2 森友忠昭 Fig.1. 脊椎動物の血球組成 : イヌ, ウズラ, コイの血球は, それぞれ赤血球栓球顆粒球単球リンパ球より構成されている Fig.2. ギンブナ幼魚の造血リンパ組織造血幹細胞の存在は,1960 年代に行われた骨髄移植実験により証明されたすなわち, マウスに致死量の放

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あいとたなせ
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1 魚病研究 FishPathology,49(3),00 00, TheJapaneseSocietyofFishPathology 識鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫竺識鴫鴫鴫竺平成 25 年度日本魚病学会研究奨励賞識鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫鴫竺識鴫鴫鴫竺魚類造血機構の解明森友忠昭 * 日本大学生物資源科学部獣医学科比較免疫学研究室要旨哺乳類では, すべての血球は骨髄中の造血幹細胞から造血前駆細胞を経てつくられ, その過程は様々な造血因子などにより複雑に制御されることがわかっている一方, 魚類の主要な造血部位である腎臓中の造血幹 / 前駆細胞やそれらに働く造血因子などの情報は少ない, そこで我々は魚類造血機構の解明を目的として, クローンギンブナを用いた造血細胞の移植実験を行うことで造血幹細胞の存在を調べたり,Sidepopulation 分離法にて魚類造血幹細胞の分離を試みたり, また, 半固形培地を用いた造血細胞の培養などで, これら造血幹 / 前駆細胞の同定やそれに働く造血因子を調べたキーワード : 魚類, 造血幹細胞, 造血前駆細胞, 造血因子はじめに脊椎動物の血球組成は保存されている脊椎動物の血液細胞 ( 血球 ) は, 赤血球栓球顆粒球単球リンパ球から構成され, これら血球の機能形態は脊椎動物間で比較的良く保存されている (Fig.1) しかし, 異なる部分もある例えば, 哺乳類の赤血球や栓球 ( 血小板 ) は無核であるのに対して, それ以外の脊椎動物 ( 鳥類爬虫類両生類魚類 ) の赤血球や栓球は有核であるまた, 哺乳類や鳥類の顆粒球は, 顆粒の染色性から好中球 ( 好異球 ), 好酸球, 好塩基球の 3 種類に分けられるが, 魚類では, 魚種により異なる例えば, コイやフグでは好中球のほか好塩基球様細胞も認められるが, ニジマスアユウナギではほとんど好中球様細胞しか観察されない (SuzukiandIida,1992; 中村菊池,2001) しかし, いずれの種においても初期生体防御に重要な炎症部位に早期に現れ, 貪食殺菌を行う好中球様の細胞は存在する ( 椎橋飯田,2003) また, 哺乳類のリンパ球は T 細胞 B 細胞 NK 細胞等に分けられるが, 魚類でも同様の細胞が存在することが知られている (Nakanishietal.,2011) これらのことは, 脊椎動物において基本的な血球組成は共通であり, さらに, 免疫機構も良く似ていることを意味する * 連絡者 moritomo.tadaaki@nihon-u.ac.jp 神奈川県藤沢市亀井野 1866 日本大学生物資源科学部獣医学科比較免疫学研究室英語タイトル :Studiesoffishhematopoieticsystem 魚類の造血部位なぜ真骨魚類の造血は腎臓おこるのか基本的な血球組成は脊椎動物間で保存されているが, 造血部位は大きく異なる例えば陸生脊椎動物 ( 哺乳類, 鳥類など ) の造血部位は骨髄であるが, 多くの真骨魚類の造血部位は腎臓であるまた, 軟骨魚類であるサメでは生殖腺に付随するエピゴナル器官や食道付近のライディヒ器官などで造血が行われるまた, 半水生のアフリカツメガエル成体では肝臓が造血部位であり (Nogawa-Kosakaetal.,2011), さらに, 哺乳類でも胎生期の一時期に, 肝臓造血がおこるこれらのことは脊椎動物の造血部位として決まった器官は無く, 本来多様であることを意味するこのような観点からすると, 真骨魚類の造血部位が腎臓であってもなんの違和感も無い Fig.2 は, ギンブナ ( 幼魚 ) の組織標本を示すコイ科魚類の腎臓は鰾の形に沿うように, 頭腎と体腎に分かれ, 頭腎中には哺乳類の副腎組織に相当する内分泌組織が, そして, 体腎には尿細管や糸球体などの泌尿器系組織が観察されるが, スタンプ標本を作製してみると, 幼若赤血球や幼若好中球など分化途中の各種幼若血球が多数観察され, 共に造血部位であることがわかる (Fig.3) また, 哺乳類の主要な造血部位である骨髄造血組織は魚類には存在せず, 真骨魚の腎臓は哺乳類の骨髄と相同の器官と考えられる魚類の造血幹細胞の存在証明哺乳類骨髄中には血球の基となる造血幹細胞が存在し, 生涯に亘ってすべての種類の血液を供給し続けるこの

