脱 灰 液 K-CX 使 用 ガイド
使 用 説 明 書 K-CX を 使 用 される 前 に 必 ず 本 書 をお 読 み 下 さい 目 次 1. はじめに 1 2. K-CX について 1 3. K-CX を 用 いた 一 般 的 な 脱 灰 手 順 2 4. K-CX の 利 用 法 について 4 5. イヌ 硬 組 織 標 本 作 製 における K-CX 低 温 希 釈 脱 灰 法 7 6. K-CX 脱 灰 による 特 殊 染 色 及 び 免 疫 組 織 化 学 染 色 の 検 討 9 7. FAQ 12
1.はじめに 脱 灰 とは 骨 歯 石 灰 化 病 巣 のような 硬 組 織 は 薄 切 が 非 常 に 困 難 です 硬 組 織 を 薄 切 するために あらかじめ 脱 灰 操 作 を 行 います 脱 灰 とは 一 般 的 には 組 織 から 石 灰 分 を 取 り 除 くことで 薄 切 可 能 な 硬 さまで 変 化 させる ことをいいます 2.K-CX について 特 長 * 迅 速 脱 灰 とマイルド 脱 灰 の 両 方 に 適 用 可 能 * 脱 灰 による 組 織 の 歪 みが 少 なく 微 細 構 造 を 良 好 に 再 現 * 免 疫 組 織 染 色 可 能 成 分 塩 酸 キレート 剤 他 用 法 原 液 または 2 倍 希 釈 液 を 常 温 (15~25 )または 低 温 (4~8 )で 使 用 します * 迅 速 脱 灰 法 : 1 原 液 / 常 温 *マイルド 脱 灰 法 : 1 原 液 / 低 温 (4~8 ) 2 2 倍 希 釈 / 常 温 3 2 倍 希 釈 / 低 温 (4~8 ) 脱 灰 のポイント 組 織 にダメージを 与 えないようにすること 1. 組 織 はできるだけ 小 さくする 2. 事 前 に 脱 脂 処 理 を 行 う( 脱 灰 液 の 浸 透 を 良 くする) 3. マイルドに 脱 灰 する( 過 脱 灰 になると 赤 く 染 まりすぎる( 核 が 染 まらない)などの 傾 向 が 見 られるため 低 温 脱 灰 (4~8 )または 水 で 2 倍 希 釈 でのご 使 用 をお 勧 めします ) 4. 脱 灰 しすぎない( 完 了 を 常 時 モニタリング) 1
3.K-CX を 用 いた 一 般 的 な 脱 灰 手 順 手 順 1 固 定 2 脱 脂 3 脱 灰 4 後 処 理 55 5染 包 色 埋 (1) 固 定 組 織 を 十 分 に 固 定 します * 固 定 液 としてはホルムアルデヒド 系 (10%ホルマリン 等 )が 適 しています * 組 織 の 厚 さは 最 大 5mm 程 度 までとします (2) 脱 脂 脱 灰 液 の 浸 透 性 をよくするために 脱 脂 を 行 います 以 下 2 つの 方 法 があります 1アルコールでの 脱 脂 方 法 上 昇 アルコール(70 80 90 100%)に 浸 し 十 分 脱 脂 後 下 降 アルコール(90 80 70%) を 通 して 水 に 戻 す ( 全 工 程 を 約 1 日 かけて 行 う ) 2 混 合 液 での 脱 脂 方 法 1. 純 エタノールに 馴 染 ませる 2.キシレン 1:アルコール 3 の 混 合 液 に 30 分 ~ 数 時 間 浸 漬 する ( 脂 肪 が 溶 出 して 黄 色 くなったら 新 しい 液 に 交 換 して 下 さい ) 3.30 分 程 度 下 降 アルコール(100~70%)を 通 して 水 まで 戻 す 2
