学位論文の内容の要旨論文提出者氏名山本篤論文審査担当者主査清水重臣副査仁科博史金井正美論文題目 Fertilization-induced autophagy in mouse embryos is independent of mtorc1 ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > オート

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こごろうみねむら
5 years ago
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1 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名山本篤論文審査担当者主査清水重臣副査仁科博史金井正美論文題目 Fertilization-induced autophagy in mouse embryos is independent of mtorc1 ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > オートファジーは栄養不良時の栄養供給や細胞質の品質管理を担う進化的に保存された細胞質の分解経路である我々は未受精卵で抑制されているオートファジーが受精後速やかに誘導されることを以前に報告したこの時期に起こるオートファジーの役割は卵細胞質に蓄積した母性タンパク質を一度に大量に分解し卵性から胚性への移行を効率的に促進して同時に胚発生に必要なアミノ酸を得るためと考えられるしかし受精後のオートファジー誘導機構については不明である一方一般培養細胞ではオートファジーがアミノ酸インスリンその他成長因子などを上流制御因子として mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1) によって抑制的に制御される事が知られている本研究では受精誘導型のオートファジーに mtorc1 が果たす役割について解析を行った mtorc1 の基質のリン酸化状態を解析した結果第 2 減数分裂中期の卵母細胞 (MII 卵 ) では高く保たれた mtorc1 活性が受精後 3 時間以内に急激に低下することが明らかとなったしかし MII 卵や胚を mtorc1 阻害剤の Torin1 や PP242 で処理してもオートファジーは誘導できなかったまた胚を mtorc1 の活性化剤である cycloheximide(chx) で処理してもオートファジーを抑制できなかった一方 phosphatidylinositol 3 キナーゼ (PI3K) の阻害剤である wortmannin や LY はオートファジーを効果的に抑制する事が分かった以上の結果から mtorc1 の活性とオートファジーの誘導状況は他の種類の細胞と同様で逆相関していたが mtorc1 の抑制は受精誘導型オートファジーを誘導するには必要十分な条件ではないと考えられた今回の結果は受精の刺激により誘導されるオートファジーを介した細胞質のダイナミックな分解機構には初期胚固有の制御機構が備わっている事を示唆するものである < 緒言 > マクロオートファジー ( 以下オートファジー ) は細胞内成分をオートファゴソームと呼ばれる脂質 2 重膜で包み込みリソソームへと運ぶダイナミックな細胞内分解機構の一つであるオートファジーは飢餓細胞質内の品質管理病原体の除去など様々な生理機能において重要な働きを担っている以前に我々のグループは受精前は低く保たれているオートファジー活性が受精 - 1 -

2 後 4 時間以内に活性化される事を報告した更にオートファゴソーム形成に必須の遺伝子である Atg5 を卵特異的にノックアウトすると 4-8 細胞期で発生が停止しオートファジーはマウス胚の着床前初期発生に必須である事を明らかにした受精後のオートファジーの役割は着床前までに母性由来の細胞内タンパク質をアミノ酸レベルまで分解し胚発生に必要な材料を供給するためと考えられている mtorc1 はタンパク複合体でアミノ酸やインスリンその他の成長因子により活性化される mtorc1 は蛋白翻訳細胞の成長分化代謝などの様々な生理機能を p70 S6kinase(S6K) や eukaryotic translation initiation factor(eif)- 4E binding protein 1(4E-BP1) やオートファジー誘導制御の最上流に位置する unc-51-like kinase1(ulk1) 複合体その他の基質をリン酸化することにより制御しておりオートファジーに関しては mtorc1 は抑制的に機能している以前に我々は MII 卵では mtorc1 の活性は高いが受精に伴い低下することを報告したこの事実から受精に伴う mtorc1 の抑制がオートファジーを誘導したと考えられてきたが実際にはその関係性は不明であり今回我々は mtorc1 活性とオートファジー誘導の相関関係について研究を行った < 方法 > 8 から 12 週齢の C57BL/6(B6) 雌マウスを pregnant mare serum gonadotropin(pmsg) と hcg 投与下に過排卵させ卵管膨大部より卵を回収した回収した卵は B6 雄マウス精子を用いて体外受精を行ったまた一部はストロンチウムを含んだ培地下で単為発生させ 2 個の前核を認めたものを受精刺激のタイミングを同期させた胚として回収したオートファジーのモニター: オートファゴソーム膜上に局在する microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha(lc3) を green fluorescent protein(gfp) と融合させた GFP-LC3 トランスジェニック ( オートファジーモニター ) マウスの卵を上述の手法で回収し各薬剤投与下に培養しオートファジーの誘導状況について蛍光顕微鏡下に観察を行った Western Blot Analysis: 卵や胚のサンプルは 100 または 200 個の同数ずつを薬剤処理し Western blot 解析を行った mtorc1 の活性の指標として代表的な基質である S6K と 4E-BP1 のリン酸化状態をそれぞれの抗体を用いて解析した mtorc1 の活性化剤として cycloheximide(chx) を抑制剤として Torin1 と PP242 を用いた Class III PI3K の阻害剤として wortmannin と LY を用いた事前調査から薬剤濃度は一般的な培養細胞の 10 から 100 倍の濃さとし培養時間は 1 または 3 時間とした < 結果 > 1. 受精後のオートファジー誘導は mtorc1 の活性と逆相関関係にある胚の初期発生における mtorc1 の活性を理解するために mtorc1 の基質である S6K と 4E-BP1 のリン酸化状態を調べた受精前の MII 卵では S6K も 4E-BP1 も高度にリン酸化されていた ( 図 :1A) しかし受精後 3 時間目には S6K が顕著に脱リン酸化され 4E-BP1 も軽度に脱リン酸化されていたオートファジーのモニターマウス卵では受精後 3 時間目になるとわず - 2 -

