骨補填材としての焼成温度の違いによる 炭酸含有アパタイトの臨床的有用性の検討 もんなかたかよし 門中 貴義
本論文の要旨は, 第 148 回朝日大学歯学研究発表会 ( 平 成 25 年 10 月 25 日, 岐阜 ) において発表した. 本論文 の一部は, 第 43 回日本口腔インプラント学会総会 ( 平 成 25 年 9 月 15 日, 博多 ) において発表した.
緒言 歯科インプラント治療はオッセオインテグレーションタイプのインプラントシステムの確立によって, 咬合回復を目的とする治療効果の予知性が高まり, 盛んに臨床応用が行われている. 一方で高齢社会を迎えた日本では, 歯科インプラント治療対象患者の高齢化も進み, 加齢や歯周病による骨吸収や外傷による骨欠損を伴った症例に遭遇することも少なくない. このような骨吸収や骨欠損に対し, 骨再生療法には自家骨を用 いた処置が最も有用であるとされてきたが 1, 2 ) 自家 骨採取のための処置が必要なため, 手術侵襲の増大や, 手術時間の延長など, 様々な問題が残されている. そこで, 自家骨にかわる人工骨補填材料を用いた骨増生処置が臨床応用されている 3 ). 人工骨補填材の骨欠損部への臨床応用にあたり, 材料に具備される条件には, 生体親和性と材料吸収性が ある 4 ). これまで臨床では, ハイドロキシアパタイト ( HA) や - T r i c a l c i u m P h o s p h a t e ( - TCP) 等のリン酸 カルシウム系材料が応用されてきた 5 ). しかし, HA は 生体親和性に優れるが材料吸収性ではないため, 生体内に残存する 6 ). - TCP は生体内で吸収され, 骨と置換する材料であるが 7 ~ 9 ), 含有されている成分の中には生体には存在しない物質が含まれているため, 異 1
物反応を示したという報告もあり 10), 生体親和性にお いて問題がある. さらに - TCP は, 最終的に骨に置換するとされているが, 生体へ填入された後, 6 ~ 9 か月で 27~ 39% が残留するという報告もあり 11), 完全に吸収されるまでには長期間を要することから, インプラント体を埋入して正常なオッセオインテグレーションを得るには早期の骨への置換が求められる. このような問題点を改善すべく, Doi らと Ellies は 生体親和性に優れ, 吸収性材料である炭酸含有アパタイト ( C a r b o n a t e d A p a t i t e, CA) を開発した 12~ 13). そして, その優れた特性を活かした生体応用研究がこれまでに報告されてきた 14). 本研究では, CA の臨床応用の可能性と, その人工骨補填材としての有用性を検討する目的にラット大腿骨を用いた動物実験モデルにおいて焼成温度の異なる ( 700 / 5 0 0 ) CA 顆粒を人工骨補填材料として填入し, 組織学的に評価し, さらに, 吸着徐放性の検討も 併せて行った. 使用した CA は渡辺らの報告をもとに 5 0 0 および 7 0 0 の温度で焼成した 5 ). 2
材料および方法 1. 実験動物 実験動物は 8 週齢近交系 W i s t a r /Slc 雄性ラット ( 平 均体重 190.0± 2 0. 0 g 中部科学資材, 名古屋 )6 4 匹を室温 22± 2, 湿度 55± 5 %, 12 時間の照明サイクルで, 各ケージは自由運動可能な環境とし, 固形飼料 ( MF, オリエンタル酵母工業, 日本 ) や飲用水を自由摂取できる飼育環境とした. なお, 動物実験は, 朝日大学歯学 部動物実験倫理委員会 ( 承認番号 12-0 0 4 ) の指針に 基づいて行い, 実験操作に用いる器具は高圧蒸気滅菌 処理後に使用した. 2. CA( C a r b o n a t e A p a t i t e ) 顆粒の作製 実験に際し, CA 顆粒は土井らの方法に準じて 13), 6 M の炭酸二ナトリウムを含む 1.2M のリン酸二ナトリ ウム水溶液 4 l 中に 2 M の硝酸カルシウム水溶液 1 l を 2 時間にわたり滴下し, PH 9. 0 ± 0. 1 を 1 0 0 ( 沸騰状態 ) で 3 日間維持しながら合成した. 合成後の試料は沈殿, 水洗を 10 回以上繰り返し, 一昼夜乾燥させた. その後, 炭酸ガス量を熱重量測定 ( TG)( T h e r m o p l u s, T M A - 8 1 2 0, R i g a k u ) で, 炭酸イオン含有率が約 1 2. 5 w t % の試料を予備加熱した後,500 と 700 で 1 時間焼成処理した. 焼成後, 各試料を乳棒と乳鉢で粉 3
砕し, メッシュサイズ 300~ 500 μmの篩にかけ, 500 焼成 CA( CA500) あるいは 7 0 0 焼成 CA( C A 7 0 0 ) の CA 顆粒標品とした ( 図 1 ). a b 図 1 a : 焼成後の精製 CA 実験材料 b : 粉砕後, 3 0 0 ~ 500 μm された CA 顆粒に整粒された CA 3. F i b r o b l a s t G r o w t h F a c t o r 2 ( FGF2 ) の添加 F G F 2 を CA500 と CA700 にそれぞれ含有させた CA 顆粒を作製した.H u m a n F G F - b a s i c( P e p r o T e c h, R o c k y H i l l, N J, US) 50 μg粉末を滅菌生理食塩水 1 mlに溶解し, 濃度 50 μg / mlの F G F 2 溶液 10 μlを CA20 mgに滴下し, 氷上 で 1 時間浸漬させてそれぞれ C A 5 0 0 F G F, C A 7 0 0 F G F とし た ( 図 2 ). 図 2 CA 顆粒への FGF2 の吸着操作 4