2 2 森友忠昭 Fig.1. 脊椎動物の血球組成 : イヌ, ウズラ, コイの血球は, それぞれ赤血球栓球顆粒球単球リンパ球より構成されている Fig.2. ギンブナ幼魚の造血リンパ組織造血幹細胞の存在は,1960 年代に行われた骨髄移植実験により証明されたすなわち, マウスに致死量の放射線を照射すると骨髄が破壊され, 貧血により死亡するしかし, このマウスに MHC が一致する同系等のマウスより得た, 骨髄細胞を移植すると, 多分化能と長期造血能 ( 自己複製能 ) を持った造血幹細胞が定着し, 造血が再構築されるため, マウスは生き延びることができるこの MHC が一致した個体間の移植実験は, 現在もなお造血幹細胞の存在を証明する唯一の方法とされている哺乳類と同様に魚類造血幹細胞の証明にも,MHC が一致した個体間での移植実験が必要であるそこで我々はクローンギンブナに着目したクローンギンブナは 3 倍体 (3n 150) のメスしか存在せず, 単為生殖で子孫を残すそのため, ある母親から生まれた魚はすべて母親と同じ遺伝形質を持つ日本には多系統のクローンギンブナが存在するが, その中には諏訪湖産クローンギンブナ (S3N 系統 ) のように, 卵を近縁のキンギョ精子で受精させると,4 倍体雑種をつくるものが存在する (Fig. 4) この 4 倍体雑種は 3 組のギンブナ染色体と 1 組のキンギョ染色体を持つため,3 倍体クローンギンブナ ( ドナー ) の細胞を 4 倍体雑種 ( レシピエント ) に移植した場合, 拒絶反応は起こらず生着するさらに, 染色体数

魚類造血機構の解明 3 の違い DNA含量の違いを利用して移植後のドナー細胞を容易に識別し追跡することも可能である Fi g.5 Mor i t omoetal.

フローサイトメトリーにより解析したその結果移植前のレシピエント赤血球はすべて 4倍体であったのに対して 3ヶ月後にはドナー由来の 3倍体赤血球が認められ

8 このように移植を受けた 4 倍体血中には 3倍体由来のすべての種類の血球が 1年以上に亘って観察され移植された腎臓造血細胞中に多

,2006 以上のように哺乳類の骨髄と同様に魚類の腎臓中にも造血幹細胞が存在することが示された魚類造血幹細胞の分離腎臓 SP細胞の分離上記の移植実験により

ギンブナ頭腎または体腎のスタンプ標本緑矢印は赤血球系幼若細胞を青矢印は好中球系幼若細胞を示す MayGr uenwal dgi emsa,bar=10mm

3 魚類造血機構の解明 3 の違い DNA含量の違いを利用して移植後のドナー細胞を容易に識別し追跡することも可能である Fi g.5 Mor i t omoetal.,2004 我々はこのギンブナ移植実験系を用いて魚類造血幹細胞の存在証明を行ったすなわち 3倍体クローンから腎臓造血細胞を分離しこれら細胞を 4倍体雑種に移植した Fi g.6 その後経時的に採血し血球を DNA 結合性の蛍光色素 Pr opi di um i odi de Hoechst 等で染色後フローサイトメトリーにより解析したその結果移植前のレシピエント赤血球はすべて 4倍体であったのに対して 3ヶ月後にはドナー由来の 3倍体赤血球が認められ 12ヶ月後には約半数の血球がドナー由来となった Fi g.7 また同様に白血球も解析したところ 1年以上にわたりドナー由来のすべての白血球が観察された Fi g.8 このように移植を受けた 4 倍体血中には 3倍体由来のすべての種類の血球が 1年以上に亘って観察され移植された腎臓造血細胞中に多分化能と長期造血能をもった造血幹細胞が存在することがわかった Kobay as hietal.,2006 以上のように哺乳類の骨髄と同様に魚類の腎臓中にも造血幹細胞が存在することが示された魚類造血幹細胞の分離腎臓 SP細胞の分離上記の移植実験により我々は真骨魚類の腎臓中に造 Fi g.3. ギンブナ頭腎または体腎のスタンプ標本緑矢印は赤血球系幼若細胞を青矢印は好中球系幼若細胞を示す MayGr uenwal dgi emsa,bar=10mm 血幹細胞が存在することをレトロスペクティブに証明したしかし更に詳しく調べるためには造血幹細胞を分離しプロスペクティブに証明する必要があったそこで Fi g.4. 諏訪湖産クローン S3N による 3倍体クローンと 4倍体雑種の作製 S3Nは単為生殖のみならず両性生殖にても子孫を残すことが可能である S3N系統の卵クローンギンブナは通常の減数分裂の過程を経ないため 3倍体の卵を作るに近縁のキンギョの精子をかけると 4倍体の雑種を生じる一方あらかじめキンギョやドジョウの精子を紫外線照射し DNA を破壊しておくと精子は発生刺激を与えるのみで母親と同じ遺伝形質を持った 3倍体クローンを得ることができる

