<4D F736F F D D416C6C E B697482C982E682E98A8890AB89BB8D AEE8B8582CC8C9F8F6F2E646F63>

Transcription

1 細胞機能に基づくアレルギー試験 >> 17 Allergenicity キットによる活性化好塩基球の検出 監修 :( 独 ) 国立病院機構三重病院臨床研究部 藤澤隆夫先生 はじめに Allergenicity キットは フローサイトメトリーによって末梢血好塩基球の各種アレルゲンに対する反応性を検出するための試薬キットです 好塩基球に特異的な細胞表面マーカーである CD203c の発現強度が 細胞の活性化に伴って増強することを利用して活性化好塩基球を検出することが可能です 通常 好塩基球は細胞表面に Fc レセプタを介してアレルゲン特異的 IgE 抗体を結合しており アレルゲンによって細胞表面の IgE 抗体が架橋されると細胞の活性化が起こります 活性化した好塩基球は最終的には脱顆粒し ヒスタミンなどのアレルギー症状を惹起する化学物質を放出します 花粉症に代表される Ⅰ 型アレルギーでは これまで肥満細胞がもっとも重要なエフェクター細胞であるとされてきましたが 最近は好塩基球の役割も注目されています 1) さらに 組織に存在する肥満細胞は臨床において活性を測定することが困難ですが 末梢血中の好塩基球を利用すれば エフェクター細胞を直接 かつ簡便に評価することが可能になります 好塩基球のアレルゲンに対する反応性に着目した試験方法には ヒスタミンリリーステスト (HRT) がありますが これは好塩基球が脱顆粒した際に放出されるヒスタミンを定量するものです したがって好塩基球の活性化を検出しているとは言えず 必ずしも十分な感度を有していない場合も少なくありません 一方 最も汎用されているアレルギーの臨床検査法として RAST(Radioallergosorbent Test) があります これは 末梢血中のアレルゲン特異 IgE 抗体を検出することによって 感作アレルゲンを同定する in vitro 試験として非常に有用です しかしながら 測定対象は末梢血中に遊離している IgE 抗体であり 生体や細胞のアレルゲンに対する反応性を直接反映するものではありません Allergenicity キットは末梢血好塩基球の活性化をフローサイトメトリーにより直接 高感度に検出するため 食物アレルギーの診断 特に耐性獲得の診断や 減感作療法の効果判定及びモニタリングなどに応用可能と考えられます 2) 活性化 (CD203c の発現が増強 ) < 図 1. 末梢血好塩基球の活性化及び脱顆粒 > アレルゲンによる細胞表面の IgE 抗体の架橋によって活性化し 最終的に脱顆粒してアレルギー症状を誘発 組織中の肥満細胞も同様の反応によって脱顆粒することから より採取の容易な好塩基球による試験が有用であると考えられる IgE 抗体 アレルゲン 脱顆粒

2 Allergenicity キットの好塩基球検出方法 ( ゲーティングストラテジー ) 好塩基球は末梢血中にはごく少数しか存在せず その散乱光特性 ( スキャッターサイトグラム上の位置 ) がリンパ球や単球に近いため のみを用いたシングルカラー測定では好塩基球集団の判別が難しい場合が少なくありません ( 図 2) リンパ球 単球 好塩基球 A B A では 好塩基球がリンパ球や単球から分離した明瞭な1つの集団としてゲーティングすることが可能だが B のようなサンプルでは リンパ球及び単球と好塩基球との分離が不明瞭で ゲーティングが難しい < 図 2.CD203c による非活性化状態の好塩基球測定例 > ( 健常者末梢血 ) Allergenicity キットは好塩基球の特異的なマーカーである CD203c に リンパ球の大部分を占める T リンパ球のマーカーである CD3 と 好塩基球 Th2 リンパ球及び好酸球に特異的に発現する CRTH2(CD294) を組み合わせることで 好塩基球のより確実なゲーティングを可能にしています ( 図 3) 3,4) Count FSC CD3-PC7 CRTH2(CD294)-FITC < 図 3. Allergenicity キットによる末梢血好塩基球の 3 カラー測定例 > ( 雑草花粉エキスにて刺激 ) 1 全白血球にゲートを設定 CD3-PC7/ プロットに展開 2 CD3 陰性の単核球領域にゲートを設定 CRTH2(CD294)-FITC/ プロットに展開 (CRTH2 陽性細胞のうち 顆粒球領域に存在する好酸球 CD3 陽性である Th2 細胞は除外され CD3 陰性単核球ゲートの CRTH2 陽性細胞は好塩基球のみとなります ) *CRTH2 陽性細胞については次ページを参照 3 CRTH2(CD294) CD203c ダブルポジティブの細胞集団が好塩基球 ( 活性化に伴い CD203c 蛍光強度が増強します ) 4 好塩基球をヒストグラムに展開 ( 横軸 :)