4. CA 顆粒の填入処置ペントバルビタール ( ソムノペンチル, 共立製薬, 東京 ) を腹腔内 ( 1 ml /kg) へ投与し, 全身麻酔下で, 両側大腿部を除毛後, クロルヘキシジンで消毒し, 大腿部皮膚に切開を加え, 筋組織を避けながら大腿骨を露出させた. 骨膜を剝離した後, 大腿骨近位骨幹部で 直径 2.4 mmの歯科インプラント用トレフィンバー ( デンテック, 東京 ) で熱を加えないよう注水下で骨髄 腔に達する骨欠損を形成した ( 図 3 - A ). 鋭匙鉗子で 骨髄を掻爬し, 止血確認後, アマルガム充填器を用い て各種実験材料を, それぞれ, CA 群ならびに FGF 群の 各個体に加圧填入した ( 図 3 - B ). CA 顆粒填入後, 速やかに筋組織および皮膚を 4-0 ナイロン糸で縫合し, 表面をヨードで消毒した後, デ ンタルエックス線写真で CA 顆粒の填入を確認後, 抗菌 薬 ( セファゾリン注 与を 3 日間行った. a 明治製薬, 5 μg / ml ) の筋注投 b 図 3 ラット大腿骨 CA 顆粒填入処置 a : トレフィンバーにて b : CA 顆粒填入後の状態 形成した骨欠損 5
5. 標本採取 填入処置後 1, 2 ならびに 4 週経過までを実験期間 として, それぞれの実験期間後のラットを全身麻酔下 で 10% ホルマリンによる灌流固定を行い, 大腿骨を摘 出し, 同固定液に 4 で 1 晩浸漬して採取試料とした. 6. 観察方法 1 ) マイクロ CT( µct) による材料吸収性 骨欠損部に填入した CA 顆粒の経時的材料吸収性を 評価するため, C A 5 0 0 群と C A 7 0 0 群の填入処置直後を 含めた各実験期間経過後の摘出した大腿骨をパラフィルム ( 富士理科工業, 大阪 ) で覆い, 乾燥を防止しながら, 管電圧 9 0. 5 kv, 管電流 8 7. 5 μa, 幾何学的拡大率 9.00 倍, 解像度 1 1. 1 μm / pixel で µ CT ( S c a n m a t e - R B 0 9 0 S S 150, コムスキャンテクノ, 横浜 ) 断層撮影を行った. なお, 骨塩量計測ファントムも同一条件のもと撮影を行った. 骨欠損部の CA 体積は三次元画像解析ソフトウェア ( T R I / 3 D - BONE R A T O C S y s t e m E n g i n e e r i n g, 東京 ) を 使用し, 骨塩量計測ファントムと大腿骨試料の CT 値か ら大腿骨試料の骨密度 ( B M D 値 ) を算出し, BMD 画像を 作成した. なお, 骨塩量計測ファントムは合成アパタ イト / 合成樹脂の複合物 : 2 0 0 ~ 800 mg H A / cm3, アルミ 箔 : 2437 mg H A / cm3, ヒトエナメル質 : 3 1 0 0 mg HA/ cm3を 6
標準物質とした. 画像解析は BMD 画像上における骨欠 損部の CA, 新生骨を含む領域を計測領域とし, 計測領 域のマニュアルトレースを行い, CA, 新生骨を含む全 組織量 ( 計測組織量, TV) を抽出した. TV の中で BMD 値が 445 以上 9 4 3 mg / cm3未満の部位を新生骨とみなし, TV から新生骨を差し引いた B M D 値 943 mg / cm3以上のものを CA とみなし, CA 群の填入処置直後から各実験期間経過時点までの残存 CA の体積を算出した. なお, C A 5 0 0 群と C A 7 0 0 群における経時的減少率の有意差は S t u d e n t t t e s t ( P < 0. 0 5 ) で評価した. 2 ) 組織標本の作製と観察固定後の大腿骨試料は 1 0 % E D T A で 4 週間中性脱灰し, 通法に従い, アルコール上昇系列にて脱水後, キシレンで置換, パラフィン包埋後, 4 μmの連続切片を作製した. 3 ) HE 染色による観察 CA 填入後の骨欠損部の修復過程を経時的に観察す るため, 各実験群の実験期間のパラフィン切片を通法 に従って HE 染色後, 光学顕微鏡で観察した. 7
4 ) TRAP 染色による観察 脱パラフィンした薄切切片を, 下降アルコールで水 和し, 1 0 m M P B S で 1 時間洗浄した. 続いて 0. 1 M 酢酸 緩衝液PH 5.0 に浸漬した後, T a r t r a t e - R e s i s t a n t A c i d P h o s p h a t a s e,( T R A P ) 溶液を滴下して常温 1 ~ 2 時間 の発色反応後, 0. 0 1 N 水酸化ナトリウム水溶液で反応 を停止させ, 水洗後, ヘマトキシリンによる対比染色 を行った. 5 ) 免疫組織学的検索 脱パラフィン後に下降アルコールで水和し, PBS で 洗浄した切片を,0.3% 過酸化水素水にて組織中の内因 性ペルオキシダーゼ活性を除去した. 次に 1 % ウシア ルブミン血清で 30 分間のブロッキング後に, 骨芽細胞 分化マーカーとする O s t e r i x 抗体 ( 以下 OSX 抗体, r a b b i t p o l y c l o n a l, 抗体濃度 1.8 μg / ml, Abcam I n c. C a m b r i d g e, U K ) ならびに形成された骨細胞と骨小腔に存在するタンパクを骨成熟マーカーとして D e n t i n M a t r i x P r o t e i n - 1 ( 以下 DMP-1 抗体, r a b b i t p o l y c l o n a l, 抗体濃度 2.0 μg / ml, TAKARA, O t s u ) をそれぞれ室温で 2 時間反応させた. なお, D M P - 1 抗体反応前に, 0.1% t r y p s i n 処理 ( 37, 15 分 ) による抗原賦活化を行った. 1 次抗体反応後, PBS 洗浄を行い, ヒ ストファインシンプルステイン MAX- PO ( ニチレイバ 8
