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まなままだ
5 years ago
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1 様式 C-19 科学研究費助成事業 ( 科学研究費補助金 ) 研究成果報告書平成 25 年 4 月 30 日現在機関番号 : 研究種目 : 基盤研究 (C) 研究期間 : 2010 ~ 2012 課題番号 : 研究課題名 ( 和文 ) 慢性脳低還流状態における内皮細胞血液脳関門障害の病態解明研究課題名 ( 英文 ) Impairment of neurovasculaer unit under chronic hypoperfusion 研究代表者矢田健一郎 (YATA KENICHIRO) 三重大学大学院医学系研究科産学官連携研究員研究者番号 : 研究成果の概要 ( 和文 ): 慢性脳低灌流下での内皮細胞血液脳関門障害のメカニズムを二光子レーザー顕微鏡を用いて観察を行った慢性脳灌流状態では深部毛細血管では leukocyte capillary plugging, 脳表の髄膜血管では leukocyte rolling and adhesion が認められた研究成果の概要 ( 英文 ):To understand the role of chronic cerebral hypoperfusion in cerebral small vessel disease, repeated longitudinal in vivo imaging was performed by using two-photon microscopy. Under chronic hypoperfuion, leukocyte plugging in deep capillary and leukocyte rolling and adhesion in pial vessel were detected., 交付決定額 ( 金額単位 : 円 ) 直接経費間接経費合計 2010 年度 1,300, ,000 1,690, 年度 1,100, ,000 1,430, 年度 1,100, ,000 1,430,000 年度年度総計 3,500,000 1,050,000 4,550,000 研究分野 : 医学科研費の分科細目 : 内科系臨床医学神経内科学キーワード : 神経分子病態学, small vessel disease, chronic cerebral hypoperfuion, Two-photon microscopy, capillary plugging, rolling and adhesion 1. 研究開始当初の背景脳小血管病 ( ラクナ梗塞深部白質病変 ) は脳血管性認知症脳血管性パーキンソニズムの大きな病因と考えられているがその詳細はほとんどわかっていない今後超高齢化社会を迎えるにあたりその症例数は激増することが予測されその病態を解明することは急務である 2. 研究の目的脳小血管病はその名のごとく病変の主座が脳の小血管 (lipohyalinosis, arteriolosclerosis and cerebral amyloid angiopathy) にありこの脳小血管障害に伴う慢性脳低灌流がその白質病変形成には大きな役割を担っていると考えられているしかしながらその詳細な病態に関してはほとんどわかっていないその慢性に経過する病態上その病態解明には長期にわたる観察が必要不可欠である今回の研究では二光子レーザー顕微鏡を用いた長期にわたり繰り返し観察可能な in vivo model を確立しこのモデルを用いて慢性脳低灌流状態における脳病態を解明することを目的とした

3. 研究の方法慢性脳低灌流モデル二光子レーザー顕微鏡下での観察の為 Green fluorescent protein transgenic mice [GFP-Tg mice; C57BL/6

慢性脳低灌流状態は両側の総頸動脈に外側から microcoil を装着させることにより作成した左頭頂葉に 4x4mm の開頭を行いカバーガラスとデンタルセメントを用いて windows

投与にて Plasma Labeling を行った脳血流評価二次元レーザー血流計にて慢性脳低灌流状態での血流低下を評価したまた二光子レーザー顕微鏡下で line scan を行うことにより

研究成果 1 ) 二光子レーザー顕微鏡を用いた長期 Follow model 今回作成したモデルでは脳表から 600μm 程度までの深度を約一カ月にわたり繰り返し観察可能であった A B C E

arteriole から capillary にかけて血管構造が詳細に観察されたまた Astrocyte と preicyte で構成される neuro-glia-vascular unit

程度の血流低下が観察期間中継続して認められた狭窄前 (E) と狭窄後 2 週間 (F) の二次元レーザードップラーイメージ F 脳血流変化深度 600 μm までの maximal

脳表から深部までにわたる microvasculature が鮮明に認められる SR101 plasma labeling : Red, astrocyte Pericyte:Green この