4 森友忠昭 Fig.5. 3 倍体クローンと 4 倍体雑種を用いた移植実験系 Fig.6.

ステンレスメッシュ上でピンセットを用いてすり潰すことにより, 細胞浮遊液を作製したその後 Percol( 比重 1.

我々は哺乳類造血幹細胞分離法の一つである,side population(sp) 細胞分離法を試みたすなわち, 哺乳類造血幹細胞は

そのため,Hoechst 染色後の骨髄細胞をフローサイトメトリーで調べると, 造血幹細胞は難染性分画すなわち主要な細胞集団から横に突き出た集団

魚類の造血細胞も通常の細胞周期である, G0/G1 集団および S/G2/M 集団の他に, SP 細胞に分けられるこの SP

4 4 森友忠昭 Fig.5. 3 倍体クローンと 4 倍体雑種を用いた移植実験系 Fig.6. 3 倍体クローンと 4 倍体雑種を用いた移植実験系 : 3 倍体クローンより腎臓 ( 頭腎および体腎 ) を取り出し, ステンレスメッシュ上でピンセットを用いてすり潰すことにより, 細胞浮遊液を作製したその後 Percol( 比重 1.075) を用いた, 比重遠心法にて造血細胞分画を得て, これら ~10 7 個を 4 倍体雑種に尾部血管より移植した我々は哺乳類造血幹細胞分離法の一つである,side population(sp) 細胞分離法を試みたすなわち, 哺乳類造血幹細胞は Hoechst33342 などの化学物質を細胞外へ排出する性質 (multidrugresistance) を持っているそのため,Hoechst 染色後の骨髄細胞をフローサイトメトリーで調べると, 造血幹細胞は難染性分画すなわち主要な細胞集団から横に突き出た集団 (sidepopulation) 中に多く含まれるこの SP 細胞を回収することにより, ヒトマウスイヌサルなどの多くの種で造血幹細胞が分離されている Fig.9 は,3 倍体ギンブナの腎臓造血細胞を Hoechst33342 で染色し, フローサイトメトリーで解析した結果を示している哺乳類と同様, 魚類の造血細胞も通常の細胞周期である, G0/G1 集団および S/G2/M 集団の他に, SP 細胞に分けられるこの SP 細胞の割合は平均すると0.33%(n=9) であり, また, その形態は小型のリンパ球様細胞からなっていたこれらの性状は哺乳類の造血幹細胞と類似していた次に, これら 3 倍体から得た SP 細胞を先ほどと同様 4 倍体雑種に移植したところ, 非常に少ない数 (7,000~ 30,000 個 ) でも造血が再構築され,SP 細胞分画中に造血幹細胞が濃縮されていることがわかった (Kobayashi

などに関連する遺伝子が多く含まれていた次に, 公共のデータベースより得たマウスおよびヒト造血幹細胞のマイクロアレイデータを用い, ゼブラフィッシュ, マウスおよびヒトの造血幹細胞において共通の発現増加遺伝子を探索したその結果,3 種で共通の発現増加遺伝子をそれぞれ40 個ほど同定することができた (Fig.