イオサイエンス, 東京 ) を H R P 標識 2 次抗体として常 温で 30 分間反応させた. P B S 洗浄後, 0. 0 3 % 過酸化水素水を活性化剤として含ませた濃度 0. 0 5 % の 3, 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o c h l o r i d e ( D a k o, 東京 ) を発色基質として 5 分間基質発色させ, ヘマトキシリンによる対比染色を行い, 光学顕微鏡で組織を観察した. さらに, OSX については OSX 抗体陽性細胞数を高倍率 3 視野で計測し, CA500 群と C A 7 0 0 群, C A 5 0 0 F G F 群と C A 7 0 0 F G F 群における OSX 抗体陽性細胞の有意差を S t u d e n t t t e s t ( P < 0. 0 5 ) で評価した. 9
結果 1. µ CT による CA 顆粒の経時的材料吸収性 CA5 0 0 と CA700 を填入直後から 4 週までの各実験期 間における骨欠損部の一定範囲単位面積当たりの CA 量を填入直後の CA 体積量を 100% として算出し, その 経時的減少率を求めた ( 図 4 ). C A 5 0 0 群では填入直後から 4 週までほぼ一定の割合 で CA 顆粒が吸収され, 4 週では 60% の吸収 ( 残存 CA 体積 40% ) を示した. 一方, C A 7 0 0 群では CA500 群よ りも緩徐な CA 顆粒吸収を示し, 2 週以降, わずかに吸 収量増加を認めたが, 4 週では 28% の吸収 ( 残存 CA 体積 72% ) であった. CA 残存体積 実験週齢 図 4 CA の経時的吸収率 ( P < 0. 0 5 s t u d e n t t t e s t ) 棒線は値の偏差を示す 10
2.HE 染色の組織像 1 ) CA 群 填入処置後 1 週では, CA500 群, CA700 群の両群で CA 顆粒が線維芽細胞を主とする肉芽組織によって被 包されており, この CA 顆粒周囲の肉芽組織と CA 顆粒 との間隙に紡錘形, 多角形あるいは多核を示す巨細胞 の集族を認めた ( 図 a 5 c, d). b c d 図 5 填入処置後 1 週の組織像 黒矢印 : 肉芽組織 a : C A 5 0 0 の弱拡大 c : C A 5 0 0 の強拡大 b : C A 7 0 0 の弱拡大 d : C A 7 0 0 の強拡大 11
填入処置後, 2 週では, CA 顆粒の吸収に伴い, CA 顆粒周囲ならびに間隙に増生し始めた肉芽組織に接す る CA 表面に未熟な新生骨の形成を認めた ( 図 6 c, d ). CA 顆粒の吸収は CA500 群で大きく, 一方, 新生骨の骨 梁は CA700 群で太く,C A 表面における骨芽細胞の分化 も旺盛であった ( 図 6 d ). a b c d NB NB 図 6 填入処置後 2 週の組織像 NB: 新生骨 a : C A 5 0 0 の弱拡大 c : C A 5 0 0 の強拡大 b : CA700 の弱拡大 d : CA700 の強拡大 12
填入処置後 4 週を経過すると, CA 顆粒は填入処置時 と比べ, 明らかな CA 顆粒の吸収を認め, その傾向は C A 5 0 0 群で顕著であった,( 図 7 a, b). 一方, CA500 群, C A 7 0 0 群の両群で, 成熟骨の特徴 である骨層板や骨細胞を容れた骨小腔を認めた. a b c d 図 7 填入処置後 4 週の組織像 黒矢印 : 骨小腔 a : C A 5 0 0 の弱拡大 c : C A 5 0 0 の強拡大 b : C A 7 0 0 の弱拡大 d : C A 7 0 0 の強拡大 13
2 ) FGF 群填入処置後 1 週における FGF 群では CA 群と同様に CA 顆粒の肉芽組織のよる被包や紡錘形, 多角形あるい は多核を示す巨細胞の集族を認めたが, 1 週における CA 群と FGF 群間にその細胞数や形態に特異な差は みられなかった ( 図 8 c, d). a b c d 図 8 FGF 群填入処置後 1 週の組織像 黒矢印 : 多核巨細胞 a : C A 5 0 0 F G F の弱拡大 b : C A 7 0 0 FGF の弱拡大 c : C A 5 0 0 F G F の強拡大 d : C A 7 0 0 FGF の強拡大 14
填入処置後 2 週では CA 群と同様に CA 顆粒周囲およびその間隙に未熟な骨形成がみられたが, その骨梁は CA 群に比較して太く, 骨小腔も多い傾向を示した. しかし, C A 5 0 0 F G F と C A 7 0 0 F G F 間にはその差は認めなかった ( 図 9 c, d ). a b c d NB NB 図 9 FGF 群填入処置後 2 週の組織像 NB: 新生骨 a : C A 5 0 0 F G F の弱拡大 b : C A 7 0 0 FGF の弱拡大 c : C A 5 0 0 F G F の強拡大 d : C A 7 0 0 FGF の強拡大 15
填入処置後 4 週を経過すると, 明らかな骨層板や多 数の骨小腔が観察され, それらは CA 群よりも多くみら れた ( 図 10 b, d ). さらに, CA7 0 0 F G F では骨のリモデリングにおける改 造線もみられた ( 図 10d ). a b c d 図 10 FGF 群填入処置後 4 週の組織像 黒矢印 : 改造線 a : C A 5 0 0 F G F の弱拡大 b : C A 7 0 0 FGF の弱拡大 c : C A 5 0 0 F G F の強拡大 d : C A 7 0 0 FGF の強拡大 16