2 3. 研究の方法慢性脳低灌流モデル二光子レーザー顕微鏡下での観察の為 Green fluorescent protein transgenic mice [GFP-Tg mice; C57BL/6 TgN(b-act-EGFP)Osb] を使用このマウス脳では二光子下では血管内皮細胞周皮細胞星細胞白血球血小板などは蛍光陽性として観察可能その形態から個々の細胞の同定が可能である慢性脳低灌流状態は両側の総頸動脈に外側から microcoil を装着させることにより作成した左頭頂葉に 4x4mm の開頭を行いカバーガラスとデンタルセメントを用いて windows を作成したこの window を通し二光子レーザー顕微鏡を用いて長期間にわたる繰り返しの観察を行った慢性脳灌流前直後一週間後二週間後と一カ月にわたり繰り返しの観察を行った SR101 投与にて Plasma Labeling を行った脳血流評価二次元レーザー血流計にて慢性脳低灌流状態での血流低下を評価したまた二光子レーザー顕微鏡下で line scan を行うことにより動脈の in flow velocity と静脈の out flow velocity を測定した 4. 研究成果 1 ) 二光子レーザー顕微鏡を用いた長期 Follow model 今回作成したモデルでは脳表から 600μm 程度までの深度を約一カ月にわたり繰り返し観察可能であった A B C E D 脳表から深部までにわたる細動脈全体像 reconstruction image(d), 細動脈の深部分岐部での maximal intensity projection image(e) arteriole から capillary にかけて血管構造が詳細に観察されたまた Astrocyte と preicyte で構成される neuro-glia-vascular unit が詳細に観察された 2) 慢性脳低灌流状態における脳血流変化 Cranial window を通して脳血流の変化を二次元レーザードップラー血流計を用いて測定した両側頸動脈狭窄により 50% 程度の血流低下が観察期間中継続して認められた狭窄前 (E) と狭窄後 2 週間 (F) の二次元レーザードップラーイメージ F 脳血流変化深度 600 μm までの maximal intensity projection image(a) と 3D reconstruction image(b). 脳表から深部までにわたる microvasculature が鮮明に認められる SR101 plasma labeling : Red, astrocyte Pericyte:Green この microvasculature の中で細動脈を脳表から 600μm の深部まで連続観察することにより artery から capillary にかけての動脈の全体像を詳細に観察することが可能であったまた astrocyte と pericyte が形成する neuro-gila-vasculaer unit を詳細に観察することが可能であった Arbitrary units Mean blood Flow

3)inflow velocity と out flow velocity 二光子レーザー顕微鏡を用いて

%baseline Pial artery の in flow velocity は狭窄前または

vein) 狭窄前 (I) 狭窄 2 週間後 (J) の脳表の microvasculature image

穿通動脈の形態的変化 (elongation, meandering, tortuousness)

vein の out flow は狭窄前またはコントロールと比較して 60% 程度までの低下を認めた 4)

の変化慢性脳低灌流状態における穿通血管の形態変化 Capillary の退縮または血管新生 astrocyte

3 3)inflow velocity と out flow velocity 二光子レーザー顕微鏡を用いて流入動脈の Velocity と流出静脈の Velocity を測定した I J G H K L 狭窄前 (G) と狭窄 2 週間後 (H) の line scan image. 白線の傾きが velocity を示す In flow velocity (pial small artery) %baseline Pial artery の in flow velocity は狭窄前またはコントロールと比較して 45% 程度の低下を認めた Out flow velocity (pial small vein) 狭窄前 (I) 狭窄 2 週間後 (J) の脳表の microvasculature image 狭窄前 (K) 狭窄 2 週間後 (L) の穿通動脈の 3D 血管像 Capillary の退縮や新生穿通動脈の形態的変化 (elongation, meandering, tortuousness) などは慢性脳低灌流下での明らかな変化は認められなかった %baseline K L Pial small vein の out flow は狭窄前またはコントロールと比較して 60% 程度までの低下を認めた 4) 慢性脳低灌流状態における Neuro-glia vascular Unit の変化慢性脳低灌流状態における穿通血管の形態変化 Capillary の退縮または血管新生 astrocyte と pericyte の形態変化の経時的変化を観察した狭窄前 (K) 狭窄 2 週間後 (L) の astrocyte と pericyte の形態学的変化. ともに GFP 陽性の細胞として観察される慢性脳低灌流下では明らかな形態学的変化は認められなかった今回の研究では皮質から皮質深部にかけての経時的変化を観察した脳小血管病の脳実質の組織学的障害病変としては皮質下の深部白質病変が主と考えられておりこの為皮質には形態学的変化は認められなかったと考えられる