5 魚類造血機構の解明 5 etal.,2007) 上記のように, 魚類においても SP 細胞分離法にて造血幹細胞を分離できることがわかったそこで次に, 遺伝子解析が進んでいるゼブラフィッシュより SP 細胞を分離し, マイクロアレイによる発現解析をおこなったその結果,SP 細胞で発現が増加している遺伝子が1,077 個同定されたこれらには celjunction や intracelular signalingcascade などに関連する遺伝子が多く含まれていた次に, 公共のデータベースより得たマウスおよびヒト造血幹細胞のマイクロアレイデータを用い, ゼブラフィッシュ, マウスおよびヒトの造血幹細胞において共通の発現増加遺伝子を探索したその結果,3 種で共通の発現増加遺伝子をそれぞれ40 個ほど同定することができた (Fig.10) これらには gata2 や egr1,meis1 などの造血幹細胞の増殖維持に関わっているものが含まれていた (Kobayashietal.,2010;Kobayashietal.,2008) このことは, 魚類では腎臓造血と造血部位は異なるものの, 造血幹細胞の維持には, 哺乳類と似た機構が存在するものと考えられた Fig.7. フローサイトメトリーによるレシピエント魚 (4 倍体雑種 ) 赤血球の倍数性解析 :3 倍体魚 (S3N) より得た腎臓造血細胞を 4 倍体雑種に移植後, 経時的に採血し, 赤血球を Propidium Iodide 染色した魚類造血細胞培養法の開発と造血前駆細胞の同定哺乳類では, 造血幹細胞から段階的な造血前駆細胞を経て様々な血球が作られるそして, その過程は様々な Fig.8. フローサイトメトリーによるレシピエント魚 (4 倍体雑種 ) 白血球の倍数性解析 :3 倍体魚 (S3N) より得た腎臓造血細胞を 4 倍体雑種に移植後, 経時的に採血し, 白血球を Hoechst33342 にて染色したまた, 移植 12 ヶ月後には,3 倍体または 4 倍体白血球を分取し, それぞれのト抹標本を作製した N: 好中球,B: 好塩基球,M: 単球,L: リンパ球,T: 栓球 May-GruenwaldGiemsa,Bar=10mm

6 6 森友忠昭 Fig.9. ギンブナ SP 細胞の分離 : ギンブナ造血細胞を Hoechst33342 で染色後, フローサイトメトリーによる解析をおこなったすなわち紫外線レーザーで励起し, 縦軸に nm( 青 ), 横軸に nm( 赤 ) をプロットした二次元展開を行った Fig.10. ゼブラフィッシュ SP 細胞のマイクロアレイ解析 : 公共のデータベースより得たマウスおよびヒト造血幹細胞のマイクロアレイデータを用い, ゼブラフィッシュ, マウスおよびヒトの造血幹細胞において共通の発現増加遺伝子を探索した Fig.11. 哺乳類における赤血球分化とそれらに働く造血因子

7 魚類造血機構の解明 7 Fig.12. 半固形培地を用いたコイ造血細胞の培養コロニー形成法の概要半固形培地を用いたコイ造血細胞の培養 :a) コイエリスロポイエチン存在下で形成されたコロニー b) コロニー細胞の遺伝子発現解析 c) コロニー形成数とエリスロポイエチン濃度の関係 a b c Fig.13. a). b). c).

