資料 1 麻疹ウイルスの分類構造複製様式図 1 麻疹ウイルス (measles virus: MV) の学問上分類とウイルス粒子構造分類 : 一本鎖マイナス鎖 RNA ウイルス ( モノネガウイルス目 ) パラミクソウイルス科モービリウイルス属 M N genome RNA L F H P

Size: px

Start display at page:

Download "資料 1 麻疹ウイルスの分類構造複製様式図 1 麻疹ウイルス (measles virus: MV) の学問上分類とウイルス粒子構造分類 : 一本鎖マイナス鎖 RNA ウイルス ( モノネガウイルス目 ) パラミクソウイルス科モービリウイルス属 M N genome RNA L F H P"

よしじろうかみこ
5 years ago
Views:

1 別添資料リスト 1. 麻疹ウイルスの分類構造複製様式 2. PVRL4 の構造と MVH との相互作用 3. イヌ乳ガン細胞株を用いた rmvslamblind の抗腫瘍能評価 4. MV 野外株のカニクイザルに対する病原性試験 5. MVHL(7+) ゲノム cdna 塩基配列 ( 非公開 ) 6. rmvhl(7+) 構築図 7. pmvhl(7+) 構築 primer 配列 ( 非公開 ) 8. 本遺伝子組換え MV 作出用遺伝子カセット構築図 9. rmvslamblind の in vitro 感受性試験 10. 供与核酸の由来および機能 11. pgem5z, pmdb1 プラスミドマップ 12. pmvslamblind 構築図 13. リバースジェネティクス模式図 14. シーケンシングによる接種ウイルス内の導入変異部位の配列確認 15. PCR 法によるワクチニアウイルス検出試験 16. rmvegfpslamblind の細胞継代による変異復帰の有無の確認試験 ( 一部非公開 ) 17. rmvslamblind のヒト膵臓癌及び乳癌細胞移植マウス接種後のウイルス H 遺伝子配列解析 18. 組換え MV 接種動物からのウイルス排出検出試験 19. rmvslamblind のビーグルに対する安全性試験 ( 一部非公開 ) 20. rmvslamblind の霊長類サルに対する病原性試験 21. ヒト乳ガン細胞株 Xenograft モデルを用いた rmvslamblind の抗腫瘍効果の評価試験 22. 治療施設地図および室内配置図 ( 非公開 ) 23. 治療施設内動線 ( 非公開 ) 24. P2 試験室 P2A 治療室登録確認証明 ( 非公開 ) 25. 東京農工大動物医療センター会議議事録 2014 年 12 月 11 日 ( 非公開 ) 26. P2 試験室 P2A 治療室見取り図詳細および室内写真 ( 非公開 ) 27. 遺伝子組換え MV の運搬容器注入セット ( 非公開 ) 28. 東京農工大医療廃棄物処理規程 ( 省略 ) 29. 本遺伝子組換え MV の使用方法 30. クリーンブース HEPA フィルター資料 ( 省略 ) 31. rmvslamblind の腫瘍移植マウス接種後の尿中ウイルス排出試験 32. 東京農工大学イヌ遺伝子組換え麻疹ウイルス治療安全委員会細則 33. 飼い主への同意説明書 42

2 資料 1 麻疹ウイルスの分類構造複製様式図 1 麻疹ウイルス (measles virus: MV) の学問上分類とウイルス粒子構造分類 : 一本鎖マイナス鎖 RNA ウイルス ( モノネガウイルス目 ) パラミクソウイルス科モービリウイルス属 M N genome RNA L F H P 図 2 MV RNA ゲノム構造 3 leader 5 trailer 3 N P/V/C M F H L base AUG G 残基挿入 AUG AAAAAGGG RNA 編集部位 P mrna 5 AAAAAA 塩基 P V C アミノ酸 N: nucleoprotein P: phosphoprotein M: matrix protein F: fusion protein H: hemagglutinin protein L: large protein RNA 編集 : パラミクソウイルス科に共通の機構で RNA 依存 RNA ポリメラーゼ (RdRp) による P 遺伝子転写時に一定の割合で RNA 編集部位に G 残基が挿入されるこれにより下流の読み枠が P 蛋白と異なる V 蛋白が産生される図 3 麻疹ウイルスの細胞内増殖様式全ての複製過程は細胞質で行われる 5 3 antigenome RdRp 複製 RdRp 3 5 genome 転写 mrna N P M F H L nuclei Polar attenuation: モノネガウイルスに共通の機構で RdRpによる各遺伝子転写の際にゲノム上流の遺伝子 mrna 量が最も多く下流に行くに従いmRNA 量が段階的に減少する現象 43