(3) 脱 灰 固 定 された 組 織 を K-CX に 浸 漬 し 脱 灰 します ( 浸 漬 時 間 は 温 度 組 織 の 種 類 厚 さにより 異 なります ) * 脱 灰 液 の 液 量 は 脱 灰 する 組 織 の 50 倍 量 です * 溶 出 したカルシウム 化 合 物 の 再 沈 着 を 防 ぐため 2 日 に 1 回 新 しい 液 と 交 換 します * 脱 灰 時 に カルシウム 再 沈 着 を 防 ぐため 組 織 片 を 脱 灰 液 の 上 層 に 置 きます * 脱 灰 温 度 は 常 温 または 低 温 でご 使 用 下 さい * 脱 灰 処 理 容 器 はポリ 容 器 またはガラス 容 器 を 用 いて 下 さい ステンレ スを 含 め 金 属 を 脱 灰 液 に 浸 けないで 下 さい * 大 きい 硬 組 織 は K-CX に 所 定 時 間 浸 漬 した 後 適 当 な 大 きさに 切 断 し K-CX に 戻 してさらに 12~16 時 間 程 度 ( 適 宜 延 長 あるいは 短 縮 ) 浸 漬 します 脱 灰 が 完 了 したかどうかは 組 織 片 に 針 を 刺 すなどして 確 認 して 下 さい 抵 抗 がなくなれば 終 了 です (4) 脱 灰 後 の 処 理 方 法 1. 水 洗 半 日 以 上 水 洗 する * 強 い 水 流 は 組 織 にダメージを 与 えるため できるだけ 穏 やかな 水 流 での 水 洗 が 望 ましい 方 法 2. 中 和 5% 硫 酸 ナトリウム 液 に 入 れて 12~24 時 間 浸 漬 し その 後 水 洗 する * 酸 による 脱 灰 では 長 時 間 にわたると 組 織 が 膨 潤 する 可 能 性 が あります 膨 潤 を 防 ぐため 硫 酸 ナトリウム 水 溶 液 等 で 脱 灰 液 を 中 和 します (5) 包 埋 染 色 脱 灰 後 の 処 理 を 終 了 後 通 常 の 包 埋 染 色 工 程 に 移 ります * 包 埋 工 程 に 移 らない 場 合 は 組 織 を 固 定 液 に 戻 して 下 さい 3
4.K-CX の 利 用 法 について 1 ヒト 組 織 での 使 用 例 K-CX を 利 用 頂 いているお 客 様 の 使 用 例 をご 紹 介 します 原 液 での 利 用 材 料 2 倍 希 釈 液 での 利 用 材 料 の 一 例 です 原 液 での 利 用 法 一 例 骨 組 織 を 含 む 材 料 ( 骨 頭 等 ) メスの 刃 が 刃 こぼれするような 材 料 脱 灰 の 完 了 具 合 を 確 認 してから 水 洗 に 移 ります 3 日 以 上 脱 灰 液 に 入 れた 材 料 は 中 和 液 に 入 れてから 水 洗 します 2 倍 希 釈 液 での 利 用 法 一 例 1 切 り 出 し 終 了 後 水 洗 までカセットに 入 れたまま K-CX の 中 に 入 れておく 材 料 骨 髄 生 検 口 腔 外 科 領 域 の 軟 組 織 ( 歯 根 嚢 胞 等 ) 耳 鼻 科 領 域 の 軟 組 織 ( 鼻 茸 等 ) 肺 手 術 材 料 切 り 出 し 時 の 気 管 支 甲 状 腺 前 立 腺 手 術 材 料 で 石 灰 化 (メスで 切 れる 程 度 )のあるもの 角 化 の 強 い 皮 膚 (かかと 等 ) その 他 石 灰 化 した 小 組 織 2 一 晩 K-CX に 入 れたほうが 良 い 材 料 前 立 腺 TUR: 十 分 に 固 定 が 完 了 したら 全 量 をネットに 入 れ 軽 く 水 洗 後 ネットごと 瓶 に 入 れる 剖 検 の 脊 髄 材 料 3 表 面 脱 灰 に 用 いる 方 法 < 方 法 > 1.シャーレに 濾 紙 を 敷 き 濾 紙 がひたひたになるくらいに 希 釈 液 を 入 れます 2.その 上 に 面 出 ししたブロックを 置 きます 濾 紙 が 乾 いたら 液 を 足 して 使 用 できます 再 度 薄 切 するときは 必 ずブロックを 水 洗 してから 切 って 下 さい 水 洗 しないと 刃 が 錆 びます < 所 要 時 間 の 目 安 > 薄 切 時 切 片 が 分 かれない 程 度 のもの: 30 分 ~2 時 間 切 片 が 分 かれるほど 硬 い 石 灰 化 のあるもの: 3~4 時 間 4