8 8 森友忠昭造血因子により複雑に制御されていることが知られている例えば, 赤血球分化では造血幹細胞からはじまり, 骨髄系前駆細胞, BFU-E, CFU-E などの前駆細胞を経て分化し, 最終的には脱核と言う, 哺乳類独特のプロセスを経て, 無核の成熟赤血球が作られるその過程には, エリスロポイエチン (EPO) やキットリガンド (KitL,stem celfactor) など多くの造血因子が関わっていることが知られている (Fig.11) 魚類でも近年のゲノム解析により, 哺乳類造血関連遺伝子のホモログが多く見つかり, 基本的な造血機構も哺乳類と似ていると考えられているしかし, 魚類の前駆細胞やそれらに働く造血因子などの情報は少ないそこで我々は半固形培地を用いてコイ腎臓造血細胞を培養し, これにコイの EPO のリコンビナントタンパク質を加え, これら造血因子の効果や造血前駆細胞を調べた (Fig.12) (Katakuraetal.,2014) Fig.13a は, コイ EPO 存在下で形成されたコロニーの形態を示しているほとんどのコロニーは数十個の細胞から構成される小型で凝集性のコロニーであったこれらのコロニー性状を明らかにするため, 各種血球マーカー遺伝子の発現を RT-PCR にて調べたところ, 赤血球系のマーカーである b-globin,epor( エリスロポイエチンレセプター ) および gata1 などを発現していたが, 他の血球マーカー遺伝子の発現は認められなかった (Fig. 13b) また, 異なる濃度の組換えコイ Epo を添加しコイ腎臓造血細胞のコロニーアッセイを行ったところ,Epo 濃度依存的にコロニー数が増加したすなわち, コロニー形成数は 100ng/ml 以上の Epo 存在下において最大値を示し, 個の腎臓造血細胞中 70~130 個程度のコロニーが形成された (Fig.13c) このように,EPO 濃度依存性に赤血球系コロニーが形成され,EPO は魚類においても赤血球造血に関与することが示された以上, 哺乳類の骨髄と同様, 魚類腎臓中には造血前駆細胞が存在することが示された現在, さらに KitL, トロンボポイエチン,CSF-1 などの造血因子のリコンビナントタンパクを作成し, この培養系に添加することでさらなる造血因子や造血前駆細胞の同定に取り組んでいるおわりに脊椎動物の血球組成および機能は良くにており, また, 造血部位は異なるものの血球分化機構も共通点が多いこれらのことは両者の共通祖先ですでに造血機構の基本型が確立されていたことを意味する実際, 上記 SP 細胞の遺伝子解析においても, 哺乳類の造血幹細胞と似た遺伝子発現が認められ, 両者を比較することで脊椎動物の造血幹細胞維持機構の解明に役立つものと考えられる魚類の造血機構を解明することは, 哺乳類を含む脊椎動物の基本的な造血機構の理解につながると考えられる謝本研究を遂行するにあたり, ご助言ご鞭撻を賜りました日本大学獣医学科中西照幸先生および水産総合研究センター増養殖研究所 ( 現水産総合研究センター中央水産研究所 ) 乙竹充先生, 東京大学附属水産実験所 ( 現福井県立大学海洋生物資源学部 ) 末武弘章先生に深く感謝いたしますまた, 魚類造血幹細胞に関する実験を実際に行った, 日本大学大学院博士課程小林功氏 ( 現米国カルフォルニア州立大学研究員 ) および片倉文彦氏 ( 現加国アルバータ大学研究員 ) に深く感謝いたします文 Katakura,F.,B.A.KatzenbackandM.Belosevic(2014): Molecularandfunctionalcharacterizationoferythropoietin ofthegoldfish(carassiusauratusl.). Dev.Comp. Immunol.,45, Kobayashi,I.,T.Moritomo,M.OtotakeandT.Nakanishi (2007):Isolationofsidepopulationcelsfrom ginbuna carp(carassiusauratuslangsdorfi)kidneyhematopoietic tissues. Dev.Comp.Immunol.,31, Kobayashi,I.,H.Ono,T.Moritomo,K.Kano,T.Nakanishiand T.Suda(2010):Comparativegeneexpressionanalysisof zebrafishandmammalsidentifiescommonregulatorsin hematopoieticstem cels. Blood,115,e1 e9. Kobayashi,I.,K.Saito,T.Moritomo,K.Araki,F.Takizawaand T.Nakanishi(2008):Characterizationandlocalizationof sidepopulation(sp)celsinzebrafishkidneyhematopoietictissue. Blood,111, Kobayashi,I.,M.Sekiya,T.Moritomo,M.OtotakeandT. Nakanishi(2006):Demonstrationofhematopoieticstem celsinginbunacarp(carassiusauratuslangsdorfi) kidney. Dev.Comp.Immunol.,30, Moritomo,T.,N.Asakura,M.Sekiya,M.Ototake,Y.Inoueand T.Nakanishi(2004):Celcultureofclonalginbunacruciancarphematopoieticcels:diferentiationofcultured celsintoerythrocytesinvivo. Dev.Comp.Immunol.,28, 中村弘明菊池慎一 (2001): 動物界における免疫系の進化 (11) 魚類の生体防御系. 医学のあゆみ,199, Nakanishi,T.,H.Toda,Y.ShibasakiandT.Somamoto(2011): CytotoxicTcelsinteleostfish. Dev.Comp.Immunol., 35, Nogawa-Kosaka,N.,T.Sugai,K.Nagasawa,Y.Tanizaki,M. Meguro,Y.Aizawa,S.Maekawa,M.Adachi,R.Kuroki andt.kato(2011):identificationoferythroidprogenitors inducedbyerythropoieticactivityinxenopuslaevis. J. Exp.Biol.,214, 椎橋孝飯田貴次 (2003): 顆粒球魚類好中球の活性酸素産生機構を中心として, 魚類免疫系, 渡辺翼編, 恒星社厚生閣, 東京,pp Suzuki,Y.andT.Iida(1992):Fishgranulocytesintheprocess ofinflammation. Ann.Rev.FishDis.,2, 辞献

メディカルスタッフのための白血病診療ハンドブック

メディカルスタッフのための白血病診療ハンドブック Chapter. 1 Chapter 1 末梢血液の中には, 血液細胞である赤血球, 白血球, 血小板が存在し, これらの成熟細胞はあらゆる血液細胞へ分化する能力である多分化能をもつ造血幹細胞から造られる. また, それぞれの血液細胞には寿命があり, 赤血球の寿命は約 120 日, 白血球の中で最も多い好中球の寿命は数日, 血小板の寿命は約 7 日である. このように寿命のある血液細胞が生体の生涯を通して造られ続けられるために,