Capillary に著明な leukocyte の plugging が認められた 6 )

hemodynamics の経時的変化を観察した慢性脳低灌流状態では脳表の血管で白血球の rolling と

labeling された血漿の中に赤血球が蛍光陰性の球体として観察された慢性脳低灌流状態では

白血球はまた GFP 蛍光陽性として観察される (O 矢印 ) Plugging を起こした白血球は完全に

100 秒後の画像 ) 脳表の細動脈と細静脈画像狭窄前 (Q) 狭窄 2 週間後 (R) の画像白血球の

ではいずれの状態でも rolling と adhesion はほとんど認められなかった細静脈の

4 5) 慢性脳低灌流状態における capillary plugging. 慢性脳低灌流下における深部皮質の hemodynamics の経時的変化を観察した慢性脳低灌流下では Capillary に著明な leukocyte の plugging が認められた 6 ) 慢性脳低灌流状態における白血球の rolling と adhesion 慢性脳低灌流下における皮質血管の hemodynamics の経時的変化を観察した慢性脳低灌流状態では脳表の血管で白血球の rolling と adhesion が認められた M N Q R O P S T 正常な循環状態 (N) では plasma labeling された血漿の中に赤血球が蛍光陰性の球体として観察された慢性脳低灌流状態では Capillary に Plugging した白血球が観察された (M 矢印 ) Plugging を起こした白血球はまた GFP 蛍光陽性として観察される (O 矢印 ) Plugging を起こした白血球は完全に capillary を閉塞する訳ではなく少しずつ末梢に移動していく (P 矢印は O と同一の白血球の 100 秒後の画像 ) 脳表の細動脈と細静脈画像狭窄前 (Q) 狭窄 2 週間後 (R) の画像白血球の rolling と Adhesion が細静脈を中心に認められた群の手術前 (S) 手術後 2 週間 (T) ではいずれの状態でも rolling と adhesion はほとんど認められなかった細静脈の rolling と adhesion の頻度細動脈周囲の capillary plugging の頻度細静脈周囲の capillary plugging の頻度細動脈での rolling と adhesion の頻度

5 脳小血管病の病態として小血管病変に伴う慢性脳低灌流がその病態形成における重要な役割をはたしていると考えられている今回の研究では慢性脳低灌流状態では白血球の活性化が起こりこれが Capillary を閉塞することによりさらなる循環障害を起こしていることが認められた 5. 主な発表論文等 ( 研究代表者研究分担者及び連携研究者には下線 ) 雑誌論文 ( 計 2 件 ) 1)Niwa A, MatsuoK, Shindo A, Yata K, Tomimoto H. Clinical and neuropathological findings in a patient with familial Alzheimer disease showing a mutation in the PSEN1 gene. Neuropathology, 査読あり 2013;33: ) Dong YF, Kataoka K, Toyama K, Sueta D, Koibuchi N, Yamamoto E, Yata K, Tomimoto H, Ogawa H, Kim-Mitsuyama S.Attenuation of brain damage and cognitive impairment by direct renin inhibition in mice with chronic cerebral hypoperfusion. Hypertension. 査読有 2011;58: 学会発表 ( 計 3 件 ) 1) 矢田健一郎 2012 年 4 月 27 日福岡第 37 回日本脳卒中学会 2 光子励起レーザー顕微鏡を用いたマウス慢性脳低灌流状態における微小循環動態の評価 2) 矢田健一郎 2011 年 5 月 18 日名古屋第 52 回日本神経学会 2 光子励起レーザー顕微鏡を用いた頸動脈閉塞症の微小循環動態の real time 観察 3) 矢田健一郎 2011 年 3 月 25 日東京第 36 回日本脳卒中学会 2 光子励起レーザー顕微鏡を用いたマウス頚動脈狭窄性病変モデルにおける血行動態の評価 6. 研究組織 (1) 研究代表者矢田健一郎 (YATA KENICHIRO) 三重大学大学院医学系研究科産学官連携研究員研究者番号 : (2) 研究分担者冨本秀和 (TOMIMOTO HIDEKAZU) 三重大学大学院医学系研究科教授研究者番号 :

研究成果報告書

様式 C-19 科学研究費助成事業 ( 科学研究費補助金 ) 研究成果報告書平成 25 年 6 月 7 日現在機関番号 :32651 研究種目 : 若手研究 (B) 研究期間 :2010~2012 課題番号 :22791634 研究課題名 ( 和文 ) 中耳粘膜の血流動態が中耳腔全圧に及ぼす影響に関しての研究研究課題名 ( 英文 ) A study of the effect of blood