学位論文の要約 Pro-fibrotic phenotype of human skin fibroblasts induced by periostin via modulating TGF-β signaling (TGF-β シグナル伝達調節によるペリオスチンの線維化促進作用の検討 ) Miw

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ほだかきちや
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1 学位論文の要約 Pro-fibrotic phenotype of human skin fibroblasts induced by periostin via modulating TGF-β signaling (TGF-β シグナル伝達調節によるペリオスチンの線維化促進作用の検討 ) Miwa Kanaoka 金岡美和 Department of Environmental Immuno-Dermatology Yokohama City University Graduate School of Medicine 横浜市立大学大学院医学研究科医科学専攻環境免疫病態皮膚科学 (Doctoral Supervisor : Michiko Aihara, Professor) ( 指導教員 : 相原道子教授 )

2 学位論文の要約 Pro-fibrotic phenotype of human skin fibroblasts induced by periostin via modulating TGF-β signaling (TGF-β シグナル伝達調節によるペリオスチンの線維化促進作用の検討 ) 背景ペリオスチンはマウス骨芽細胞より発見された 90kDa の細胞外マトリックスタンパク質で, 主に心筋, 骨, 平滑筋, 線維芽細胞より産生される. これまでの研究より, 癌の浸潤 (Ruan et al.,2009), 創傷治癒 (Hamilton,2008), アレルギー性炎症 (Masuoka et al.,2012) などに深く関与する分子であることが明らかになっている. 線維化の領域では当科の Yamaguchi ら (2013) が全身性強皮症 (Systemic sclerosis;ssc) 患者の血清でペリオスチンの発現が上昇しており, 皮膚のスキンスコアと強く正相関することを報告した. ペリオスチンノックアウトマウスではブレオマイシン誘導性の皮膚, 肺の線維化が抑制される (Uchida et al.,2012;yang et al.,2012) という報告があることから, ペリオスチンが線維化を促進することが示唆されるが, そのメカニズムについてはまだ不明な点も多い. 目的ヒト皮膚線維芽細胞における TGF-β シグナル伝達調節によるペリオスチンの線維化促進作用を検討する. 方法ペリオスチンがヒトの皮膚線維芽細胞における細胞外マトリックス産生を増強するのかを検討するため, ヒトリコンビナントのペリオスチン (rpn) で刺激をした細胞の培養上清

3 における Type I Collagen の発現を免疫ブロット法で検討した. 同様の検討を TGF-β 存在下でも行った. ペリオスチンによる線維化のメカニズムをさらに検討するため, ヒトペリオスチンを発現したレトロウイルスを皮膚線維芽細胞にトランスフェクションし, ペリオスチン高発現細胞を作製した. この細胞を用いて,TGF-β 存在下で細胞外マトリックスタンパク質,αSMA,Egr-1,MMP-1 の産生を評価した. さらに, ペリオスチンが TGF-β 下流の Smad シグナルに及ぼす影響を検討するため,TGF-β 刺激下でのペリオスチン高発現細胞における R-Smad 活性を, リポーターアッセイを用いて測定した. 次に抑制系 Smad である Smad 7 の発現を,TGF-β 刺激後のペリオスチン高発現細胞で確認した.RNA 干渉法によりペリオスチンの発現を低下させた細胞でも, 同様に Smad 7 の発現を評価した.Smad 7 の変化が細胞表面にある受容体であるインテグリン α V を介した細胞外在性のペリオスチンによるのかを評価するため,RNA 干渉法によりインテグリン α V の発現を低下させた細胞で,rPn と TGF-β 刺激後の Smad 7 の発現を検討した. 結果ヒト皮膚線維芽細胞に rpn 単独刺激をしても Type I Collagen の発現は上昇しなかったが,TGF-β と共に刺激をしたところ, その発現が TGF-β 単独刺激に比較して増強する傾向がみられた. そのため, ペリオスチン高発現細胞を用いて,TGF-β 刺激による細胞外マトリックスタンパク質,αSMA,Egr-1 の発現レベルを検討したところ顕著に増強した. 逆に, 細胞外マトリックスの分解に関与する MMP-1 の発現や活性は抑制された. 次に, ペリオスチンは TGF-β シグナルを増強する可能性を検討したところ, ペリオスチン高発現細胞では TGF-β 刺激下で誘導される活性型 Smad が増強する傾向はあったものの, 有意差を認めなかった. 一方,TGF-β 刺激によって誘導される抑制系 Smad 7 の発現は, ペリオスチン高発現細胞ではより低下し, 逆に, ペリオスチン発現抑制細胞では有意に上昇した. さらに, ペリオスチンの受容体として知られるインテグリン αv 発現を抑制した細胞では rpn と TGF-β の共刺激による Smad 7 の低下はみられなかった. 考察これまでの報告においてペリオスチンが pro-fibrotic な作用を示す可能性が示されているがそのメカニズムは不明な点が多かった我々の検討においてペリオスチン単独刺激ではヒト皮膚線維芽細胞における細胞外マトリックス産生の増強を認めなかったが TGFβ 存在下ではペリオスチンにより有意な pro-fibrotic 作用を確認したことからペリオスチンが TGF-β シグナルを増強する可能性を考えた ( 図 1)

図 1 TGF-β により誘導されるペリオスチン高発現での細胞外マトリックス産生 TGF-β は主に受容体下流の Smad ファミリーの活性化を介してシグナルを伝達する Smad シグナルは活性型 Smad と Smad

インテグリン α V β3 および α V β5 のリガンドとして機能することが報告されている (Gillan et al.,2002).