3 Allergenicity キット ( 製品番号 :A17116) 試薬構成 1. CRTH2(CD294)-FITC//CD3-PC7 3 カラー抗体 100 テスト 1 バイアル 2. ポジティブコントロール試薬 ( 抗 -IgE 抗体 : 凍結乾燥品 ) 100 テスト 1 バイアル 3. 活性化バッファ 50 テスト 2 バイアル 4. 反応停止液 100 テスト 1 バイアル 5. 溶血試薬 50 テスト 3 バイアル 6. 固定試薬 100 テスト 1 バイアル 容量 :100 サンプル分 1 キットで測定サンプル 100 本分の調製が可能です ネガティブコントロール及びポジティブコントロールの立て方によって 測定可能な検体数は変動します キット内に機器調整 ( 感度設定 蛍光補正 ) 用の試薬及び刺激に使用するアレルゲン試薬は含まれませんので 別途ご用意ください また アレルゲン試薬については 弊社での取り扱いはございません あらかじめご了承ください CD203c CD203c は ecto-nucleotide pyrophosphatase / phosphodiesterase (E-NPP) ファミリーに属する膜型酵素で 細胞外ヌクレオチドの分解に関与します 好塩基球及び肥満細胞に特異的に発現しますが 特に好塩基球においては 細胞の活性化に伴って CD203c の発現強度が速やかに増強します 5) 従来 好塩基球の活性化マーカーとしては CD63 が利用されてきましたが CD203c はより高感度に好塩基球の活性化を検出するとの報告もあります 6) CD63 脱顆粒の指標 CD63 は脱顆粒球のマーカーとしても有用です 7) 本キットに CD63 抗体は含まれません 活性化の指標 < 健常者末梢血好塩基球の 2 カラー測定例 > 未刺激時 ( 上段 ) 抗 -IgE 抗体にて 15 分刺激後 ( 下段 ) CRTH2 (CD294) CRTH2 は Nagata らにより見出された 7 回膜貫通型の細胞表面 G タンパク質共役受容体で プロスタグランジン D2 レセプタとして機能します 好塩基球のほか Th2 細胞や好酸球 一部の樹状細胞膜表面に発現します 8) アトピー性皮膚炎や HIV 感染症患者末梢血において CRTH2 陽性細胞の比率が健常者と比較して優位に上昇していることも報告されています 9) 好酸球 Proinflammatories monocytes/dendritic cells 好酸球 Type 2 T cells 好塩基球 FSC CRTH2-PE 好中球 CRTH2-PE CD16-FITC CRTH2-PE 健常者末梢血の CRTH2(CD294)-PE 測定例 健常者末梢血の 2 カラー測定例 (CD16-FITC 抗体は本キットには含まれません )

