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えみおいもり
5 years ago
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1 学位論文の要旨 Epac1 Deficiency Attenuates Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointimal Formation (Epac1 欠損の血管平滑筋細胞の遊走および血管内膜肥厚形成に対する抑制効果 ) Yuko Kato 加藤優子 Cardiovascular Research Institute Yokohama City University Graduate School of Medicine 横浜市立大学大学院医学研究科医科学専攻循環制御医学 ( Doctoral Supervisor:Yoshihiro Ishikawa, Professor ) ( 指導教員 : 石川義弘教授 )

3 学位論文の要旨 Epac1 Deficiency Attenuates Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointimal Formation (Epac1 欠損の血管平滑筋細胞の遊走および血管内膜肥厚形成に対する抑制効果 ) ( 序論 ) 血管平滑筋細胞の遊走により引き起こされる血管内膜肥厚は, 経皮的冠動脈形成術後の再狭窄や動脈硬化などに関与する病態である. 虚血性心疾患の治療では, 経皮的冠動脈形成術が広くおこなわれているが, 約 40% の患者では術後の血管内膜肥厚が過剰に起こり, 再狭窄が発生する. 血管内膜肥厚の主体は, 血管中膜の平滑筋細胞の内膜側への遊走である. アクチン結合タンパク質であるコフィリンはアクチンフィラメントの切断をおこなう分子で, リン酸化によって活性が制御される. アクチンが切断されると, アクチン骨格の重合が促進されて葉状仮足を形成し, 細胞が移動する (Oser et al., 2009). 血管傷害や動脈硬化巣における平滑筋細胞の遊走や血管内膜肥厚形成には PDGF-BB が重要である.PDGF-BB は P PDGFRβに結合すると, プロスタグランジン E2 の産生を介して細胞内のサイクリック AMP(cAMP) 濃度を増加させる (Bornfeldt et al., 1997).cAMP は生体内の主要なセカンドメッセンジャーでサイクリック AMP グアニンヌクレオチド交換因子 (Epac) を活性化する Epac はさらに下流の Rap を活性化しシグナルを下流に伝達する.Epac には Epac1 と Epac2 の2つのアイソフォームがあり, Epac1 は血管を含む他の多くの組織に発現する (Bos, 2003). 先行研究より, 傷害後のマウス大腿動脈の内膜肥厚部では Epac1 の発現が増加したこと, Epac1 が平滑筋細胞の遊走を促進したことを報告した (Yokoyama et al., 2008). これらにより,Epac1 が平滑筋細胞の遊走や内膜肥厚形成において重要な役割を果たすことが示唆された. さらに, 血管内膜肥厚の形成には骨髄由来細胞も寄与する. そこで本研究では,Epac1 の内膜肥厚に対する役割を in vivo で確認し, さらに Epac1 が平滑筋細胞の遊走を促進する分子メカニズムを検討した. ( 方法 ) Epac1 野生型マウスおよび Epac1 欠損マウスの胸部大動脈より,Explant 法にて血管平滑筋細胞を初代培養した. 血管平滑筋細胞を血小板由来成長因子 (PDGF-BB) で刺激し, タイムラプスを用いて 8 時間の細胞の動きを撮影, 遊走距離を計測した. 細胞内カルシウム濃度の変化は血管平滑筋細胞内に Fura-2AM を導入し 340/390nm の蛍光強度比により検出した. 葉状仮足の形成は Cofilin の脱リン酸化を指標として蛍光免疫細胞染色にて形態学