資料 2 PVRL4 の構造と MVH 蛋白との相互作用 1) PVRL4 の立体構造模式図 ( 文献 11) 2)

に結合する ( 文献 14) 3) 左 :PVRL4 V domain( 紫 ) と MVH の結合状態の立体構造右

MVH の結合は 3 カ所 (I, II, III) 左 : 結合部位 I の立体構造の詳細 PVRL4 V

3 資料 2 PVRL4 の構造と MVH 蛋白との相互作用 1) PVRL4 の立体構造模式図 ( 文献 11) 2) MVH 蛋白の高次構造とレセプター結合領域 ( 文献 18) MVH 蛋白は PVRL4 の V domain に結合する ( 文献 14) 3) 左 :PVRL4 V domain( 紫 ) と MVH の結合状態の立体構造右 :PVRL4 V domain 立体構造 ( 水色 ) ( 文献 15) 4) 右 :PVRL4 V domain と MVH の結合は 3 カ所 (I, II, III) 左 : 結合部位 I の立体構造の詳細 PVRL4 V domain 内 FG loop 上の site I 内 PheProAlaGly が H 蛋白と相互作用する ( 文献 15) 44

4 5) 動物種間での PVRL4 一次配列の比較動物種によるヒト PVRL4( 全長 ) との相同性イヌ 94% ヒツジ 92% マウス 92% ハヤブサ 78% ゼブラフィッシュ 71% PVRL4 V domain の配列比較 site II site III ヒト 1 PAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDSGEQVGQVAWARVDAGEGAQELALLHSKYGLH 60 イヌ 1 PGELETSDLVTVVLGQDAKLPCFYRGDPGEQVGQVAWARVDAGEGARELALLHSKYGLH 59 ヒツジ 1 LAGELETSDLVTVVLGQDARLPCFYRGDPGEQVEQVAWARVDAGEGGRELALLNSKYGLH 60 マウス 1 SAGELETSDVVTVVLGQDAKLPCFYRGDPDEQVGQVAWARVDPNEGIRELALLHSKYGLH 60 ハヤブサ 1 RSGVVEVERSVTAVLGQDVVLPCRYRAQEQEQVVQVTWLKRGPTGEGAEVAVLNQQHGEH 60 ゼブラフィッシュ 1 DFVAPPPNYSLTSLAEEETILPCRYEPDAESTVVQVTWFQEKPDGTKEQIITAHHVNGKT *... ***.*.....* **.* *.. ヒト 61 VSPAYEGRVEQPPPPRNPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPP 120 イヌ 60 VSAAYEGRVEQPPPPRSPLDGAVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPP 119 ヒツジ 61 VSSAYEGRVEQPPPPRNPLDGAVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARLRLRVLVPP 120 マウス 61 VNPAYEDRVEQPPPPRDPLDGSVLLRNAVQADEGEYECRVSTFPAGSFQARMRLRVLVPP 120 ハヤブサ 61 VLEPYAGRVLRRAGGALEDGAIILRNAVQGDEGDYECHLITFPLGNFEGRLTLKVLVPP 119 ゼブラフィッシュ 61 AFGPWADRVEFNSNQPTKDSSLVIKITKISDEGKYTCHVSTFPFGNFETELSLLVYTHP **.....*....***.*.*...***.*.*...*.*...* site I ヒト 121 LP 122 イヌ 120 LP 121 ヒツジ 121 LP 122 マウス 121 LP 122 ハヤブサ 120 LP 121 ゼブラフィッシュ 120 IS *site I 内の FPAG 配列が H 蛋白との結合に特に重要ハヤブサゼブラフィッシュは 1 アミノ酸異なるため H 蛋白との親和性は低いと考えられる 45

5 資料 3 資料 4. 審査データの概要イヌ乳ガン細胞株を用いた rmvslamblind の抗腫瘍能評価イヌ乳ガン細胞株 9 種の PVRL4 発現を検索し陽性細胞には rmvslamblind が感染増殖して細胞死を誘導することを明らかにした ( 図 1) PVRL4 陽性イヌ乳ガン細胞株 (CF33) を皮下移植したマウス Xenograft モデルを用い rmvslamblind を腫瘍内投与することで抗腫瘍効果を示す事を明らかにした ( 図 2) 図 1: イヌ乳がん細胞株のレセプターの発現およびウイルス感染 1) FACS による PVRL4 発現イヌ乳ガン細胞株の検索 2) イヌ乳ガン細胞株への rmvegfpslamblind 感染 3) rmvegfpslamblind 感染による In vitro での細胞傷害性試験 (WST1 assay) 46 1

6 図 2: イヌ乳ガン細胞株 Xenograft モデルを用いた rmvslamblind の抗腫瘍効果の評価試験 1) 試験スケジュール 50 days 2) 腫瘍サイズの経時的測定 mean±sd Welch s t test * :P<0.05 **:P<0.01 3) ウイルス接種 50 日後に摘出した腫瘍の写真および重量 mean±sd Student t test *:P<

資料 4 MV 野外株のカニクイザルに対する病原性試験 MVHL 株 ( ウイルス力価 10 5.5 TCID 50 ) または MVICB 株 (10 6.