3 かに GFP-LC3 のドットの形成が観察された ( 図 :1B) 受精後 6 時間目になると S6K も 4E-BP1 も明らかに脱リン酸化されオートファジーも高度に誘導されたこれらのタンパクは 2 細胞期胚の中期には再びリン酸化を受けオートファジーの誘導状況の低下を認めたこのように GFP-LC3 ドットの出現は S6K や 4E-BP1 の脱リン酸化と一致しておりきれいな逆相関状態にあった 2. Torin1 で mtorc1 活性を阻害しても卵や胚でオートファジーを起こせない上述の結果から mtorc1 が受精誘導型オートファジーを負に制御していることが考えられた為人工的に mtorc1 活性を抑制しオートファジーを誘導できるかを調べる実験を行った mtor の活性を ATP 競合性に阻害する作用を持つ Torin1 か PP242 で MII 卵を処理をすると S6K と 4E-BP1 は受精後 3 時間目の胚よりも高度に脱リン酸化された ( 図 :2A) しかし GFP-LC3 のドット形成は一切認めなかった ( 図 :2B) このように mtorc1 の阻害は MII 卵でオートファジーを誘導するには十分な条件でない事が分かった未受精卵では mtorc1 の抑制シグナルをマスクするような未知のオートファジー抑制因子が存在している可能性が考えられたので受精後の胚において Torin1 がオートファジー誘導を増強させられるか検討した受精刺激の開始時間を厳密にするために体外受精ではなく単為発生刺激を行い事前に Torin1 を処理した群と単為発生刺激後に処理した群について観察を行った S6K と 4E-BP1 は Torin1 依存性に脱リン酸化されていた ( 図 :2C b,c 列 ) しかしながら Torin1 を処理した胚ではむしろ GFP-LC3 のドットは小さくなっていた ( 図 :2D 2E) Torin1 をより高濃度長時間作用させてもオートファジー誘導への影響は現れなかった ( データ掲載なし ) これらの結果から mtorc1 の抑制は卵でも胚でもオートファジーを誘導する十分条件にあたらない事が分かった 3. CHX による mtorc1 の活性化は胚のオートファジーを抑制できない次に mtorc1 の再活性化で胚のオートファジーを抑制できるかについて検討した CHX はタンパク合成を阻害して様々な細胞内の反応系に影響を及ぼすが mtorc1 を効果的に活性化する受精 3 時間後の胚を CHX 存在下に 3 時間培養したところ S6K と 4E-BP1 は未受精卵の状態と同程度までリン酸化を受けていた ( 図 :3A) しかし GFP-LC3 のドット数の減少は認めなかった ( 図 :3B) これらの結果を総合すると mtorc1 の活性状態は受精誘導型オートファジーに関与しないと考えられた 4. PI3K は受精誘導型オートファジーに必須であるこれまでの結果から初期胚には固有のオートファジー誘導機構が存在している可能性が考えられた典型的なオートファジー誘導経路では mtorc1 の活性が低下するとその基質である ULK1 複合体が Beclin1 や Atg14L vacuolar protein-sorting(vps)15, Vps34 からなるオートファジー固有の class III PI3K を誘導する PI3K の活性化はオートファゴソームの形成に必須であるこれをふまえ初期胚においても PI3K の活性化が必要かどうか調査した受精 3 時間後の GFP-LC3 胚を PI3K 阻害剤である wortmannin と LY 存在下で 1 時間培養したすると GFP-LC3 のドットは完全に消失した ( 図 :4) 以上の結果から受精誘導型オートファジーは mtorc1 の活性には依存しないが PI3K は必要と考えられたまた PI3K 阻害剤の効果が極めて短時間であったことからオートファゴソー - 3 -