4 図 1 TGF-β により誘導されるペリオスチン高発現での細胞外マトリックス産生 TGF-β は主に受容体下流の Smad ファミリーの活性化を介してシグナルを伝達する Smad シグナルは活性型 Smad と Smad 7 を代表とする抑制型 Smad によりそのシグナルが調節される本研究によりペリオスチンは抑制型 Smad 7 の発現を抑制することで TGF-β シグナルを増強する可能性を見出したまたペリオスチンは, インテグリン α V β3 および α V β5 のリガンドとして機能することが報告されている (Gillan et al.,2002).rna 干渉法によりインテグリン α V の発現を抑制した細胞を用いることで, ペリオスチンと TGFβ の共刺激による Smad 7 の発現低下を認めなかったことから,Smad 7 の発現調節にはインテグリン α V を介した外因性ペリオスチンが関与している可能性が示唆された. 一方 TGF-β 存在下においてペリオスチンがどのように Smad 7 発現を調節するのかまたペリオスチンが Smad ファミリー以外の TGF-β 下流因子に作用する可能性などについて不明な点が残る TGF-β とペリオスチンの直接的な相互作用などを含めた今後の検討が必要である結論ペリオスチンは抑制系 Smad 7 の発現を低下させることで TGF-β によって誘導される細胞外マトリックス産生や Pro-fibrotic 因子を増強し線維化を誘導する可能性が示唆された.

5 引用文献 Gillan, L., Matei, D., Fishman, D.A., Gerbin, C.S., Karlan, B.Y., Chang, D.D. (2002), Periostin secreted by epithelial ovarian carcinoma is a ligand for alpha(v)beta(3) and alpha(v)beta(5) integrins and promotes cell motility, Cancer Res, 62, Hamilton, D.W. (2008), Functional role of periostin in development and wound repair: implications for connective tissue disease, J Cell Commun Signal, 2, Ruan, K., Bao, S., Ouyang, G. (2009), The multifaceted role of periostin in tumorigenesis, Cell Mol Life Sci, 66, Masuoka, M., Shiraishi, H., Ohta, S., Suzuki, S., Arima, K., Aoki, S., Toda, S., Inagaki, N., Kurihara, Y., Hayashida, S., Takeuchi, S., Koike, K., Ono, J., Noshiro, H., Furue, M., Conway, S.J., Narisawa, Y., Izuhara, K. (2012), Periostin promotes chronic allergic inflammation in response to Th2 cytokines, J Clin Invest, 122, Uchida, M., Shiraishi, H., Ohta, S., Arima, K., Taniguchi, K., Suzuki, S., Okamoto, M., Ahlfeld, S.K., Ohshima, K., Kato, S., Toda, S., Sagara, H., Aizawa, H., Hoshino, T., Conway. S.J., Hayashi, S., Izuhara, K. (2012), Periostin, a matricellular protein, plays a role in the induction of chemokines in pulmonary fibrosis, Am J Respir Cell Mol Biol, 46, Yamaguchi, Y., Ono, J., Masuoka, M., Ohta, S., Izuhara, K., Ikezawa, Z., Aihara, M., Takahashi, K. (2013), Serum periostin levels are correlated with progressive skin sclerosis in patients with systemic sclerosis, Br J Dermatol, 168, Yang, L., Serada, S., Fujimoto, M., Terao, M., Kotobuki, Y., Kitaba, S., Matsui, S., Kubo, A., Naka, T., Murota, H., Katayama, I. (2012), Periostin facilitates skin sclerosis via PI3K/Akt dependent mechanism in a mouse model of scleroderma, PloS One, 7, e41994.

6 論文目録 Ⅰ 主論文 Pro-fibrotic phenotype of human skin fibroblasts induced by periostin via modulating TGF-β signaling Kanaoka, M., Yamaguchi, Y., Komitsu, N., Feghali-Bostwick, C.A., Ogawa, M., Arima, K., Izuhara, K., Aihara, M. J Dermatol Sci, (2018), doi: /j.jdermsci Ⅱ 副論文なし Ⅲ 参考論文 1 Paraneoplastic pemphigus associated with fatal bronchiolitis obliterans and appearance of anti-bp180 antibodies in the late stage of the disease Kanaoka, M., Matsukura, S., Ishikawa, H., Matsuura, M., Ishii, N., Hashimoto, T., Aihara, M. J Dermatol, 41, , Reduction of interleukin-10 production by B cells in intractable toxic epidermal necrolysis Hakuta, A., Fujita, H., Kanaoka, M., Watanabe, M., Izumi, K., Watanabe, T., Komitsu, N., Itoh, M., Tanito, K., Takahashi, Y., Aihara, M. J Dermatol, 42, , Case of subepidermal autoimmune bullous disease with psoriasis vulgaris reacting to both BP180 C-terminal domain and laminin gamma-1 Ishida, S., Takahashi, K., Kanaoka, M., Okawa, T., Tateishi, C., Yasukochi, A., Ishii, N., Li, X., Hashimoto, T., Aihara, M. J Dermatol, 42, , 2015.

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<4D F736F F D F4390B38CE3816A90528DB88C8B89CA2E646F63> 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者論文題目主査荒川真一御給美沙副査木下淳博横山三紀 Thrombospondin-1 Production is Enhanced by Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide in THP-1 Cells ( 論文の内容の要旨 ) < 要旨 > 歯周炎はグラム陰性嫌気性細菌によって引き起こされる慢性炎症性疾患であり