2 動 物 大 腿 骨 の 脱 灰 方 法 手 順 一 例 動 物 大 腿 骨 の 脱 灰 におけるポイント *ポイント: 大 きい 動 物 の 大 腿 骨 脱 灰 の 場 合 は 一 度 に 最 終 段 階 まで 進 めるのではなく 脱 灰 と 整 形 を 段 階 的 に 繰 り 返 す ギ 酸 ホルマリンでは 容 易 に 脱 灰 できない 組 織 や 早 急 に 脱 灰 標 本 を 作 製 しなければならない 場 合 に K-CX を 使 用 すると 便 利 です 手 順 (1) 脱 灰 液 の 調 製 動 物 大 腿 骨 の 場 合 は 原 液 又 は 2 倍 希 釈 液 を 脱 灰 液 として 準 備 します (2) 組 織 の 準 備 * 大 腿 骨 に 付 着 した 余 分 な 組 織 を 除 去 します * 骨 組 織 の 骨 膜 を 痛 めすぎないように 注 意 して 下 さい (3) 固 定 10%ホルマリンに 浸 漬 し 固 定 を 行 います * 小 動 物 (ラット マウス)は 普 通 のメスでは 刃 が 入 らないため カットせずにそのまま 固 定 します * 大 動 物 (イヌなど)は 大 きすぎて 固 定 できないため あらかじめ 電 動 のこぎりやバンドソー 等 でカ ットし 固 定 します (4) 脱 脂 P.2 に 従 う 5
(5) 脱 灰 過 脱 灰 を 避 けるため 低 温 脱 灰 をお 勧 めします < 常 温 脱 灰 処 理 を 行 う 場 合 > * 原 液 2 倍 希 釈 で 常 温 の 場 合 : 短 時 間 で 脱 灰 しますが 厳 格 な 時 間 管 理 が 必 要 です < 低 温 脱 灰 処 理 を 行 う 場 合 > * 原 液 2 倍 希 釈 の 低 温 脱 灰 の 場 合 : 短 時 間 で 脱 灰 が 完 了 し そ の 後 長 時 間 にわたり 染 色 性 が 安 定 します (ラットの 大 腿 骨 例 :2 倍 希 釈 の 場 合 24 時 間 ~5 日 ) * 脱 灰 液 は 2 日 に 1 回 交 換 して 下 さい 脱 灰 操 作 時 のサンプルの 扱 い 方 病 理 カセットに 収 まる 大 きさにできなかった 時 は メッシュ 袋 に 入 れ 脱 灰 液 上 層 へ 位 置 するように 吊 り 下 げるなどして 下 さい 脱 灰 の 終 了 確 認 のため 少 なくとも 1 日 2 回 程 度 針 もしくは 刃 を 入 れ て 脱 灰 の 進 み 具 合 を 確 認 します 針 で 刺 して 抵 抗 がなくなれば 終 了 です (6) 後 処 理 脱 灰 終 了 後 の 組 織 は 流 水 にて 半 日 以 上 水 洗 または 中 和 処 理 を 行 います その 後 包 埋 染 色 工 程 に 移 ります (P.3 の (4) 脱 灰 後 の 処 理 を 参 照 ) (7) 包 埋 染 色 ( 実 際 には 更 に 小 さい 部 分 をスライドにする) 6