3. T R A P 染色の組織像 µ CT 解析結果から CA500 で吸収傾向が強く, さらに, 填入処置後 1 週の HE 染色所見において CA 顆粒と肉芽組織との境界部に多核を示す破骨細胞様細胞の集族を認めたため, これを TRAP 染色で確認した結果 ( 図 11), 多核の細胞は T R A P 陽性を示し, CA500 群ならびに C A 5 0 0 FGF( 図 1 1 a, c でその数は多く, C A 5 0 0 F G F 群 ( 図 1 1 a ) でその傾向は顕著であった. a b c d 図 11 填入処置後 1 週の T R A P 染色組織像 a : C A 5 0 0 の強拡大 b : C A 7 0 0 の強拡大 c : C A 5 0 0 F G F の強拡大 d : C A 7 0 0 FGF の強拡大 17
4. 免疫染色の病理組織像 1 ) OSX の発現と解析 填入処置後 2 週の CA 表面における肉芽組織からの 骨芽細胞への分化を OSX 抗体免疫染色で検索した. CA 群, FGF 群ともに焼成温度 5 00 よりも 7 00 で CA 顆 粒周囲の細胞核に陽性を示し, FGF 群で多くの陽性細 胞を認めた ( 図 12). a b c C A 5 00 d C A 5 0 0 F G F 図 12 填入処置後 2 週の OSX 免疫染色組織像 a : C A 5 0 0 の強拡大 b : C A 7 0 0 の強拡大 c : C A 5 0 0 F G F の強拡大 d : C A 7 0 0 FGF の強拡大 18
O S X 抗体陽性細胞数を高倍率 3 視野で計測したとこ ろ, CA7 00 群が CA5 00 群よりも, また, F G F 2 群が CA 群よりも有意にその発現を認めた. しかし, FGF2 群で は C A 5 0 0 と C A 7 0 0 間に有意な差は認めなかった ( 図 13). 陽性細胞数 図 13 各種材料の OSX 陽性細胞数 ( t h r e e h i g h p o w e r f i e l d s ) ( P < 0. 0 5 s t u d e n t t test) 棒線は値の偏差を示す 19
2 ) DMP- 1 の発現 成熟した骨細胞, 骨小腔や骨基質に発現を示す D M P - 1 は CA500 群よりも C A 7 0 0 群で免疫染色によるタ ンパクの高発現を認めた. また, F G F 群においても 7 0 0 で陽性発現が多く, C A 7 0 0 F G F 群で最も多い陽性 細胞を認めた ( 図 14). a b c d 図 14 填入処置後 4 週の D M P - 1 免疫染色組織像 a : C A 5 0 0 の強拡大 b : C A 7 0 0 の強拡大 c : C A 5 0 0 F G F の強拡大 d : C A 7 0 0 FGF の強拡大 20
考察 骨再生による骨欠損部の創傷治癒には, 一般的な組織の再生要素と同様, スキャフォールド, 成長因子ならびに幹細胞という 3 要素が必要とされている 15,16). この場合のスキャフォールドとなる人工骨補填材には良好な骨伝導能とともに生体親和性, さらには臨床的操作性と材料吸収性を有していることが求められる 9 ). 現在, 臨床においては HA や - T C P 等のリン酸カルシウ ム系材料が応用されているが 5 ), 上記のような人工骨 補填材料に求められるすべての要件を具備しているものは少ない. 土井らは, これらの要件を可能な限り満たすことを目的に CA を開発してきた 13). CA は, その構成要素に 2 炭酸基 ( CO - 3 ) を含有したリン酸カルシウム結晶であ り, 単純なリン酸カルシウム構造を有する HA よりもそ の構造は生体の骨アパタイトのリン酸カルシウム結晶 に類似している 17). また,H A の作製には大気圧で 1100 ~ 1 2 0 0 の焼成が必要で 1 8, 1 9 ), この条件で焼成された アパタイトは骨アパタイトよりも高結晶となり生体で はほとんど吸収されなくなる. 一方, 炭酸基イオン含 有量約 9 wt% 以上の CA は結晶が極めて微細となるた め従来のアパタイトに比べて 500~ 7 0 0 の温度で焼 成が可能であり 19), また, 焼成処理温度により炭酸含 21
有量が変化することも分かっている. 今回使用した焼成温度 500 と 700 の CA では約 6 wt% で 19), 生体の骨アパタイトと近似し, 生体親和性と材料吸収性を兼ね備えるといえる. また CA に関する研究報告により, これらの条件を具備するだけでなく, 骨伝導能も有する CA の人工骨補填材としての臨床的有用性を, 材料の焼成温度の違いによる材料吸収性, ならびに骨形成能で比較し, 臨床応用への可能性を探った. さらに, CA はタンパク吸着性にも優れることから, 成長因子の徐放性基材としての有用性も検討した. 本研究では血管新生や創傷治癒などに関与し, 骨芽細胞に対して増殖と分化を制御することが示されている 20) F G F 2 を成長因子とし, 骨形成促進を目的に CA との併用を試みた. 最近の研究ではコラーゲンを基材として局所投与した F G F 2 がウサギの骨折治癒を促進したと報告され 21),FGF2 は骨再生を促進させる可能性が示唆されてい る 2 1 ). 填入処置後の材料吸収性については 4 週までの実験期間で CA500 と CA700 の材料填入部における経時的材料吸収性を填入直後を 100% として追跡したところ, C A 7 0 0 では 2 週以降でやや材料吸収が増加したものの, 全体では比較的緩やかな材料吸収を示したのに対し,4 週経過時の C A 5 0 0 では填入直後から CA700 を上回る材 料吸収性を示し, 吸収率では 4 週でそれぞれ 60% と 22