7 資料 4 MV 野外株のカニクイザルに対する病原性試験 MVHL 株 ( ウイルス力価 TCID 50 ) または MVICB 株 ( TCID 50 ) ( 共に野外株 ) をカニクイザルに接種接種 14 日まで臨床症状の観察 ICB 株接種後 8 日目の発疹の様子臨床症状ウイルス頭数接種法発疹コプリック斑 HL 株 4 皮下静脈鼻腔内 ++ + ICB 株 6 皮下静脈鼻腔内全面 ; + 局所的どの接種ルートにおいても発症しヒトのはしかと同様の症状をしめす文献 1 から引用改変 HL 株皮下接種 14 日までの各リンパ組織のウイルス力価 log TCID 50 /ml < 日系列腸間膜リンパ節 1 系列脾臓 2 系列胸腺 3 系列 4 骨髄感染初期からリンパ組織で増殖するまた血中白血球からもウイルスが検出される (data not shown) 文献 1 から引用改変 MVHL 株接種後のリンパ球数動態 8000 monkey IU/ml MVHL 株接種の血漿中サイトカイン濃度 IFN assay 日 pg/ml IL 日 2000 < 結果 > NA NA NA 0 pre 日全リンパ球数 CD8 CD4 感染後に一過性の激しい白血球減少と各種サイトカインの産生が起こる MV 野外株はカニクイザルに接種後リンパ節で増殖してヒトの麻疹同様の症状と宿主免疫反応を引き起こす 48 pg/ml IL 日 pg/ml IL 日文献 26 から引用改変

8 資料 6 rmvhl(7+) 構築図 3 leader MVHL ゲノム 5 trailer 3 N P/V/C M F H L base MVHL 感染 B95a 細胞からtotal RNAを抽出 random primerと逆転写酵素によりcdna 合成制限部位を付加した各遺伝子特異的 primer pair( 資料 7) を用いて各遺伝子を増幅 lef NF PF MF FF HF LF trf 5 N P/V/C M F H L 3 ler NR PR MR FR HR LR trr クローニングプラスミドに挿入しシークエンシングで配列を確認 BsmI NotI FseI PmeI MluI SgfI AscI BsiWI NotI FseI PmeI MluI SgfI AscI BsiWI EagI 特異的制限酵素で遺伝子カセットを切り出し隣接のカセットと結合していく全長 cdna が連結されたら BsmI/EagI で切り出し pmdb1 へ挿入 BsmI NotI FseI PmeI MluI SgfI AscI BsiWI EagI T7 promoter N P/V/C M F H L pmvhl(7+) ribozyme pmdb1 ( 文献 37) 49

9 資料 8 遺伝子組換え MV 作出用遺伝子カセット構築図 SgfI H 遺伝子カセット AscI N PF P MVHL genome cdna PEGFP R H ORF F 3 UTR H 5 UTR PEGFP F 介在配列 1854 塩基 2022 塩基 EGFP ORF pegfpn1 EGFP R (Clontech) SgfI AscI PCR H PF pbluescriptsk mutagenesis によるアミノ酸変異導入 overlap PCR EGFP R R533A SgfI/AscI 制限消化 H SLAMblind FseI EGFP 遺伝子カセット FseI EGFP ORF N 3 UTR 介在配列 P 5 UTR 852 塩基 720 塩基 FseI FseI EGFP Arg TCCAGGGTT TCCGCAGTT Ala pbluescriptsk FseI 制限消化 EGFP 50

より引用改変 2: イヌ SLAM/PVRL4 発現細胞株への感染性試験 SLAM 発現 PVRL4 発現 293 + 293/ SLAM + 293/

10 資料 9 SLAMblind H 遺伝子をもつ組換え MV の各種細胞株への感染性 1: SLAM/PVRL4 発現ヒト細胞株への感染性試験 SLAM 発現 PVRL4 発現 + + B95a MCF7 MDAMB453 SKBR3 + + rmvegfp rmvegfp SLAMblind 文献 35 より引用改変 2: イヌ SLAM/PVRL4 発現細胞株への感染性試験 SLAM 発現 PVRL4 発現 / SLAM + 293/ cnectin4 rmvegfp rmvegfp SLAMblind 文献 21 より引用改変結果 SLAMblind ウイルスは SLAM 陽性細胞への感染能が消失した 51