5.イヌ 硬 組 織 標 本 作 製 における K-CX 低 温 希 釈 脱 灰 法 イヌの 脊 椎 鼻 腔 等 を 脱 灰 する 場 合 マウス 等 に 比 較 して 組 織 が 大 きく さらに 硬 組 織 のため 脱 灰 は 困 難 です ( 文 献 それを K-CX 低 温 希 釈 脱 灰 法 で 克 服 されている 例 1) を 紹 介 いたします 検 討 条 件 ( 検 討 脱 灰 液 ) HE 染 色 での 検 討 結 果 薄 切 面 での 検 討 結 果 まとめ( 表 ) 補 足 : 脱 灰 処 理 後 のパラフィン 包 埋 条 件 検 討 条 件 ( 検 討 脱 灰 液 ) 検 討 脱 灰 液 の 組 成 条 件 1 条 件 2 条 件 3 ギ 酸 ホルマリン 液 (10%ギ 酸 :10%ホルマリン=1:1) ギ 酸 クエン 酸 液 (50%ギ 酸 :20%クエン 酸 =1:1) 希 釈 K-CX 液 ( 市 販 品 の 2 倍 希 釈 ) 室 温 9 日 室 温 6 日 8 6 日 HE 染 色 での 検 討 結 果 これら 3 種 を 用 いて 得 られた 脱 灰 後 の 結 果 を 以 下 に 示 します 条 件 1~3 で 処 理 後 の HE 染 色 では ほぼ 同 等 の 結 果 が 得 られました 条 件 1 条 件 2 条 件 3 ギ 酸 ホルマリン 液 処 理 での 検 討 結 果 ギ 酸 クエン 酸 液 処 理 での 検 討 結 果 希 釈 K-CX 処 理 での 検 討 結 果 7
薄 切 面 での 検 討 結 果 薄 切 の 容 易 さでは K-CX の 低 温 希 釈 脱 灰 法 が 一 番 薄 切 しやすいことが 分 かりました ( 下 図 参 照 ) 条 件 1 条 件 2 条 件 3 ギ 酸 ホルマリン 液 処 理 での 検 討 結 果 ギ 酸 クエン 酸 液 処 理 での 検 討 結 果 希 釈 K-CX 処 理 での 検 討 結 果 まとめ( 表 ) 脱 灰 液 脱 灰 時 間 薄 切 ( 難 易 度 ) 鼻 腔 上 腕 骨 腰 椎 染 色 性 ギ 酸 ホルマリン 液 室 温 9 日 間 普 通 普 通 普 通 良 ギ 酸 クエン 酸 液 室 温 6 日 間 普 通 普 通 普 通 良 K-CX 8 6 日 間 良 好 良 好 良 好 良 補 足 : 脱 灰 処 理 後 のパラフィン 包 埋 条 件 No. 溶 液 時 間 (hrs) 1 アルコール 70% 1.5 2 アルコール 80% 1.5 3 アルコール 90% 1.5 4 アルコール 95% 1.5 5 アルコール 100% 1.5 6 アルコール 100% 2 7 アルコール 100% 2 8 Hemo-De 1.5 9 Hemo-De 2 10 Hemo-De 2 11 パラフィン 1.5 12 パラフィン 1.5 13 パラフィン 2 合 計 時 間 22 8
6.K-CX 脱 灰 による 特 殊 染 色 及 び 免 疫 組 織 化 学 染 色 の 検 討 ( 参 考 資 料 2 より 抜 粋 ) 検 討 条 件 特 殊 染 色 での 検 討 結 果 免 疫 組 織 化 学 染 色 での 検 討 結 果 まとめ 検 討 条 件 検 体 の 種 類 :ラット 大 腿 骨 (10%リン 酸 緩 衝 ホルマリン 液 で 3 日 以 上 固 定 したもの) 検 討 脱 灰 液 K-CX 脱 灰 液 2 倍 に 希 釈 したもの 低 温 36 時 間 脱 灰 10%EDTA 脱 灰 液 室 温 14 日 間 脱 灰 特 殊 染 色 検 討 結 果 *マッソントリクローム 染 色 * ( 軟 骨 ) K-CX EDTA 9
*サフラニン O 染 色 * ( 軟 骨 ) K-CX EDTA *アルシアンブルーPAS 染 色 * ( 軟 骨 ) K-CX EDTA 10
免 疫 組 織 化 学 染 色 検 討 結 果 *PCNA* ( 骨 髄 ) K-CX EDTA *Lysozyme* ( 骨 髄 ) K-CX EDTA *Hemoglobin* ( 骨 髄 ) K-CX EDTA まとめ 脱 灰 液 脱 灰 条 件 染 色 性 K-CX 低 温 (6~8 )36 時 間 良 EDTA 室 温 14 日 間 良 11