28% で, 逆に CA 残存率はそれぞれ CA500 で 40%,C A 7 0 0 で 72% となった. 生体内でのリン酸カルシウム系基材 の吸収は, 2 つの異なる機序が考えられており, 組織 液による溶解や崩壊と細胞によるものである. 今回使用した CA500 と CA700 の生体内での吸収動態の違いは上記の材料吸収性の違いが反映しているものと思われる. すなわち C A 5 0 0 は CA700 よりも物理的に非常に脆く, 僅かな外力が加わることで崩れてしまう. また, 焼成温度が C A 7 0 0 よりも低く, 結晶度も低いために C A 5 0 0 は生体内で崩壊性を示し, その結晶性もまた破 骨細胞による吸収を受けやすいため, 材料の吸収性が進んだと考えられる. さらに, 1 週において材料の吸収に関する検索で T R A P 染色を行ったが, C A 5 0 0 群で C A 7 0 0 群よりも多く, CA 周囲の多核の巨細胞に陽性を示した. これは溶解による材料吸収に加え, 細かく崩壊した材料が細胞により吸収されることを裏付けており, その性質が焼成温度条件により最終的な材料吸収状態を示した本研究結果を反映するものであった 22,23). 骨補填材としての骨形成を目的とする骨伝導能について, 一般的な骨形成の概念を基に考察を加えた. 一般に骨の形成は間葉系幹細胞から前駆細胞, 前骨芽細胞, 骨芽細胞へと分化した後, 最終的に骨細胞へと変 化すると考えられている 2 4, 2 5 ). 間葉系幹細胞から骨芽 23
細胞への分化過程は, BMP シグナルや Wnt シグナルが 重要な役割を果たしており, これまでに B M P によって 発現誘導が認められる転写因子としての遺伝子には R u n x 2, OSX が報告されている 26,27). Runx2 は骨芽細胞 分化に必須の転写因子であるが, 骨芽細胞分化の初期 では促進的に, 一方で後期には抑制的に作用すると報 告されている 28,29). OSX は N a k a s h i m a らによって同定 された Zinc- f i n g e r タンパクファミリーに属する転写 因子であり 30), 骨芽細胞分化の比較的初期に発現し, R u n x 2 と同様に骨形成に必須の転写因子であると考え られているが, O S X ノックアウトマウスで, 頭蓋骨形 成予定部位と長管骨の一次石灰化軟骨周囲の間葉系細胞に, Runx2 遺伝子の発現を認め, 一方, R u n x 2 ノックアウトマウスでは OSX の発現が認めなかったことから, O S X は R u n x 2 の下流で発現することが示されている. 本研究では, 2 週における骨形成状態および骨芽細胞 への分化の評価を行うため, O S X の免疫染色を行った ところ, 新生骨と材料周囲との境界部でみられた OSX 陽性細胞は, CA 群では CA5 00 群よりも C A 7 0 0 群で有意にその発現を認めた. 今回用いた人工骨補填材周囲での骨形成では材料がスキャフォールドとしての役割を果たし, 細胞が定着 し, 分化, 増殖する必要がある. CA500 が生体内で崩壊することで細胞の定着が は顆粒の結晶 C A 7 0 0 と比較 24
して悪いことから, 細胞の分化, 増殖も遅れると考え れば, OSX 陽性細胞は少なく, 逆に, CA700 では安定し た場としての材料環境のため, OSX 陽性細胞が数多く 観察されたと考えられた. 本研究における形成された骨の成熟については, その指標に骨細胞や骨小腔内内面, あるいは骨基質に沈着する DMP- 1 に着目した. 歯の象牙質や骨の非コラー ゲン性タンパクである DMP- 1 は, George らによってラ ット象牙質から分離されたリンタンパクで, その後, 骨基質にも存在することが知られている 31). また, 分 化した骨細胞でも産生され, 骨基質に沈着することからカルシウムイオン結合を介して骨の石灰化に関与する 32~ 34). HE 染色による観察では, 処置後 4 週を経過すると, すべての群で新生骨部に骨成熟の指標となるハバース管や, 骨層板が認められた. そこで, 4 週の 標本で DMP- 1 による免疫染色を観察した結果, 材料周 囲の新生骨部で発現を認めたが, その数は CA500 群よ りも CA700 群で多かった. この結果は OSX の各群発現状況と近似しており, 骨芽細胞分化が早期に起これば骨細胞への分化も速やかとなり, 骨成熟も進んだと考えられた. さらに本研究では CA が人工骨補填材として優れた成長因子のスキャフォールドでもあることを検討した. CA はタンパク吸着性が良いと報告されていることか 25
ら FGF2 に浸漬した CA を用いて, 填入部における骨再生の動態を CA 群と同様に比較検討したところ, 塡入 1 週後の TRAP 染色では, CA 群と同様, CA5 0 0 F G F 群が C A 7 0 0 F G F 群よりも陽性細胞を数多く認めた.F GF2 の添加の有無による TRAP 陽性細胞数の差は C A 5 0 0 群と C A 7 0 0 群間でみられなかったため, FGF2 は破骨細胞活性には影響を及ぼさないことが考えられた. 一方, 塡入後 2 週における O S X 陽性細胞数と 4 週における D M P - 1 陽性細胞数を CA 群と FGF 群で比較したとこ ろ, C A 5 0 0 群よりも CA7 00 群で陽性発現を数多く認めた が, CA5 0 0 F G F 群と C A 7 0 0 F G F 群の間には有意な差を認 めなかった. これは CA の焼成温度条件の影響を受ける よりも, FGF2 との併用が骨形成ならびに骨成熟に促進 的に働いていることが示唆された. 26
結論 5 0 0 焼成と 7 0 0 焼成の CA の臨床応用を考慮すると, 500 では生体における材料吸収性が良い反面, 骨形成開始や骨成熟に至る期間や CA 顆粒の臨床的操作性においては 7 0 0 の方が良好であった. 以上の結果から臨床応用には 700 焼成の CA 顆粒に, 骨吸収や骨欠損部に対する人工骨補填材料としての期待ができる. また, CA 顆粒と F G F 2 の併用は今後, 至適濃度等の検討が必要ではあるが, 骨形成や骨成熟を促進させることが示されたことから, 同様に他の成長因子の併用による有用性も期待される. 27