4 ムの合成消失速度は極めて早いと考えられ初期胚ではオートファジー活性が高いことを裏付けるものと考えられた < 考察 > 排卵後より高く保たれた mtorc1 の活性が受精直後の極めて短時間に低下し約 20 時間継続することが分かった受精後の mtorc1 の抑制機構は未だ解明されていないこの mtorc1 の抑制状況とオートファジーの活性化状態に相関性があるようにみえたものの mtorc1 を抑制したらオートファジーが誘導できたという直接の相関性を示すデータは得られなかった mtorc1 はオートファジー制御の中心的な役割を果たしているが mtorc1 に依存しない経路も提唱されているその一つが adenosine monophosphate-activated protein kinase(ampk) である AMPK は mtorc1 の上流因子である tuberous sclerosis complex 2 (TSC2) にも作用するが直接 ULK1 に作用しオートファジーを誘導するしかしながら AMPK の活性化剤である phenformin は MII 卵でオートファジーを誘導しなかった ( データ掲載なし ) 一方で ULK1 の下流因子である PI3K 複合体も Bcl-2 や JNK-1 inositol triphosphate 受容体等の mtorc1-ulk 活性を経由しない因子により制御されている受精誘導型オートファジーが PI3K 阻害剤により効果的に抑制されたことからオートファジー誘導制御のより下流では典型的な経路と共通の機構を利用している事を示したオートファジーには細胞質の品質管理を担うという役割もあり卵におけるオートファジー誘導メカニズムの解明は現代社会が直面する加齢に伴う不妊症例の治療法として新たな突破口となる可能性を秘めている < 結論 > 受精誘導型オートファジーと mtorc1 の活性の相関関係を調査した mtorc1 活性制御の薬剤下でもオートファジーの誘導抑制は出来ず受精後におこるオートファジーの制御は mtorc1 の活性に依存していない事が分かった - 4 -

5 論文審査の要旨および担当者報告番号甲第 4722 号山本篤論文審査担当者主査清水重臣副査仁科博史金井正美 ( 論文審査の要旨 ) 1. 論文内容本論文は受精後に卵で活性化されるオートファジーに mtorc1 が関与していないことを示した論文である 2. 論文審査 1) 研究目的の先駆性独創性オートファジーは受精後の胚発生に必要であることが知られているがどのようなメカニズムでオートファジーが誘導するかは解明されていないこのような背景の下申請者はオートファジーのマスターレギュレーターであるmTorc1の関与を詳細に解析しておりその着眼点は評価に値するものである 2) 社会的意義本研究で申請者が発見した主な結果は以下の通りである 1. 受精後に mtorc1の活性は一過性に低下し再活性化すること 2. mtorc1の阻害剤や活性化薬剤を投与しても受精卵のオートファジーの多寡は変動しないこと 3. 一方 PI3kinaseは受精卵のオートファジーを制御していること以上のように申請者は受精卵のオートファジーにはmTorc1は関与せず PI3kinaseが関与していることを明らかにしているこれは受精卵のバイオロジーを知る上で有用な研究成果である 3) 研究方法倫理観研究では受精卵のオートファジーにおけるmTorc1の関与を明らかにするために,mTorc1 制御化合物を使用しているが当該薬剤の投与時期を受精前受精後など様々に変化させることにより mtorc1の関与のないことを丁寧に検討している本研究は十分な分子生物学的知識と発生工学技術の裏付けのもとに遂行されており申請者の研究方法に対する知識と技術力が十分に高いことが示されると同時に本研究が極めて周到な準備の上に行われてきたことが窺われる 4) 考察今後の発展性申請者は本研究結果についてオートファジー誘導の原因としてもっとも蓋然性の高い mtorc1の関与が受精卵においてみられなかったことより受精卵のオートファジーは通常の ( 1 )

6 細胞で見られるオートファジーとは一線を画しているのではないかと考察しているこれは得られた結果を鑑みて極めて妥当な考察であるまた良質な卵の選別にオートファジー活性が応用できる可能性を考察しており臨床面からも意義ある研究である 3. 審査結果以上を踏まえ本論文は博士 ( 医学 ) の学位を申請するのに十分な価値があるものと認められた ( 2 )

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名小川憲人論文審査担当者主査田中真二副査北川昌伸渡邉守論文題目 Clinical significance of platelet derived growth factor -C and -D in gastric cancer ( 論文内容の要旨 )

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名小川憲人論文審査担当者主査田中真二副査北川昌伸渡邉守論文題目 Clinical significance of platelet derived growth factor -C and -D in gastric cancer ( 論文内容の要旨 ) 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名小川憲人論文審査担当者主査田中真二副査北川昌伸渡邉守論文題目 Clinical significance of platelet derived growth factor -C and -D in gastric cancer ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > platelet derived growth factor (PDGF 血小板由来成長因子)-C,

学位論文の内容の要旨 論文提出者氏名 山本篤 論文審査担当者 主査清水重臣副査仁科博史 金井正美 論文題目 Fertilization-induced autophagy in mouse embryos is independent of mtorc1 ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > オート

学位論文の内容の要旨論文提出者氏名山本篤論文審査担当者主査清水重臣副査仁科博史金井正美論文題目 Fertilization-induced autophagy in mouse embryos is independent of mtorc1 ( 論文内容の要旨 ) < 要旨 > オート