7.FAQ 廃 棄 方 法 方 法 (1) 10L 以 上 入 るタンクまたはバケツを 用 いて K-CX 1L を 水 道 水 で 10 倍 希 釈 します (2) そこに 1N 水 酸 化 ナトリウム 水 溶 液 (およそ 1.4L)を 徐 々に 加 えて 攪 拌 し 中 和 します 最 終 的 な ph はリトマス 試 験 紙 で 確 認 して 下 さい (3) 中 和 処 理 したものは 大 量 の 水 で 希 釈 してから 下 水 に 流 して 下 さい 廃 棄 するにあたって 保 護 手 袋 を 着 用 して 下 さい 換 気 の 良 い 場 所 で 行 って 下 さい K-CX 1 本 1L を 処 理 するための 方 法 を 案 内 しておりますが もし K-CX を 3 本 以 上 廃 棄 する 場 合 は 専 門 の 廃 棄 業 者 に 依 頼 されることをお 勧 めします 貯 蔵 方 法 光 と 熱 を 避 け 密 栓 して 室 温 保 存 して 下 さい 製 品 情 報 < 商 品 コード> CS-5151 CS-5151 4 CS-5154 4 < 包 装 > 1L 1 本 1L 4 本 4L 4 本 取 扱 上 の 注 意 安 全 対 策 すべての 安 全 注 意 を 読 み 理 解 するまで 取 り 扱 わないこと 使 用 前 に 取 扱 説 明 書 を 入 手 すること この 製 品 を 使 用 する 時 に 飲 食 又 は 喫 煙 をし ないこと 個 人 用 保 護 具 や 換 気 装 置 を 使 用 し ばく 露 を 避 けること 保 護 手 袋 保 護 衣 保 護 眼 鏡 保 護 面 を 着 用 すること 取 扱 い 後 はよく 手 を 洗 うこと 環 境 への 放 出 を 避 けること K-CXを 温 めて 使 用 しないこと 応 急 措 置 眼 に 入 った 場 合 水 で 数 分 間 注 意 深 く 洗 う こと コンタクトレンズを 容 易 に 外 せる 場 合 に は 外 して 洗 うこと 医 師 の 診 断 手 当 を 受 ける こと 皮 膚 又 は 毛 髪 に 付 着 した 場 合 多 量 の 水 と 石 鹸 で 洗 い 医 師 の 診 断 手 当 を 受 けるこ と 飲 み 込 んだ 場 合 直 ちに 口 をすすぎ 医 師 の 診 断 手 当 を 受 けること 気 分 が 悪 いときは 医 師 の 診 断 手 当 を 受 け ること 取 り 扱 った 後 手 を 洗 うこと 漏 出 物 は 回 収 すること 参 考 文 献 (ご 入 用 の 方 はご 請 求 下 さい ) 文 献 1:( 株 )ボゾリサーチセンター, イヌ 硬 組 織 ( 上 腕 骨 脊 椎 鼻 腔 )の 標 本 作 製 における 脱 灰 液 の 検 討, 実 験 病 理 組 織 技 術 研 究 会 第 9 回 総 会 学 術 集 会,2002 参 考 資 料 1:( 株 )ボゾリサーチセンター, 脱 灰 による 骨 組 織 の 染 色 性 に 及 ぼす 影 響 ギ 酸 ホルマリン 液 ギ 酸 クエン 酸 液 及 びK-CX 液 の 比 較, 実 験 病 理 組 織 技 術 研 究 会 第 11 回 総 会 学 術 集 会,2003 参 考 資 料 2:( 株 )ボゾリサーチセンター, ラットの 骨 組 織 を 用 いた K-CX 脱 灰 液 の 至 適 脱 灰 条 件 と 組 織 染 色 性 に 関 する 検 討, 実 験 病 理 組 織 技 術 研 究 会 第 16 回 総 会 学 術 集 会,2009 12
お 気 軽 にお 問 い 合 わせ 下 さい 2012 年 9 月 第 3 版 発 行