引用文献 1 ) 篠原正徳, 白砂兼光編. 口腔外科学. 第 3 版. 東京 : 医歯薬出版 ; 2 0 1 1 : 552-563. 2 ) 山下善弘, 山本哲彰, 山内健介. 下顎辺縁切除後, インプラントによる咬合再建のために腸骨海綿骨移植とチタンメッシュトレーにより骨造成を行った 1 例. 顎顔面インプラント誌. 2010; 9 : 55-58. 3 ) 真鍋真人. 歯槽骨造成法の現在と未来. 昭歯誌. 2 0 0 7 ; 27: 2 9 7-3 0 3. 4 ) H e n c h L L. B i o c e r a m i c s f r o m c o n c e p t t o c l i n i c. J. Am. C e r a m. Soc. 1 9 9 1 ; 74: 1 4 8 7-1 5 1 0. 5 ) O z a w a M, T a n a k a K, M o r i k a w a S, C h a z o n o M a n d F u j i k i K. C l i n i c a l s t u d y o f t h e p u r e β - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e - r e p o r t s o f 1 6 7 c a s e s. J E a s t J p n O r t h o p T r a u m a t a l. 2 0 0 0 ; 2 : 4 0 9-413. 6 ) K w o n g C H, B u r n s W B a n d C h e u n g H S. S o l u b i l i z a t i o n o f h y d r o x y a p a t i t i c c r y s t a l s b y m u r i n e b o n e c e l l s, m a c r o p h a g e s a n d f i b r o b l a s t s. B i o m a t e r i a l s. 1 9 8 9 ; 1 0 : 5 7 9-5 8 4. 7 ) L e G e r o s R Z. P r o p e t i e s o f o s t e o c o n d u c t i v e b i o m a t e r i a l s : c a l c i u m p h o s p h a t e s. C l i n O r t h o p R e l a t R e s. 2 0 0 2 ; 3 9 5 : 8 1-9 8. 8 ) S t a v r o p o u l o s A, W i n d i s c h P, S z e n d r ӧ i - k i s s D, 28
P e t e r R, G e r a I a n d S c u l e a n A. C l i n i c a l a n d h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n o f g r a n u l a r b e t a - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e f o r t h e t r e a t m e n t o f h u m a n I n t r a b o n y p e r i o d o n t a l d e f e c t s : A r e p o r t o n f i v e c a s e s. J P e r i o d o n t o l. 2 0 1 0 ; 8 1 : 3 2 5-3 3 4. 9 ) 渡邉岳, 坂野美栄, 永山元彦, 堀田正人, 竹内宏. リン酸カルシム基材によって形成された伝導性骨の改造現象とそのリン酸カルシウム基材の吸収. 岐歯学歯. 2 0 1 0 ; 3 7 : 2 0-32. 10) N a g a y a m a M, T a k e u c h i H a n d D o i Y. C o m p a r i s o n o f c a r b o n a t e a p a t i t e a n d β - t r i c a l c i u m p h o s o h a t e ( R e s o r b a b l e c a l c i u m p h o s p h a t e s ) i m p l a n t e d s u b c u t a n e o u s l y i n t o t h e b a c k o f r ats. D e n t M a t e r J. 2 0 0 6 ; 2 5 : 2 1 9-2 2 5. 11) S i m u n e k A, K o p e c k a D, S o m a n a t h a n R V, P i l a t h a d k a S a n d B r a z d a T. D e p r o t e i n i z e d b o v i n e b o n e v e r s u s b e t a - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e i n i n s i n u s a u g m e n t a t i o n s u r g e r y : a c o m p a r a t i v e h i s t o l o g i c a n d h i s t o m o r p h o m e t r i c s t u d y. I n t J O r a l M a x i l l o f a c I m p l a n t s. 2 0 0 8 ; 3 5 : 9 3 5-942. 12) E l l i e s L G, N e l s o n D G A a n d F e a t h e r s o n e J D B. C r y s t a l l o g r a p h i c s t r u c t u r e a n d s u r f a c e m o r p h o l o g y o f s i n t e r e d c a r b o m a t e a p a t i t e s. J B i o m e d M a t e r R e s. 1 9 8 8 ; 2 2 : 5 4 1-553. 29