11 資料 10 本組換え体の作出に用いた供与核酸の構成要素の由来及び機能 52 構成要素サイズ (bp) 由来機能 H SLAMblind 遺伝子カセット F 3 UTR 137 HVHL ゲノム由来 cdna F 遺伝子 ORF 下流の非翻訳領域 ( 生理的機能を持つ報告はない ) 5 末端を SgfI 制限配列に置換介在配列 3 HVHL ゲノム由来 cdna 同上 H 5 UTR 20 HVHL ゲノム由来 cdna H 遺伝子 ORF 上流の非翻訳領域 ( 生理的機能を持つ報告はない ) SLAMblind 遺伝子 ORF H 蛋白のリンパ系細胞受容体 SLAM への結合能を欠損することを目的に 533 残基 Arg の Ala へのアミノ酸変異に相当する 3 塩基置換を導入してある ( 資料 35) 3 末端に AscI 制限配列 8bp を付加 1854(+8) HVHL ゲノム由来 cdna H 遺伝子からは細胞膜上の MV 受容体への結合を担う H 蛋白が産生される EGFP 遺伝子カセット N 3 UTR 59 HVHL ゲノム由来 cdna 同上介在配列 3 HVHL ゲノム由来 cdna 同上 P 5 UTR 59 HVHL ゲノム由来 cdna 同上 EGFP 遺伝子 ORF 720(+8) オワンクラゲ由来 cdna 紫外線照射により緑色蛍光を発する 3 末端に FseI 制限配列 8bp を付加

12 資料 11 pgem5z, pmdb1 プラスミドマップ pgem5zf(+) のマップ pmdb1 の構造ウイルスゲノム cdna は BsmIEagI 間に挿入した 53

13 資料 12 pmvslamblind 構築図 NotI FseIPmeIMluI SgfI AscI BsiWI N P/V/C M F H L pmvhl(7+) SgfI/AscI 制限消化 NotI FseI PmeIMluI SgfI AscI H SLAMblind カセットに置換 BsiWI P/V/C H NotI FseIPmeIMluI SgfI AscI BsiWI P/V/C pmvslamblind FseI 制限消化 FseI FseI EGFP カセット挿入 NotI FseI FseI PmeIMluI SgfI AscI BsiWI N M F L EGFP pmvslamblindegfp 54

14 資料 13 資料 4. 審査データの概要 Reverse Genetics の概要 HEK293 細胞 T7 RNA polymerase 遺伝子組換えワクチニアウイルス (MVAT7 * ) 感染 * replicationdeficiency 型ワクチニアウイルス哺乳細胞では感染はするが複製は起こらず reverse genetics の過程で消失する ( 資料 15) T7 RNA polymerase の発現 transfection 試薬によるプラスミド導入 N P M F H L pmvslamblind N P L RPVN, P 遺伝子をクローニングプラスミド pks に L 遺伝子を pgem5zf に挿入 T7 polymerase により各遺伝子が転写される T7 RNA polymerase によるヌクレオカプシド RdRp P N L pmvslamblind から全長 RNA ゲノムの合成 N 蛋白の発現 L 蛋白の発現 P 蛋白の発現ゲノム複製ヌクレオカプシド mrna 転写ウイルス蛋白ヌクレオカプシドを形成ウイルス RdRp 複合体を形成ウイルスゲノムの複製各ウイルス遺伝子の転写組換えウイルス粒子の再構成 MCF7 細胞 * の重層ヌクレオカプシドの合成各ウイルス蛋白の合成再構成された組換えウイルスが PVRL4 陽性 MV 感受性 MCF7 細胞に感染しウイルスが複製増殖する組換えウイルスの増殖 * MCF7 細胞組換えウイルスの作出 55 ヒト乳癌細胞由来細胞株 PVRL4 陽性でMV 高感受性細胞バンク上の情報では他のウイルス迷入の報告なし東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから分与

論文題目　　腸管分化に関わるmiRNAの探索とその発現制御解析

論文題目　　腸管分化に関わるmiRNAの探索とその発現制御解析論文題目腸管分化に関わる microrna の探索とその発現制御解析氏名日野公洋 1. 序論 microrna(mirna) とは細胞内在性の 21 塩基程度の機能性 RNA のことであり部分的相補的な塩基認識を介して標的 RNA の翻訳抑制や不安定化を引き起こすことが知られている mirna は細胞分化や増殖ガン化やアポトーシスなどに関与していることが報告されておりこれら以外にも様々な細胞諸現象に関与していると考えられている