4 的に評価した. 血管平滑筋細胞内のリン酸化コフィリンタンパクの発現量の変化は, ウエスタンブロッティング法により定量した.SiRNA により血管平滑筋細胞の Rap1a の発現を抑制し,Rap1a の作用を評価した.Epac1 野生型マウスおよび Epac1 欠損マウスの大腿動脈にワイヤーを通して傷害し, 血管傷害モデルマウスを作製した. 傷害 4 週間後に傷害血管組織をエラスチカ染色し, 内膜肥厚の形成度を組織学的に評価した. さらに, 傷害 1 週, 2 週,4 週間後の血管組織を採取し, 内膜肥厚形成を経時的に評価し, 加えてリン酸化コフィリンの発現を, 蛍光免疫組織染色を用いて検出した. 血管内膜肥厚への骨髄由来細胞の関与を明らかにするため,Epac1 野生型マウスと Epac1 欠損マウス間で骨髄移植をおこなった骨髄キメラマウスの大腿動脈にワイヤーを通して傷害し, 血管傷害モデルマウスを作製, 傷害 4 週間後に傷害血管組織をエラスチカ染色し, 内膜肥厚の形成度を組織学的に評価した. ( 結果 ) PDGF-BB で刺激した Epac1 野生型血管平滑筋細胞の遊走距離は無刺激時に比べ 2 倍増加したが,Epac1 欠損型血管平滑筋細胞の遊走は 1.2 倍の増加で,Epac1 野生型血管平滑筋細胞と比べて有意に低下していた.PDGF-BB で刺激した Epac1 欠損型血管平滑筋細胞では細胞内カルシウムの上昇が Epac1 野生型血管平滑筋細胞と比較し, 有意に低下していた. また,PDGF-BB または Epac の選択的刺激により Epac1 野生型血管平滑筋細胞ではコフィリンの脱リン酸化をともなう葉状仮足を持つ細胞数が増加したが,Epac1 欠損型血管平滑筋細胞では有意に少ない結果であった. また,PDGF-BB または Epac の選択的刺激により Epac1 野生型血管平滑筋細胞のリン酸化コフィリン蛋白の発現は有意に低下したが, Epac1 欠損型血管平滑筋細胞ではリン酸化コフィリン蛋白の発現は変化しなかった.Epac1 野生型血管平滑筋細胞における PDGF-BB によるコフィリンの脱リン酸化をともなう葉状仮足を持つ細胞数の増加, およびリン酸化コフィリン蛋白の発現低下は,Rap1a の抑制により阻害された. 血管傷害モデルを用いた in vivo の結果は,Epac1 野生型マウスにおける 4 週間後の血管内膜肥厚形成は顕著であったが,Epac1 欠損型では血管内膜肥厚形成が抑制されており, 内膜肥厚組織の面積は Epac1 野生型マウスと比べて有意に小さかった. 骨髄キメラマウスの血管傷害後の血管内膜肥厚形成度には骨髄細胞より血管平滑筋細胞の関与が強いことを示唆する結果となった. ( 結論 ) 本研究により,Epac1 は PDGF-BB の刺激により, コフィリンの脱リン酸化を介して血管平滑筋細胞の遊走を促進し, その結果血管傷害後の内膜肥厚形成を促進することが示唆された.

5 ( キーワード ) 内膜肥厚, 血管平滑筋細胞,Epac ( 引用文献 ) Bornfeldt KE, Campbell JS, Koyama H, Argast GM, Leslie CC,Raines EW, Krebs EG, Ross R. (1997), The mitogen-activated protein kinase pathway can mediate growth inhibition and proliferation in smooth muscle cells. Dependence on the availability of downstream targets, The Journal of clinical investigation, 100, Bos JL. (2003), Epac: a new camp target and new avenues in camp research, Nature reviews Molecular cell biology, 4, Oser M, Condeelis J. (2009), The cofilin activity cycle in lamellipodia and invadopodia, Journal of cellular biochemistry, 108, Yokoyama U, Minamisawa S, Quan H, Akaike T, Jin M, Otsu K, Ulucan C, Wang X, Baljinnyam E, Takaoka M, Sata M, Ishikawa Y. (2008a), Epac1 is upregulated during neointima formation and promotes vascular smooth muscle cell migration, American journal of physiology Heart and circulatory physiology, 295, H

6 論文目録 Ⅰ 主論文 Epac1 Deficiency Attenuated Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointimal Formation Kato Y, Yokoyama U, Yanai C, Ishige R, Kurotaki D, Umemura M, Fujita T, Kubota T, Okumura S, Sata M, Tamura T, and Ishikawa Y., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 12, September 18, 2015 Ⅱ 参考論文 1 Inhibition of EP4 signaling attenuates aortic aneurysm formation. Yokoyama U, Ishiwata R, Jin MH, Kato Y, Suzuki O, Jin H, Ichikawa Y, Kumagaya S, Katayama Y, Fujita T, Okumura S, Sato M, Sugimoto Y, Aoki H, Suzuki S, Masuda M, Minamisawa S, and Ishikawa Y. PLoS One, 7(5), e36724, (Epub) doi: / May 3, Differential roles of Epac in regulating cell death in neuronal and myocardial cells Suzuki S, Yokoyama U, Abe T, Kiyonari H, Yamashita N, Kato Y, Kurotani R, Sato M, Okumura S, and Ishikawa Y. J Biol Chem. 285, 31, May 13, 2010

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名小川憲人論文審査担当者主査田中真二副査北川昌伸渡邉守論文題目 Clinical significance of platelet derived growth factor -C and -D in gastric cancer ( 論文内容の要旨 )

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名小川憲人論文審査担当者主査田中真二副査北川昌伸渡邉守論文題目 Clinical significance of platelet derived growth factor -C and -D in gastric cancer ( 論文内容の要旨 ) 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名小川憲人論文審査担当者主査田中真二副査北川昌伸渡邉守論文題目 Clinical significance of platelet derived growth factor -C and -D in gastric cancer ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > platelet derived growth factor (PDGF 血小板由来成長因子)-C,