1 3 ) D o i Y, K o d a T, W a k a m a t s u N, G o t o T, K a m e m i z u H, M o r i w a k i Y, A d a c h i M a n d S u w a Y. I n f l u e n c e o f c a r b o n a t e o n s i n t e r i n g o f a p a t i t e s. J D e n t R e s. 1 9 9 3 ; 7 2 : 1 2 7 9-1 2 8 4. 1 4 ) D o i Y, S h i b u t a n i T, M o r i w a k i Y, K a j i m o t o T and I w a y a m a Y. S h i n t e r e d c a r b o n a t e a p a t i t e s a s b i o r e s o r b a b l e b o n e s u b s t i t u t e. J B i o m e d M a t e r R e s. 1 9 9 8 ; 3 9 : 1 3 9-1 4 3. 15) 鈴江懐, 小林忠義編. 病理学総論. 第 2 版. 東京. 医学書院 ; 1 9 7 5 : 4 2 6-4 3 8. 16) 中村敏一編. 再生医学から再生医療へ, 幹細胞システムの解明と臨床応用への可能性へ迫る. 1 版, 東京. 羊土社 ; 2 0 0 0 :21-45. 17) A o k i H. S c i e n c e o f m e d i c a l a p p l i c a t i o n s o f h y d r o x y a p a t i t e T a k a y a m a P r e s s S y s t e m c e n t e r C o., I n c., 1 9 9 1 : 99-106. 18) 土井豊, 森脇豊. ハイドロキシアパタイト. 歯科ジャーナル. 1 9 9 2 ; 3 6 : 355-370. 19) 土井豊, 幸田起英, 足立正徳. 炭酸含有アパタイトの焼成. 歯材器. 1995; 14: 313-3 2 0. 20) G o s p o d a r o w i c z D. L o c a l i z a t i o n o f a f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r a n d i t s e f f e c t a l o n e a n d w i t h h y d r o c o r t i s o n e o n 3 T 3 c e l l g r o w t h. N a t u r e. 1 9 7 4 ; 2 4 9 : 1 2 3-127. 30
21) I n u i K, M a e d a M, S a n o A, F u j i o k a K, Y u t a n i Y, S a k a w a A, Y a m a n o Y, K a t o Y, K o i k e T. L o c a l a p p l i c a t i o n o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r m i n i p e l l e t i n d u c e t h e h e a l i n g o f s e g m e n t a l b o n y d e f e c t s i n r a b b i t. C a l i f T i s s u e I n t. 1 9 9 8 ; 6 3 : 4 9 0-4 9 5. 2 2 ) B r i a n K H. B o n e s a n d c a r t i l a g e. i l l u t r a t e d e d i t i o n. A m s t e r d a m : E l s e v i e r A c a d e m i c P r e s s. 2 0 0 5 ; 1 9 7-2 1 3. 2 3 ) 幸田起英, 土井豊, 志水雄一郎, 若松宣一, 足立正徳, 後藤隆康, 亀水秀男, 森脇豊. 炭酸含有アパタイトの焼成 弱酸中での焼成体の溶解挙動 -. 歯材器. 1 9 9 7 ; 1 6 : 1 0 7-1 1 3. 2 4 ) S a k a g u c h i Y, S e k i y a I, Y a g i s h i t a K a n d M u n e t a T. C o m p a r i s o n o f h u m a n s t e m c e l l s d e r i v e d f rom v a r i o u s m e s e n c h y m a l t i s s u e s. A m e r i c a n C o l l a g e o f R h e u m a t o l o g y. 2 0 0 5 ; 5 2 : 2 5 2 1-2 5 2 9. 2 5 ) 山田志津香, 林善彦. 骨芽細胞分化と骨形成に関する転写因子とシグナル伝達機構. 生体医工学. 2 0 0 6 ; 44: 490-4 9 5. 2 6 ) 松本俊夫. 骨 軟骨代謝と注目の骨疾患. 1 版, 東京. 羊土社 ; 2 0 0 2 : 42-47. 2 7 ) 小守壽文, 福本誠二編, 転写因子による骨芽細胞 分化抑制と骨の成熟. Runx2 は骨形成においてオ 31
