンド 値 (NC ビーズ 値 )を 確 認 し 施 設 の 定 めた 基 準 値 以 下 である 事 を 確 認 してください 抗 原 レベルでの 自 己 抗 体 の 場 合 HLA アリルレベルで 違 いが 無 いかを 確 認 してください HLA Fusin の 解 析 画 面 において DNA にチェックを 入 れると ビーズのアリル 情 報 が 確 認 できます (6.4.1 参 照 ) 近 年 アリル 特 異 的 な 抗 体 の 存 在 が 明 らかになってきており アリルレベルでの 抗 体 検 査 の 重 要 性 が 高 まっ てきました 患 者 ドナーの HLA アリルが LABScreen Single Antigen ClassI Class II に 含 まれていな い 場 合 は LABScreen Single Antigen Supplement Class I ClassII(LS1ASP01 LS2ASP01)で 追 加 試 験 を 行 う 事 をお 勧 めします 38

8.LABScreen Single Antigen 共 通 化 プロジェクト LABScreen Single Antigen は 簡 便 に HLA 特 異 性 を 同 定 できる 画 期 的 な 試 薬 であり 国 内 外 で 広 く 使 用 され ているものの その 判 定 基 準 等 に 関 して 国 内 外 のコンセンサスは 得 られていませんでした そこで Emory 大 学 の Dr.Bray 先 生 を 中 心 として LABScreen 国 際 標 準 化 プロジェクト が 行 われました Phase 1 として 各 施 設 間 での 独 自 のプロトコルで 同 一 検 体 を 測 定 した 場 合 に 結 果 にどれほどのばらつき が 生 じているかを 検 討 しました Phase2 にて 全 施 設 で 共 通 プロトコルを 用 いることで ばらつきがどの 程 度 抑 えられるかの 検 証 が 行 われました 本 プロジェクトの 結 果 は 2011 年 第 16 回 国 際 組 織 適 合 性 学 会 にて 結 果 報 告 され プロトコルを 標 準 化 することで 結 果 のばらつきが 改 善 される 事 が 分 かりました そこで 日 本 においても 2012 年 より 共 有 化 プロジェクト と 題 して 同 様 の 検 討 を 行 い Dr.Bray 先 生 及 び 日 本 国 内 の 主 要 臓 器 移 植 施 設 5 施 設 の 先 生 方 のご 協 力 のもと 各 施 設 間 でのばらつきや 海 外 のデータとの 比 較 を 行 いました 本 プロジェクトでは Dr.Bray 先 生 より LABScreen 国 際 標 準 化 プロジェクト で 使 用 したものと 同 一 の 血 清 をご 提 供 頂 き メーカープロトコルに 従 って 実 施 しました その 結 果 日 本 国 内 の 各 施 設 のデータは 非 常 にばらつきが 小 さく 世 界 のデータに 遜 色 ないデータが 得 られました 追 加 実 験 として LABScreen Single Antigen が 各 施 設 においてどれくらい 日 差 再 現 性 同 時 再 現 性 がある も 検 討 し 各 施 設 内 での 日 差 再 現 性 同 時 再 現 性 は 非 常 に 高 い 結 果 が 得 られました 共 通 のメーカープロト コルを 用 いることで 精 度 の 高 いデータを 得 る 事 が 可 能 であり 異 なる 施 設 間 のデータや 国 内 と 世 界 での データの 比 較 議 論 は 十 分 可 能 であるということが 示 されました 上 記 共 有 化 プロジェクト に 関 して 福 岡 赤 十 字 病 院 橋 口 裕 樹 先 生 が 2014 年 第 47 回 日 本 臨 床 腎 移 植 学 会 にて LABScreen Single Antigen 共 有 化 プロジェクト 日 本 における Single Antigen MFI の QC 報 告 として 発 表 されています 39