4 機器調整 Allergenicity キットは CRTH2(CD294)-FITC//CD3-PC7 による 3 カラー解析を行います 測定に際しては 事前に適切な光学フィルタを設定し 感度及び蛍光補正を最適化しておく必要があります 1) 重要光学フィルタ設定 FITC PE 及び PC7 の波長特性は下記のとおりです 必要に応じて 光学フィルタ設定を変更してください Cytomics FC500 サイトメーターをご使用の場合 光学フィルタ設定の変更は必要ありません 注意 励起波長 (nm) 最大蛍光波長 (nm) FITC PE PC7(PE-Cy7) Relative Fluorescence FITC PE PC5 ECD APC PE-Cy5.5 PC7 APC7 EPICS XL をご使用の場合は 光学フィルタ設定の変更が必要です 光学フィルタ設定の変更には お手持ちの光学フィルタまたは下記フィルタキットをご利用ください 500nm 600nm 700nm Emission Wavelength 800nm 製品番号 価格 PC7 フィルタキット \134,000 上記以外のフローサイトメーターをご使用の場合は 機器メーカーにお問い合わせください 2) 感度及び蛍光補正の最適化 ネガティブコントロール及び適当な抗体を利用して FL1(FITC 蛍光を検出 ) FL2(PE 蛍光を検出 ) 及び FL5(PC7 蛍光を検出ただし EPICS XL の場合は FL4) 検出器の感度と各検出器間の蛍光補正を調整してください 蛍光補正は 必ずしもサンプル測定に使用するのと同じ抗体で染色して調整する必要はありません 例えば CD3-FITC CD8-PE 及び CD4-PC7 の各単染色サンプルを使用して調整することも可能です 蛍光補正は以下の 6 通りの調整が必要です ( 計 3 つのプロット (2 パラメータ ) が必要になります ) 1 FL1(FITC) FL2(PE) 3 FL1(FITC) FL5(PC7) 5 FL2(PE) FL5(PC7) 2 FL2(PE) FL1(FITC) 4 FL5(PC7) FL1(FITC) 6 FL5(PC7) FL2(PE) FL1 Log FL1 Log FL2 Log EPICS XL の場合 PC7 蛍光は FL4 で検出 ( ただし光学フィルタの交換が必要 ) なお 感度調整及び蛍光補正に必要な試薬は Allergenicity キットには含まれません 別途ご用意ください 機器調整の操作方法詳細は 機器取り扱い説明書をご参照ください 蛍光補正や測定原理の詳細については 下記弊社サイトメトリー専門 Web サイトにおいても解説しています ベックマン コールター株式会社サイトメトリー専門 Web サイト :

5 サンプル調製手順 下表及び Allergenicity キット製品能書を参照して 測定サンプルを調製してください 好塩基球の CD203c 発現強度は検体によって異なりますので ネガティブコントロール ( 非活性化好塩基球 ) は検体ごとに調製されることをお勧めします また ポジティブコントロール ( 活性化好塩基球 ) に関しても 当該検体の好塩基球が細胞表面の IgE 抗体に対する刺激に対して十分な反応性を有しているかを確認するために 検体ごとに測定されることをお勧めします なお アレルゲンエキスはキット内に含まれませんので 別途ご用意ください また 初回アッセイ時には 数段階の希釈系列を作成したアレルゲンエキスを利用して 最適なアレルゲンエキス濃度を決定する必要があります *1: ポジティブコントロール ( 抗 -IgE 抗体 ) は凍結乾燥品です 1mL の精製水に溶解してください 溶解後の抗体は 少量ずつ小分けして -20 にて凍結保存してください アッセイ時には 融解後 20 倍希釈した溶液をワーキングソリューションとして使用します *2: 検体としてヘパリン血を用いる場合には 活性化バッファの添加は必要ありません *3: キット添付の溶血剤及び固定試薬を用いて あらかじめ調整が必要 溶血試薬 : 固定液 =40:1 *4: キット添付の固定液と PBS 溶液による調整が必要 固定液 :PBS=1:80

6 サンプル測定 本キットは 3 カラー (FITC/PE/PC7) アプリケーションです 下記例を参考にプロットを設定したのちに感度設定及び蛍光補正を行い ( プロトコル作成 ) 前頁の手順で調整したサンプルを測定してください 下図の中段及び下段プロットは感度及び蛍光補正の調整用プロットです ( 下段の 1 パラメータヒストグラムで感度設定 中段の 2 パラメータドットプロットで蛍光補正 ) ここではリンパ球を利用して調整する場合を想定して 調整用のプロットにはリンパ球ゲート ( 左上プロット内の Lymph リージョン ) を設定しています サンプル測定 / 解析用プロット 感度調整 / 蛍光補正用プロット例では サンプル測定用プロット (FS/SS) 内に作成したリンパ球ゲートを設定しています 機器調整時に使用する細胞やマーカーに応じて 設定するゲートは適宜変更してください EPICS XL を使用する場合は PC7 蛍光の検出に選択する検出器は FL4 になります ( ただし光学フィルタの交換が必要 ) 図では FL5 を選択 (FC500 で測定の場合 ) 測定に際してのヒント 1) 好塩基球は 全白血球中の 1% 程度と極めて微量な細胞です 測定の際には 全白血球で 100,000 イベント程度のデータを取得することをお勧めします 好塩基球分画として 500 イベント以上のデータを得る場合には さらに総イベント数を多くしなければいけない場合もあります 2) テストサンプルにおける好塩基球の活性化程度は アレルゲンエキスの代わりに PBS を添加したネガティブコントロールとの比較により判定します ネガティブコントロールは 検体ごとに必ず測定してください 3) ポジティブコントロールは 抗 -IgE 抗体によって好塩基球表面に結合した IgE 抗体を架橋することで CD203c の発現を増強させます もし ポジティブコントロールとネガティブコントロールの CD203c 発現強度に差が認められない場合には 再度サンプルを調製し直してから測定してください また 好塩基球自体が確認できない場合などは 機器設定 ( 感度設定及び蛍光補正 ) も見直すことをお勧めします 4) まれに 抗 -IgE 抗体によっても反応しない Non-responder が存在しますが IL-3 とのプレインキュベーションにより反応性が回復する場合があります