ールマイティな因子か? 1 版. 東京 : 医歯薬出版 ; 2 0 0 8 : 5 3-56. 2 8 ) L i u W. T o y o s a w a S, F u r u i c h i T, K a n a t a n i N, Y o s h i d a C, L i u Y, H i m e n o M, N a r a i S, Y a m a g u c h i A a n d K o m o r i T. O v e r e x p r e s s i o n o f C b f a 1 i n o s t e o b l a s t s i n h i b i t s o s t e o b l a s t m a t u r a t i o n a n d c a u s e s o s t e o p e n i a w i t h m u l t i p l e f r a c t u r e s. J C e l l B i o l. 2 0 0 1 ; 1 5 5 : 1 5 7-1 6 6. 2 9 ) Y o s h i d a C A, F u r u i c h i T, F u j i t a T, F u k u y a m a R, K a n a t a n i N, K o b a y a s h i S, S a t a k e M, T a k a d a K a n d K o m o r i T. C o r e - b i n d i n g f a c t o r β i n t e r a c t s w i t h R u n x 2 a n d i s r e q u i r e d f o r s k e l e t a l d e v e l o p m e n t. N a t u r e G e n e t. 2 0 0 2 ; 3 2 : 6 3 3-6 3 8. 30) N a k a s h i m a K, Z h o u X, K u n k e l G, Z h a n g Z, D e n g J M, B e h r i n g e r R R a n d C r o m b r u g g h e B. T h e n o v e l z i n c f i n g e r - c o n t a i n i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r o s t e r i x i s r e q u i r e d f o r o s t e o b l a s t s d i f f e r e n t i a t i o n a n d b o n e f o r m a t i o n. C e l l. 2 0 0 2 ; 1 0 8 : 1 7-2 9. 3 1 ) G e o r g e A, S a b s a y B, P h i l i p A L S a n d V e i s A. C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l d e n t i n m a t r i x a c i d i c p h o s p h o p r o t e i n. B i o l C h e m. 1 9 9 3 ; 2 6 8 : 1 2 6 2 4-1 2 6 3 0. 3 2 ) T o y o s a w a S, O y a K, S a t o S a n d I s h i d a K. O s t e o c y t e 32
a n d D M P 1. C l i n c a l C a l c i u m. 2 0 1 2 ; 22: 7 1 3-7 2 0. 3 3 ) T o y o s a w a S, S h i n t a n i S, F u j i w a r a T, O o s h i m a T, S a t o A, I j u h i n N and K o m o r i T. D e n t i n m a t r i x p r o t e i n 1 i s p r e d o m i n a n t l y e x p r e s s e d i n c h i c k e n a n d r a t o s t e o c y t e s b u t n o t i n o s t e o b l a s t s. J B o n e M i n e r R e s. 2 0 0 1 ; 1 6 : 2 0 1 7-2 0 2 6. 3 4 ) N a r a y a n a n K, S r i n i v a s R, R a m a c h a n d r a n A, H a o J, Q u i n n B a n d G e o r g e A. D i f f e r e n t i a t i o n of e m b r y o n i c m e s e n c h y m a l c e l l s t o o d o n t o b l a s t - l i k e c e l l s b y o v e r e x p r e s s i o n o f d e n t i n m a t r i x p r o t e i n 1. P r o c N a t l A c a d S c i U S A. 2001; 9 8 : 4 5 1 6-452 1. 33
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