9. 付 録 : 操 作 手 順 書 実 施 日 : 年 月 日 実 施 者 名 : 項 目 名 説 明 確 認 欄 前 処 理 検 体 ( 血 清 または 血 漿 )を 凍 結 融 解 しっかり 転 倒 混 和 8000~10000 g で 10 分 間 遠 心 不 純 物 が 多 い 検 体 は 遠 心 速 度 時 間 を 増 やす 遠 心 後 慎 重 に 中 間 層 から 検 体 を 回 収 試 薬 調 整 96 ウェルプレートの 最 初 のウェルに 陰 性 血 清 20 ul を 添 加 2 番 目 のウェルから 前 処 理 済 みの 検 体 20 ul を 添 加 1 回 目 の 反 応 洗 浄 操 作 ( 合 計 3 回 ) LABScreen ビーズを 軽 くスピンダウンし 蓋 の 裏 に 付 いた 液 を 落 とし 数 秒 間 ボルテックス キャップを 開 け 10 回 程 度 ピペッティングをして LABScreen ビーズをよ く 混 合 ビーズ 5uL ずつ 検 体 が 入 った 各 ウェルに 入 れ ピペッティング トレーシールを 貼 り 遮 光 し 室 温 (20-25 )で 振 とう 30 分 間 反 応 反 応 中 に 蒸 留 水 で 10 Wash Buffer を 蒸 留 水 で 10 倍 希 釈 1 Wash buffer は 1 検 体 あたり 全 部 で 約 1.1 ml 1 各 ウェルに 1 Wash buffer を 加 える 一 回 目 洗 浄 :150uL 2 3 回 目 洗 浄 :200uL トレーシールを 貼 り 1300 g で 5 分 間 (または 1500g で 3 分 間 ) 遠 心 1 回 2 回 3 回 二 次 抗 体 の 調 整 二 次 抗 体 の 反 応 2トレーシールを 剥 がし フリッキングして 上 清 を 除 去 フリッキングは 真 下 に 力 強 く 一 回 のみ 行 う 3フリッキング 後 トレーを 下 向 きにしたままキムタオルに 5 秒 間 押 し 付 け 軽 く 5 回 タップし 残 液 を 除 去 4ビーズのみの 状 態 で ビーズがほぐれる 程 度 ( 約 2 秒 ~5 秒 程 度 )ボ ルテックス かけすぎない 様 に 注 意 3 回 目 の 遠 心 時 ( )に 1 テストにつき 100uL の 希 釈 二 次 抗 体 を 作 成 1 テスト 当 たり 1uL の 二 次 抗 体 を 1 Wash Buffer 99uL に 加 える 洗 浄 操 作 終 了 後 希 釈 二 次 抗 体 100uL を 各 ウェルに 加 える トレーシールを 貼 り 遮 光 し 室 温 (20-25 )で 振 とう 30 分 間 反 応 LABScan システム または LABScan 3D システムの 電 源 を 入 れる 40

洗 浄 操 作 ( 合 計 2 回 ) インキュベーション 後 洗 浄 バッファーは 加 えず そのまま 1300 g で 5 分 間 (または 1500g で 3 分 間 ) 遠 心 1 真 下 に 力 強 く 一 回 のみフリッキングして 上 清 を 除 去 0 回 1 回 2 回 測 定 機 器 の 設 定 等 2フリッキング 後 トレーを 下 向 きにしたままキムタオルに 5 秒 間 押 し 付 け 軽 く 5 回 タップし 残 液 を 除 去 3ビーズのみの 状 態 で ビーズがほぐれる 程 度 ( 約 2 秒 ~5 秒 程 度 )ボ ルテックス かけすぎない 様 に 注 意 41 Wash buffer 200uL を 各 ウェルに 添 加 1300g で 5 分 間 (または 1500g で 3 分 間 ) 遠 心 洗 浄 終 了 後 に 1 PBS 80uL を 各 ウェルに 加 える LABScan システムのマニュアルに 従 い ウォームアップ プライム ア ルコール 洗 浄 蒸 留 水 によるプローブ 洗 浄 等 を 行 う 専 用 の 補 正 ビーズを 用 いてキャリブレーションを 行 う 使 用 した 試 薬 ロット サンプル 名 等 の 情 報 を 基 に 測 定 用 バッチを 作 成 し 測 定 を 開 始 する すぐに 測 定 できない 場 合 は シールを 貼 り 冷 蔵 庫 で 保 管 して 24 時 間 以 内 に 測 定 する 時 間 がたった 場 合 には 測 定 直 前 に 各 ウェルをしっかりとピペッティン グ 等 で 混 合 する 測 定 終 了 後 LABScan システムを サニタイズ 洗 浄 操 作 3 回 以 上 行 っ た 後 シャットダウンする 41

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