7 データ例 スギ花粉症測定例 ( データ提供 :( 独 ) 国立病院機構三重病院臨床研究部藤澤隆夫先生 ) EDTA 採血したスギ花粉症 ( スギ RAST: クラス 4, 総 IgE 値 :130U/mL) 全血に 治療用標準化スギ花粉エキスを添加して好塩基球の活性化を検出 (CRTH2-FITC/ のドットプロット上にて 活性化好塩基球を赤でペイント ) 添加したスギアレルゲン量の上昇に伴って 好塩基球表面の CD203c 発現強度 ( 蛍光強度 ) も上昇していることが分かります ヒストグラム中の陽性率 (%) は 全好塩基球に対する活性化好塩基球の割合 ネガティブコントロール (PBS 添加 ) ポジティブコントロール ( 抗 -IgE 抗体にて刺激 ) Count 1.7% Count 69.5% CRTH2(CD294)-FITC CRTH2(CD294)-FITC テストサンプル ( スギアレルゲンエキスにて刺激 ) 添加スギアレルゲン量 (U) CRTH2(CD294)-FITC Count 5.4% 27.6% 59.6% 91.6% 測定及びデータ解析 : ( 独 ) 国立病院機構三重病院臨床研究部長尾みづほ先生 徳田玲子先生 野間雪子先生

8 参考文献 1) Falcone FH, Haas H, Gibbs BF : The human basophil: a new appreciation of its role in immune responses. Blood 2000, 96(13) : ) Hida S, Tadachi M, Saito T, Taki S : Negative control of basophil expansion by IRF-2 critical for the regulation of Th1/Th2 balance. Blood 2005, 106(6) : ) Bouvier G, Dehard AL, Gendt L, Canino C, Bienvenu J, Monneret G : A new three-colour flow cytometric combination (CD203C/CRTH2/CD3) for monitoring allergen-induced basophil activation. Cytometry 2004, 59A(1) : ) Radhia B, Anne-Lise D, Guillaume M : The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clin. Mol. Allergy 2005, 3 : 9. 5) Buhring HJ, Seiffert M, Giesert C, Marxer A, Kanz L, Valent P, Sano K : The basophil activation marker defined by antibody 97A6 is identical to the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3. Blood 2001, 97(10) : ) Boumiza R, Monneret G, Forissier MF, Savoye J, Gutowski MC, Powell WS, Bienvenu J : Marked improvement of the basophil activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clin. Exp. Allergy 2003, 33(2) : Comment in: Clin. Exp. Allergy 2003 Jun; 33(6) : 849-2; author reply Clin. Exp. Allergy 2003 Jun; 33(6) : 849; author reply ) Knol EF, Mul FP, Jansen H, Calafat J, Roos D : Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J. Allergy Clin. Immunol. 1991, 88(3 Pt 1) : ) Nagata K, Tanaka K, Ogawa K, Kemmotsu K, Imai T, oshie O, Abe H, Tada K, Nakamura M, Sugamura K, Takano S : Selective expression of a novel surface molecule by human Th2 cells in vivo. J. Immunol. 1999, 162(3) : ) Cosmi L, Annunziato F, Galli MIG, Maggi RME, Nagata K, Romagnani S : CRTH2 is the most reliable marker for the detection of circulating human type 2 Th and type 2 T cytotoxic cells in health and disease. Eur. J. Immunol. 2000, 30(10) : CE